超临界二氧化碳萃取的猪松质骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2218

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (10): 1508-1514.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2218

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超临界二氧化碳萃取的猪松质骨

罗旭江^1，2，鲜海¹，彭礼庆^1，2，沈师^1，2，张彬^1，2，高超²，王振勇²，眭翔²，黄靖香²，韩刚²，刘舒云²，郭全义²，鲁晓波¹

¹西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000；²中国人民解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2019-05-23 修回日期:2019-05-28 接受日期:2019-07-05 出版日期:2020-04-08 发布日期:2020-02-14
通讯作者: 鲁晓波，教授，主任医师，西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000 郭全义，教授，主任医师，中国人民解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853
作者简介:罗旭江，男，1990年生，四川省达州市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事骨组织工程方向的研究。
基金资助:
国家重点研究与发展计划(2017YFC1104100)

Extraction of porcine cancellous bone by supercritical carbon dioxide

Luo Xujiang^{1, 2}, Xian Hai¹, Peng Liqing^{1, 2}, Shen Shi^{1, 2}, Zhang Bin^{1, 2}, Gao Chao², Wang Zhenyong², Sui Xiang², Huang Jingxiang², Han Gang², Liu Shuyun², Guo Quanyi², Lu Xiaobo¹

¹Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China

Received:2019-05-23 Revised:2019-05-28 Accepted:2019-07-05 Online:2020-04-08 Published:2020-02-14
Contact: Lu Xiaobo, Professor, Chief physician, Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China Guo Quanyi, Professor, Chief physician, Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Luo Xujiang, Master candidate, Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Key Research and Development Program of China, No. 2017YFC1104100

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
超临界二氧化碳：任何一种物质都存在3种相态，即气相、液相、固相，其中液、气两相相界面消失的点叫超临界点。二氧化碳(CO₂)因性质稳定、无毒，临界点容易达到而被广泛应用。
松质骨：主要分布于长骨的两端、短骨、扁骨及不规则骨的内部，由骨小梁互相交织构成，其骨密度低于皮质骨，富有弹性，松质骨结构有助于维持骨骼形态，抵抗压力。松质骨高度多孔，可以促进气体交换、营养和代谢废物扩散，能够引导自体干细胞爬行进入缺损区域，加快血管长入，促进骨重建。

背景：近年来国外使用超临界流体进行生物材料处理的研究较多，但是超临界流体应用于骨组织清洗的研究少见，国内相关报道更少。

目的：评估超临界二氧化碳萃取技术处理猪股骨松质骨的有效性及对骨生物学性能的影响。

方法：分别制备超临界二氧化碳萃取前(对照组)及萃取后猪股骨骨块(实验组)，检测两组骨密度、微观结构、最大抗压强度、弹性模量、骨组织组成成分、胶原含量与组织学分析。将骨髓间充质干细胞分别接种于两组骨块上，培养1 d后，扫描电镜观察材料骨小梁微孔结构及骨材料-细胞复合物中细胞黏附及生长情况。将两组骨块分别植入SD大鼠皮下，术后1，2，4周组织学观察皮下包埋炎症反应。动物实验方案已经解放军总医院伦理委员会批准。

结果与结论：①两组材料孔径大小、骨密度、最大抗压强度、弹性模量、胶原含量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；②扫描电镜显示，对照组材料孔隙连通欠佳，有软组织残留；实验组材料孔隙相互连通、结构完整；③傅里叶红外光谱及X射线衍射分析显示，两组骨组织材料具有相似的吸收峰及衍射峰，热重分析显示超临界二氧化碳萃取可减少骨组织水分含量；④苏木精-伊红染色显示实验组骨无软组织残留，骨陷凹内细胞残留明显减少，对照组有软组织及细胞残留；天狼星红及改良Masson染色显示实验组骨胶原结构完整，胞质成分减少，对照组胞质成分残留明显；⑤扫描电镜显示，对照组骨无明显细胞黏附，实验组骨可见明显细胞黏附生长；⑥实验组骨组织植入皮下的血管周围炎症反应明显轻于对照组骨组织；⑦结果表明，超临界二氧化碳萃取技术是一种有效、环保的骨组织处理技术，在不影响其胶原结构及含量、力学性能的基础上，能够有效去除猪股骨松质骨细胞及软组织，保留骨孔隙结构完整，增加细胞黏附及生长，有效减低炎性排斥反应。

ORCID: 0000-0003-4451-4815(罗旭江)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 超临界二氧化碳, 同种异体骨, 猪松质骨, 骨缺损, 骨生物材料, 清洗, 脱脂, 脱细胞

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, there have been many studies on the use of supercritical fluids for biological material treatment in countries outside China. However, little is reported on application of supercritical fluids to bone tissue extraction, in particular in China.

OBJECTIVE: To evaluate the effectiveness of supercritical carbon dioxide extraction technology in the treatment of porcine femur cancellous bone and its effect on bone biological properties.

METHODS: Porcine femoral bone blocks that were subjected to supercritical carbon dioxide extraction (study group) or not (control group) were prepared to determine bone mineral density, microstructure, maximum compressive strength, elastic modulus, bone tissue composition, collagen content and perform histological analysis. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were inoculated into two groups of bone blocks, and cultured for 1 day. The microporous structure of trabecular bone and cell adhesion and growth in bone material-cell composite were observed by scanning electron microscopy. The two groups of bone blocks were implanted subcutaneously in SD rats. The inflammatory reaction of subcutaneous tissue was observed histologically at 1, 2 and 4 weeks after surgery. The experimental protocol had been approved by the Animal Ethics Committee of Chinese PLA General Hospital, China.

RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in pore size, bone mineral density, maximum compressive strength, elastic modulus and collagen content between the study and control groups (P > 0.05). Scanning electron microscopy showed that in the control group, the material pores had poor connectivity and there was soft tissue residue; in the study group, material pores were connected to each other and the structure was intact. Fourier transform infrared spectroscopy and X-ray diffraction analysis showed that the two groups of bone tissue materials had similar absorption and diffraction peaks. Thermogravimetric analysis showed that supercritical carbon dioxide extraction could reduce water content in bone tissue. Hematoxylin-eosin staining showed that there were no soft tissue residues in the bone, and the cell residues in the bone pit were significantly reduced in the study group, while soft tissue and cell residues were observed in the control group. Sirius red staining and modified Masson staining showed that the structure of bone collagen in the study group was intact, the cytoplasmic components reduced, and the cytoplasmic components in the control group remained significantly. Scanning electron microscopy showed that there was no obvious cell adhesion in the control group, but cell adhesion growth was obvious in the study group. Perivascular inflammatory response in the bone tissue implantation region was obviously weaker in the study group than in the study group. These results suggest that supercritical carbon dioxide extraction technology is an effective and environment-friendly bone tissue processing technology. It can effectively remove porcine cancellous bone cells and soft tissue without affecting its collagen structure and content and mechanical properties, retaining intact bone pore structure, increasing cell adhesion and growth, and effectively reducing inflammatory rejection.

Key words: supercritical carbon dioxide, allogeneic bone, porcine cancellous bone, bone defect, bone biomaterial, extraction, degreasing, decellularization

中图分类号:

罗旭江, 鲜海, 彭礼庆, 沈师, 张彬, 高超, 王振勇, 眭翔, 黄靖香, 韩刚, 刘舒云, 郭全义, 鲁晓波. 超临界二氧化碳萃取的猪松质骨[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(10): 1508-1514.

Luo Xujiang, Xian Hai, Peng Liqing, Shen Shi, Zhang Bin, Gao Chao, Wang Zhenyong, Sui Xiang, Huang Jingxiang, Han Gang, Liu Shuyun, Guo Quanyi, Lu Xiaobo. Extraction of porcine cancellous bone by supercritical carbon dioxide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(10): 1508-1514.

图/表（结果） 12

2.1 扫描电镜观察超临界二氧化碳萃取前，松质骨骨孔隙连通欠佳，有部分软组织残留；超临界二氧化碳萃取的松质骨骨小梁结构完整、孔隙相互连通，无软组织残留，见图2。

2.2 骨密度、孔径直径测定超临界二氧化碳萃取前后的松质骨骨密度、骨孔直径比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1，说明超临界二氧化碳清洗技术处理后未见明显骨组织的孔隙破坏，骨密度无降低。

2.3 生物力学检测超临界二氧化碳萃取前后骨组织材料极限抗压强度及弹性模量无差异(P > 0.05)，见表2，超临界二氧化碳骨清洗技术未导致骨材料的力学性能降低。

2.4 傅里叶光谱分析图3显示了超临界二氧化碳萃取前后样品的傅里叶光谱，两种样品都表现出相似的特征峰；图中3 475 cm^-1的宽带为水分子的吸收峰^[15]，超临界二氧化碳萃取前样品中水吸收峰明显高于超临界二氧化碳萃取后样品；所有样品显示磷灰石特征谱带：在3 571.9 cm^-1和632 cm^-1处的峰与磷灰石的OH拉伸和弯曲震动有关^[16]，在1 028-1 100 cm^-1(P-O伸展)，960 cm^-1(P-O伸展)， 603 cm^-1(P-O伸展)，564 cm^-1(P-O拉伸和P-O弯曲)处属于磷灰石P-O峰^[17]；1 630-1 660 cm^-1处的条带与有机组织有关^[17]；1400-1550 cm^-1的处的峰应由碳酸盐基团引起^[18]；超临界二氧化碳萃取后样品骨组织磷灰石OH拉伸峰增加，碳酸盐基团吸收峰增强，这可能是超临界二氧化碳萃取引起的化学改变。实验观察到超临界二氧化碳萃取后样品水分子的吸收峰减弱，提示超临界二氧化碳萃取技术能够起到表面干燥的作用，其余区别有限。

2.5 X射线衍射分析图4A为骨块X射线衍射，显示了多孔骨结构的衍射图像；图4B为骨组织粉末的X射线衍射。超临界二氧化碳萃取前后，样品X射线均表现出相似的衍射图像。骨组织粉末较骨块衍射峰峰明显减弱，归因于骨组织多孔结构的丧失，多孔骨结构的强衍射峰覆盖了骨组分的衍射峰。骨组织粉末均表现为典型的羟基磷灰石波峰，2θ=25.8°，28.1°，29°，31.8°，32.9°，39.6°，46.7°，49.5°，53.2°^[17]。超临界二氧化碳萃取前后的骨组织粉末具有几乎一致的峰宽，提示超临界二氧化碳萃取处理骨组织未破坏骨微晶尺寸。但是超临界二氧化碳萃取骨组织的磷灰石峰强度或结晶度稍减弱，主要归因于磷灰石晶体的改变，部分原因可能是结晶度减弱。

2.6 热重分析图5分析从室温加热到800 ℃的热重曲线。第1阶段从60 ℃到250 ℃的快速减重代表大部分松散结合的水从样品表面除去；第2阶段250-450℃的快速减重，表明有机组分，如胶原纤维的燃烧，以及一些强结晶水的释放^[17]；第3阶段在450-800 ℃质量损失非常缓慢，此阶段的质量损失应该是晶体碳酸盐的挥发和可能的晶格水的释放。两组热重曲线趋势看起来很相似，但每个阶段的重量减低略有不同。对于未经超临界二氧化碳萃取处理骨，第1阶段的质量减轻为11%，第2阶段为16%，第3阶段为6%。超临界二氧化碳萃取处理骨，第1阶段的质量减轻为7%，第2阶段为17%，第3阶段为6%。实验提示超临界二氧化碳萃取技术可减轻骨组织含水量，对有机物及羟基磷灰石晶体含量无明显影响。

2.7 胶原含量测定骨组织无机成分约占2/3，有机成分占1/3，胶原占有机物90%，羟脯氨酸是机体胶原蛋白重要成分之一，非胶原蛋白含量极少，检测羟脯氨酸可定量反映组织胶原含量情况。超临界二氧化碳萃取前骨和超临界二氧化碳萃取萃取骨羟脯氨酸含量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

2.8 组织切片分析骨组织材料切片苏木精-伊红染色显示，松质骨呈现疏松多孔，新鲜骨组织孔隙内可见大量软组织及细胞，超临界清洗前骨块有部分软组织及细胞残留，超临界二氧化碳萃取后骨孔隙内未见明显软组织残留，骨陷凹内细胞明显减少，见图7。

新鲜骨组织、超临界二氧化碳萃取前后骨组织天狼星红染色均可见骨小梁结构完整，有大量很强双折光性呈橙黄色或红色的排列紧密的Ⅰ型胶原纤维，3组材料未见明显区别，见图8。改良Masson染色可见新鲜骨组织呈大面积红染，超临界二氧化碳萃取前骨组织材料骨小梁周围部分网状红染，超临界二氧化碳萃取后骨组织呈红蓝色相间，骨小梁周围被呈蓝染物质包绕，见图9。

2.9 骨组织材料-细胞复合物扫描电镜观察骨组织材料-细胞复合物扫描电镜观察，超临界二氧化碳萃取前骨孔径内有较多软组织残留，未观察到明显细胞黏附；超临界二氧化碳萃取骨组织材料表面呈条纹状，可见明显细胞黏附生长，见图10。

2.10 大鼠皮下植入实验结果大鼠皮下植入实验苏木精-伊红染色显示，在1周时有大量细胞密集浸润在骨组织周围血管，术后2周细胞数量减少，术后4周骨组织材料周围血管炎症细胞浸润明显减少；超临界二氧化碳萃取前骨组织材料植入皮下后细胞积聚明显，尤其在1，2周可见血管周围有明显炎症细胞浸润；超临界二氧化碳萃取后骨块皮下植入炎症细胞较少，第4周两组骨组织材料炎症细胞均明显减少，超临界二氧化碳萃取后骨块周围已无明显炎症细胞浸润，见图11。

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引言

创伤、感染、肿瘤等病因导致的骨缺损日益增多，据不完全统计，中国每年有超过300万骨缺损患者，骨缺损的修复和治疗是临床难题之一。近年来随着组织工程技术的快速发展，骨组织工程受到越来越多骨科医师重视。临床上应用的工程骨种类较多，主要有：①高分子材料：包括生物高分子材料与合成高分子材料，生物高分子材料如藻酸盐^[1]、胶原蛋白^[2]、动物明胶等，合成高分子材料如聚乙烯醇、聚乙醇酸交酯等；②生物陶瓷^[3]：如羟基磷灰石、磷酸三钙等；③经加工的生物衍生骨：如自体骨^[4]、同种异体骨、异种骨。生物高分子材料具有良好的生物活性，但存在力学强度差、降解速率快等不足，生物力学的降低及移植物降解速率与成骨速率的不匹配将影响植骨效果；合成高分子材料降解产物可引起局部排异^[5]；生物陶瓷脆性大、易碎，仅用于非承重区骨缺损的修复。目前临床上骨缺损患者的手术金标准是自体骨移植^[6]，但自体骨移植存在取骨量有限、二次手术创伤等问题，易出现术后疼痛、出血等并发症^[7]。

经加工的生物衍生骨具有来源广泛、生物力学特性和结构与自体骨相似等特点，是目前可用于替代自体骨的良好的骨缺损修复材料^[8]。但经加工的生物衍生骨如同种异体骨，仍面临着免疫排斥反应、传播疾病的困扰^[9]。在传统的处理方法中，一般使用有机溶剂(氯仿或丙酮)浸泡去除软组织，但由于化学试剂在骨的孔隙中扩散较差，深部骨组织清洗效果欠佳，同时使用有机溶剂也会导致有毒物质残留。此外，有机溶剂清洗过程可能导致骨组织原有的骨诱导活性及其生物力学性能下降。目前使用较多的深低温冷冻和冻干技术可消除活细胞、降低免疫原性。但随着对深低温冷冻和冻干骨的深入研究，不少学者发现深低温冷冻骨和冻干骨并不能完全满足临床的需求^[10]。这让不少学者再次将目光投向生物衍生骨的处理技术。

近年来，国外使用超临界流体进行生物材料处理的研究较多，但超临界流体应用于骨组织清洗的研究少见，国内相关报道更少。二氧化碳因性质稳定、无毒、易分离、临界条件容易达到等优点受到研究者的关注。超临界二氧化碳具有液体相似的溶解能力及气体相似的扩散能力^[11]，能够深入渗透细胞基质^[12]，在相对温和的条件下对生物材料完成处理，其作为溶剂已被广泛应用^[11^，^13]。

实验选取猪股骨松质骨作为研究对象，旨在通过超临界二氧化碳清洗技术处理骨移植物并对材料生物学性能进行检测，为超临界二氧化碳在骨组织清洗方面提供依据，为骨组织的处理提供更多的选择，尤其是为同种异体骨的处理提供更多的经验，进一步地为临床提供性能优异的骨移植材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年3月至2019年5月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料

实验动物：健康SD大鼠12只，体质量250 g左右，购自解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京) 2016-0002。三四周龄新西兰大白兔4只，购自北京科兰博实验动物研究所，许可证号：SYXK(京)2018-0037。所有动物实验方案均已经解放军总医院伦理委员会批准。

实验主要设备及试剂：Nova2200型SC-CO2清洗设备(美国)；S-4800型扫描电镜(Hitachi公司，日本)；18 kW转靶X射线衍射仪(日本，M18XHF)；HM-55高压水枪(金力霸)；数显式游标卡尺(世达工具)；⁶⁰Co照射(解放军军事医学科学院)；5969力学试验机(INSTRON英斯特郎美国)；羟脯氨酸测试盒(南京建成，货号：A030-2)。

1.4 实验方法

1.4.1 超临界二氧化碳萃取处理猪股骨松质骨取市售新鲜健康猪股骨，剔除骨表面肌肉、肌腱、筋膜等软组织，将股骨远端松质骨锯成10 mm×10 mm×10 mm左右的正方形骨块，放入PBS中清洗3次，每次5 min，骨块给予高压水枪冲洗去除血渍，放入4 ℃的冷库中逐渐降温至-80 ℃冻存24 h，以抑制破坏成骨相关的酶活性，将材料放入-20 ℃冷柜保存，即为超临界二氧化碳萃取前骨块。取冻存骨块，放入Nova2200型SC-CO₂清洗设备萃取，压强10 MPa、温度40 ℃，获得超临界二氧化碳萃取骨材料。

1.4.2 萃取前后的松质骨大体形态及微观结构观测样本大体形态观察如图1所示。40 g/L多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、样本喷金，扫描电镜观察支架微观结构。

1.4.3 萃取前后的松质骨骨密度及骨孔隙直径测定制备统一规格的骨样品用于孔径及骨密度测试。骨块扫描电镜成像，利用Nano Measurer1.2测量骨孔径直径。称量每个骨样本的质量；千分尺精确测量其尺寸，计算出每个样本的体积，得出每个样本单位体积的质量，即密度，用g/cm³表示。

1.4.4 萃取前后的松质骨生物力学性能测定每组样本制备为10 mm×10 mm×10 mm统一规格，然后将其置于力学试验机的工作台上，200 N预压3次后进行正式测试，测试速率为3 mm/min，其在骨组织出现断裂变形时结束，获得力-位移曲线，然后利用Origin8.5软件求得应力-应变曲线，获得样本最大抗压强度及弹性模量。

1.4.5 萃取前后的松质骨X射线衍射及傅里叶转换红外光谱分析 X射线衍射分析及傅里叶转换红外光谱测试分析骨组织的组成成分。将骨组织材料制备为统一规格，给予Empyrean X射线衍射仪检测，得出X射线衍射图像，将同一对应骨组织在研钵内研成粉末，控制粉末粒度45 μm左右，再将粉末进行X射线衍射测试，分析骨组织物相[2θ：5°-90°，扫描速度：9.01(°)/min]。傅里叶转换红外光谱分析骨组织组成，空气CO₂氛围检测红外500-4 500 cm^-1的吸收光谱，用Origin8.5得出曲线，根据吸收峰所对应的红外线波长来确定骨组织材料官能基团及骨组织成分。采用TG7300仪器在氮气氛中进行热重测量，热重曲线从室温至800 ℃的范围内以10 ℃/min的升温速率进行。

1.4.6 萃取前后的松质骨胶原含量测定将两组骨组织材料分别在研钵内研成粉末，准确称取100 mg，加入盐酸消化，根据制造商的方案使用羟脯氨酸测试盒对样本进行总胶原含量测定。

1.4.7 萃取前后的松质骨组织学分析 40 g/L多聚甲醛固定48 h，EDTA脱钙，组织脱水后石蜡包埋，切片染色。将两组骨材料分别进行苏木精-伊红染色、天狼星红染色、改良Masson染色分析。

1.4.8 骨材料体外细胞相容性评估将两种骨组织材料剪裁成5 mm×5 mm×2 mm大小，⁶⁰Co灭菌消毒备用。取4只新西兰大白兔，麻醉备皮、常规消毒铺巾、于髂骨最高处骨穿抽取骨髓，肝素化后，根据Percoll密度梯度离心获取骨髓间充质干细胞并进行鉴定^[14]，加入带有血清的DMEM培养液重悬，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内培养，待生长至培养瓶90%融合时传代，取P3代细胞进行实验。将P3代骨髓间充质干细胞制备成细胞浓度为1×10⁹ L^-1 的细胞悬液，分别接种至2种支架上，每个支架100 μL。置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱孵育3 h后，加入DMEM培养液，继续培养1 d后取出骨材料-细胞复合物，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，扫描电镜观察细胞在骨材料表面黏附及生长情况。

1.4.9 大鼠皮下植入实验取12只健康SD大鼠，麻醉后备皮，常规消毒铺巾，背部切口2 cm，并皮下游离，分别将两组骨材料植入皮下，左右各一，手术缝线缝合切口。术后1，2，4周处死大鼠，观察切口内外愈合情况，取材料植入部位皮肤及皮下材料包裹组织，40 g/L多聚甲醛固定48 h，常规脱水、包埋、切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观察。

1.5 主要观察指标萃取前后松质骨的骨密度、微观结构、最大抗压强度、弹性模量、骨组织组成成分、胶原含量与组织学分析，以及细胞与组织相容性。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行统计学处理，数据以x(_)±s表示，统计骨支架孔隙率、孔径大小及骨密度时采用单因素方差分析，两独立样本采用独立样本t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

骨组织工程包括3大核心要素：支架、种子细胞及促进骨形成的生长因子^[19]。骨支架材料的要求包括^[20]：①完整的三维多孔结构，孔隙相互连通；②良好的生物相容性；③可降解吸收，降解产物对机体无毒副作用，降解速率和新骨形成的速率相匹配；④良好的生物力学强度。同时骨移植所需的理想材料应同时具备骨传导和骨诱导性能^[21-22]，骨诱导作用是指移植材料周边宿主结缔组织中的可诱导成骨前体细胞(如间充质细胞)，在诱导因子的作用下被诱导成骨原细胞，经成骨细胞形成新骨，称为骨诱导。骨传导作用也就是支架作用，可避免骨缺损因周围软组织的挤压而塌陷^[23]，同时移植骨可引导周围骨修复组织(如血管、骨髓干细胞)沿支架长入实现爬行替代的过程。骨移植的愈合、替代过程主要依靠骨的传导作用。生物衍生骨不仅满足骨诱导和骨传导要求，同时来源广泛，是解决骨缺损修复难题的重要组织工程材料。

此次实验扫描电镜观察及组织切片评估发现，超临界二氧化碳萃取猪股骨松质骨材料能够有效去除骨髓及软组织；傅里叶光谱及X射线衍射分析发现，超临界二氧化碳萃取猪股骨松质骨可能引起羟基磷灰石结晶的少许改变，但是这并没有导致骨组织结构的破坏；热重分析显示超临界流体可减少骨组织水分含量，达到部分干燥的作用；天狼星红染色及改良Masson染色分析发现，超临界二氧化碳萃取骨组织材料胶原结构保存完整，天狼星红染色可见小梁边缘呈强折光性红染，Masson染色小梁周围呈蓝染，这可能是超临界二氧化碳萃取过程去除了部分细胞外基质，导致胶原结构裸露的结果。根据试剂供应商的方案，对羟脯氨酸进行了定量检测，所测试样本中的羟脯氨酸含量并没有因超临界二氧化碳萃取处理发生改变，表明超临界二氧化碳萃取骨移植物不会影响胶原含量。胶原结构及含量的保存有助于生物力学的维持，同时胶原是一种骨诱导材料^[24]，这可能促进骨在宿主体内的整合。进一步的细胞实验表明，超临界二氧化碳萃取骨材料骨小梁表面呈取向性条纹状改变，结合组织学分析这可能是胶原裸露，这一改变导致比表面积增大，增加的比表面积，可以增加细胞与骨材料的接触面积，从而利于细胞黏附、生长^[25]。动物实验将两组骨移植材料植入大鼠皮下，发现超临界二氧化碳萃取后骨植入1，2，4周后的炎症反应均低于超临界二氧化碳萃取前骨。目前一般认为骨组织的非胶原成分具有较强的免疫原性，可刺激宿主产生炎症反应。此次实验发现皮下植入实验炎症反应的减弱，可能是超临界流体在迅速减压过程中将非胶原软组织成分及破碎细胞成分清除的结果^[26]。

综上所述，实验通过超临界二氧化碳萃取技术制备骨组织材料移植物，提示该技术能够有效去除细胞及软组织，并且骨小梁、骨孔隙结构完整，孔隙相互连通，胶原功能结构无明显破坏，生物力学性能良好；清洗过程绿色环保，无有机溶剂及有毒物质残留，因此该技术是一种安全、有效的骨组织工程处理技术，可能是未来解决骨移植材料处理难题的有效方法之一。下一步将继续完善该技术处理骨组织材料与传统处理骨材料性能评估及动物体内原位修复的评价。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

超临界二氧化碳萃取的猪松质骨

Extraction of porcine cancellous bone by supercritical carbon dioxide

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