1.4.3  大鼠灌胃后行为学观察、结肠黏膜组织病理学评分及疾病活动指数评分  在诱导大鼠溃疡性结肠炎过程中，每日观察大鼠精神状况、活动量、饮食饮水量、毛色状况、鼠粪便评分并计算疾病活动指数分值。大鼠结肠组织损伤大体形态学评分标准^[17]，见表1；疾病活动指数评分标准^[18]，见表2。

1.4.3  大鼠灌胃后行为学观察、结肠黏膜组织病理学评分及疾病活动指数评分  在诱导大鼠溃疡性结肠炎过程中，每日观察大鼠精神状况、活动量、饮食饮水量、毛色状况、鼠粪便评分并计算疾病活动指数分值。大鼠结肠组织损伤大体形态学评分标准^[17]，见表1；疾病活动指数评分标准^[18]，见表2。

2.2  藏红花素对溃疡性结肠炎大鼠行为学的影响  与正常组比较，模型组于饮用葡聚糖硫酸钠后3 d出现活动量减少，不喜进食，聚成一团，萎靡态，粪便有潜血，肛周黏性物增多且污浊，毛发颜色暗沉；5 d后出现肉眼血便、稀便。大鼠体质量均在第1天有所减轻，但第2天开始体质量增加，各组间无明显差异。藏红花素组及阳性对照组大鼠行为对比模型组，大鼠状态、体质量减轻及腹泻便血症程度较轻。与模型组相比，正常组结肠组织评分及疾病活动指数评分降低(P < 0.05)，藏红花素各组及阳性对照组与模型组相比结肠组织评分及疾病活动指数评分降低(P < 0.05)。藏红花素高剂量组与阳性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。见表3。

光学显微镜下观：与正常组比较模型组结肠黏膜组织腺体萎缩、排列不规则，以中性粒炎细胞浸润为主，可见溃疡。阳性对照组及藏红花素组结肠黏膜组织腺体结构可见，排列较模型组整齐，炎性细胞浸润较模型组减少，未见明显溃疡。见图1。

2.4  藏红花素对结肠组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素23蛋白免疫反应的影响  免疫组织化学染色显示，结肠组织肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白免疫反应呈胞浆内棕黄色颗粒。与模型组比较正常组肿瘤坏死因子α和白细胞介素23蛋白免疫反应减少(P < 0.05)。藏红花素各组及阳性对照组与模型组相比，肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白免疫反应减少(P < 0.05)。藏红花素高剂量组与阳性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见图2，3，表4。

2.4  藏红花素对结肠组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素23蛋白免疫反应的影响  免疫组织化学染色显示，结肠组织肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白免疫反应呈胞浆内棕黄色颗粒。与模型组比较正常组肿瘤坏死因子α和白细胞介素23蛋白免疫反应减少(P < 0.05)。藏红花素各组及阳性对照组与模型组相比，肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白免疫反应减少(P < 0.05)。藏红花素高剂量组与阳性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见图2，3，表4。

2.4  藏红花素对结肠组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素23蛋白免疫反应的影响  免疫组织化学染色显示，结肠组织肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白免疫反应呈胞浆内棕黄色颗粒。与模型组比较正常组肿瘤坏死因子α和白细胞介素23蛋白免疫反应减少(P < 0.05)。藏红花素各组及阳性对照组与模型组相比，肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白免疫反应减少(P < 0.05)。藏红花素高剂量组与阳性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见图2，3，表4。

2.5  藏红花素对各组大鼠结肠组织中氧化应激指标水平的影响  与模型组比较，藏红花素各组及阳性对照组丙二醛含量减少，髓过氧化物酶活性减少，超氧化物歧化酶活性增加(P < 0.05)，藏红花素高剂量组与阳性对照组比较无差异性意义(P > 0.05)。见表5。

2.6  藏红花素对结肠组织Bax，Bcl-2，Caspase-3，Toll样受体4及MyD88蛋白表达的影响  与模型组比较，正常组Bax、Caspase-3、Toll样受体4及MyD88蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增加(P < 0.05)。藏红花素各组及阳性对照组与模型组相比，Bax，Caspase-3，Toll样受体4及MyD88蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增加(P < 0.05)。藏红花素高剂量组与阳性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见图4A-E。

溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种^[1]，其病因尚不明确，目前认为是一种多因素引起的疾病，如遗传变异、免疫反应失衡^[2]、环境影响及肠道微生物平衡紊乱等^[3]，表现为腹痛、腹泻及血便^[4]，流行病学调查，溃疡性结肠炎患病率呈上升趋势，每千人中有1至2人受到溃疡性结肠炎的影响^[5]。年龄分布分析表明，在60岁以上的老年人中诊断出溃疡性结肠炎病例为10%-20%。有研究表明溃疡性结肠炎中的氧化应激与炎症反应可引起的结肠黏膜组织损伤和细胞凋亡^[6]，Toll样受体4/MyD88通路在组织损伤时被激 活^[7]，诱导细胞炎症因子释放^[8]，引起结肠的多重损伤^[9]。目前临床上的治疗以氨基水杨酸酯、皮质类固醇和免疫调节剂为主，但因其治疗费用及药物不良反应，对于长期治疗的效果评价一般^[10]，传统中医中药治疗，如白藜芦醇、表没食子及儿茶素没食子酸酯及姜黄素等，对溃疡性结肠炎治疗有一定的作用^[11]。

藏红花素是提取自番红花的单糖基或二糖基多烯酯，属于水溶性类胡萝卜素化合物。已经有研究证明，藏红花素具有抗氧化应激、抗凋亡及抗炎症作用^[12]，对缺血性疾病、自生免疫疾病、心血管病变有一定的保护作用。

在各种化学诱导的结肠炎模型中，葡聚糖硫酸钠诱导的大鼠结肠炎模型具有简单性和与人的溃疡性结肠炎相似性^[13]，葡聚糖硫酸钠是一种水溶性并带负电荷的硫酸化多糖，可以让大鼠自由饮用，一定的浓度可以引起大鼠结肠上皮层细胞受损，引起炎性物质入侵出现结肠炎症反应^[14]。藏红花素对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎 与Toll样受体4/MyD88通路的作用尚不明确，因此在实验中，通过葡聚糖硫酸钠构建大鼠溃疡性结肠炎模型，观察藏红花素对大鼠结肠的保护作用，并进一步研究对Toll样受体4/MyD88通路的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2019年9月于徐州医科大学附属医院消化病研究中心完成。

1.3  材料  健康Sprague-Dawley雄性大鼠30只，鼠龄6-8周，体质量190-210 g，由徐州医科大学动物实验中心提供，SYXK(苏)2002-2038，所有大鼠饲养在室温25 ℃，湿度约50%的环境中，模拟12 h光照、12 h黑暗的条件，所有大鼠均自由进食饮水。实验于2019年3月通过徐州医科大学实验动物伦理道德委员会审批。

1.4  实验方法

1.4.1  分组、建模及干预  大鼠30只，采用数字随机法分5组(n=6)，正常组，模型组，藏红花素低剂量组，藏红花素高剂量组，阳性对照组。大鼠适应性喂养48 h，造模前禁食   12 h，正常组大鼠常规饲养7 d，其他组大鼠连续7 d灌胃体积分数5%葡聚糖硫酸钠(大连美仑生物技术有限公司)水溶液，诱导产生溃疡性结肠炎^[14]，干预第8天正常组与模型组改用蒸馏水继续喂养，在造模第一天开始，阳性对照组每天给予柳氮磺嘧啶0.4 g/kg灌胃^[15]，藏红花素低、高剂量组分别每天给予0.05，0.1 g/kg藏红花素(美国Sigma公司)灌胃^[16]，所用溶剂均使用生理盐水稀释。

灌胃时用大鼠灌胃针从右侧口角沿上颚向内推进至大鼠口腔，此时针头已经沿咽后壁插入食管，使用针管注入药物。

1.4.2  标本采集  所有大鼠在造模第8天麻醉后取大鼠距离肛门8 cm以上至阑尾的结肠，去除肠系膜，PBS洗涤，观察不同组的结肠形态，部分标本于体积分数4%甲醛中固定，用于石蜡切片，分别行苏木精-伊红染色镜下观察结肠病理改变和免疫组织化学法测定肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白表达；部分保存于-80 ℃冰箱中，进行匀浆离心后分别测定髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛和Western blot法测定Bax、Bcl-2、Caspase-3、Toll样受体4和MyD88蛋白的表达。

1.4.3  大鼠灌胃后行为学观察、结肠黏膜组织病理学评分及疾病活动指数评分  在诱导大鼠溃疡性结肠炎过程中，每日观察大鼠精神状况、活动量、饮食饮水量、毛色状况、鼠粪便评分并计算疾病活动指数分值。大鼠结肠组织损伤大体形态学评分标准^[17]，见表1；疾病活动指数评分标准^[18]，见表2。

1.4.4  苏木精-伊红染色法观察溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜病理学变化  干预1周后，将结肠组织浸入在40 g/L多聚甲醛中固定．石蜡包埋，切5 μm薄切片，脱蜡后梯度乙醇脱水，苏木精-染色后体积分数1%盐酸-乙醇中进行分化，返蓝，伊红染色，梯度乙醇脱水二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜(日本Olympus公司)下观察结肠组织病理形态变化^[19]。

1.4.5  大鼠结肠组织氧化应激指标水平测定  干预1周后，将各组肠组织从-80 ℃冰箱中取出，称取100 mg放入冰盒内，用冷生理盐水将组织制成10%的组织匀浆，然后取出1/4稀释成体积分数1%的组织匀浆，于4 ℃离心机中以14 000 r/min，离心15 min，取上清，按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书所描述的方法：测定丙二醛(μmol/g)含量、髓过氧化物酶(U/g)及超氧化物歧化酶活性(U/mg)活性。

1.4.6  免疫组织化学染色测定溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中肿瘤坏死因子α及白细胞介素23蛋白表达情况  干预1周后，使用抗原抗体特异性结合的原理，采用PV-9001二步法(北京中杉金桥生物技术有限公司)，大鼠结肠石蜡切片脱蜡，柠檬酸盐水浴煮沸抗原修复，室温阻断内源性过氧化物酶，PBS洗后加入肿瘤坏死因子α(1∶400)、白细胞介素23(1∶400；北京博奥森生物技术有限公司)一抗4 ℃孵育24 h，加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色5-10 min，苏木精染色对比，梯度乙醇脱水二甲苯透明，中性树胶封固，采用Image-pro J软件测定目标蛋白的吸光度值，以棕黄色为蛋白阳性表达信号，检测相对吸光度值。

1.4.7  Western blot检测大鼠结肠组织相关蛋白的表达  干预1周后，将裂解溶液加入结肠组织中以提取总蛋白，其用BCA蛋白质定量试剂盒定量。通过8%-12%的SDS-PAGE分离等量的总蛋白质并转移到PVDF膜上^[20]。用5%脱脂乳封闭1 h后，将PVDF膜(上海碧云天生物技术有限公司)与相应的单克隆抗体作为一抗：武汉爱博泰克生物科技有限公司的Bax、Bcl-2、Caspase-3抗体(1∶500)、上海碧云天生物技术有限公司的Toll样受体4(1∶1 000)、MyD88(1∶500)和β-actin抗体(1∶1 000)，孵育并在4 ℃过夜。然后加入HRP标记的抗兔IgG或抗小鼠IgG     (1∶2 000)，并将PVDF膜再室温孵育1 h。使用增强的化学发光ECL试剂在凝胶成像仪下使蛋白质条带可视化显影、拍照。β-actin用作标准化的内部参考。使用Image J软件进行目的条带的灰度值分析，与内参蛋白比较后行定量分析目标蛋白表达比例。

1.5  主要观察指标  ①结肠组织评分及疾病活动指数评分；②苏木精-伊红染色镜下观察结肠病理改变；③免疫组织化学法测定肿瘤坏死因子α和白细胞介素23蛋白表达表达；④氧化应激指标水平；⑤Western blot法测定Bax、Bcl-2、Caspase-3、Toll样受体4及MyD88蛋白的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0统计软件用于实验数据的分析，计量资料以x(_)±s表示，数据符合正态分布及方差齐性，多组间的数据比较使用单因素方差分析，事后检验使用LSD多重比较统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

溃疡性结肠炎的组织中炎症通路激活后的炎症因子释放与炎症反应对组织损伤起到重要作用^[1]。而肿瘤坏死因子α和白细胞介素23是具有促进炎症作用的细胞因子^[5]，白细胞介素23可以激活结肠组织的固有层细胞的免疫炎症反应而损伤组织，肿瘤坏死因子α对白细胞介素23的激活作用起到增强促进作用，进一步增强组织细胞炎症的损伤^[21]。再者肿瘤坏死因子α和白细胞介素23可以促进中粒细胞活化，产生浸润作用^[22]，加重结肠组织的炎症^[23]。实验使用藏红花素喂养的大鼠炎症因子释放减少，髓过氧化物酶活性降低，说明藏红花素对溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应有减轻作用并减少炎症因子的释放。Toll样受体4可以识别MyD88并激活下游通路，最终活化核转录因子κB转录因 子^[24]，促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素23等炎症因子表达，使得机体产生炎症反应^[25]。实验显示模型组的Toll样受体4、MyD88、肿瘤坏死因子α和白细胞介素23等蛋白高表达，而藏红花素组的表达下调，说明藏红花素参与下调Toll样受体4/MyD88通路的作用，减轻炎症反应。

氧化应激加重溃疡性结肠炎组织损伤，表现为过氧化物对组织细胞的功能结构的损伤^[26]。丙二醛为脂质过氧化物的产物，其含量与氧化应激程度有关^[10]。而超氧化物歧化酶具有抗氧化作用，可以催化过氧化物为氧化物^[27]，减轻过氧化对组织细胞的损伤，如H₂O₂催化为H₂O、减少脂质过氧化和清除自由基^[28]。该实验中，藏红花素组的大鼠结肠组织中丙二醛较模型组明显减少，超氧化物歧化酶活性增加，显示其通过抗氧化应激保护结肠组织。

Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达与溃疡性结肠炎的细胞组织凋亡相关，Bcl-2/Bax在结肠组织细胞中的蛋白表达比例可显示凋亡程度^[29]。Caspase蛋白家族是细胞组织在程序性凋亡的一种蛋白酶，Caspase-3是该过程中关键的蛋白酶^[30]，激活后引起细胞皱缩、细胞核碎裂、凋亡小体形成，最终导致溃疡性结肠炎的组织细胞凋亡。实验中的Western blot结果显示在模型组，引起组织细胞凋亡的Bax和Caspase-3蛋白高表达，抑制凋亡蛋白Bcl-2低表达，而藏红花素组溃疡性结肠炎组织的凋亡减轻，说明藏红花素可以通过下调Bax和Caspase-3蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白的表达来抑制结肠组织细胞的凋亡，保护结肠组织的结构和功能。

总之，该实验研究结果显示，藏红花素对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎大鼠有一定的治疗作用，其作用机制可能为抑制结肠组织的氧化应激、减少细胞凋亡，抑制Toll样受体4/MyD88信号通路的激活，减少肿瘤坏死因子α和白细胞介素23炎症细胞因子释放，减轻溃疡性结肠炎的炎症损伤，保护结肠组织、促进结肠组织功能恢复。藏红花素对溃疡性结肠炎的保护作用可能存在不同的机制，实验仅对部分作用进行探究，且局限于实验阶段，需继续更深入的研究证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

溃疡性结肠炎：一种非特异性结直肠炎性病变，病变部位多位于乙状结肠和直肠，可蔓延至降结肠，甚至整个结肠，病变多局限于黏膜和黏膜下层，以血性腹泻为常见症状，病情反复，病程漫长。

藏红花素：是提取自番红花的单糖基或二糖基多烯酯，属于水溶性类胡萝卜素化合物。

溃疡性结肠炎的临床治疗方法以水杨酸类、激素类、免疫抑制剂为主，其效果可见，但是药物的不良反应也不容忽视。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#