负载脑源性神经营养因子胶原/肝素硫酸支架促进颅脑创伤大鼠神经运动功能的恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2316

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (34): 5538-5544.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2316

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负载脑源性神经营养因子胶原/肝素硫酸支架促进颅脑创伤大鼠神经运动功能的恢复

张健^1，2，陈淼³，李伟鑫¹，叶益超^1，2，徐会友^1，2，马珂^1，2，陈旭义²，孙洪涛²，张赛²

¹武警后勤学院，天津市 300300；²武警特色医学中心神经创伤及修复研究所，天津市神经创伤修复重点实验室，天津市 300171；³新疆医科大学第四临床医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830002

收稿日期:2019-12-03 修回日期:2019-12-10 接受日期:2020-01-18 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-11
通讯作者: 孙洪涛，主任医师，武警特色医学中心神经创伤及修复研究所，天津市神经创伤修复重点实验室，天津市 300171
作者简介:张健，男，1989年生，新疆维吾尔自治区乌苏市人，汉族，武警后勤学院在读硕士，主要从事颅脑创伤研究。陈淼，女，1990年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事中医药及统计学方面的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金(11672332，11102235)；国家自然科学基金(11932013)；国家重点研发计划(2016YFC1101500)；天津市自然科学基金项目(15JCYBJC28600)；天津市自然科学基金项目(17JCDJC5400)；天津市科技支撑重点项目(17YFZCSY00620)；天津市科技军民融合重大项目(18ZXJMTG00260)

Collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor promote neurological and locomotor function recovery in rats after traumatic brain injury

Zhang Jian^{1, 2}, Chen Miao³, Li Weixin¹, Ye Yichao^{1, 2}, Xu Huiyou^1,², Ma Ke^1,², Chen Xuyi², Sun Hongtao², Zhang Sai²

¹Logistics University of People’s Armed Police Force; ²Institute of Neurotrauma Repair, Characteristic Medical Center of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin Key Laboratory of Neurotruama Repair,; ³The Fourth Clinical Medical College of Xinjiang Medical University

Received:2019-12-03 Revised:2019-12-10 Accepted:2020-01-18 Online:2020-11-08 Published:2020-09-11
Contact: Sun Hongtao, Chief physician, Institute of Neurotrauma Repair, Characteristic Medical Center of Chinese People's Armed Police Force, Tianjin Key Laboratory of Neurotruama Repair, Tianjin 300171, China
About author:Zhang Jian, Master candidate, Logistics University of People's Armed Police Force, Tianjin 300300, China; Institute of Neurotrauma Repair, Characteristic Medical Center of Chinese People's Armed Police Force, Tianjin Key Laboratory of Neurotruama Repair, Tianjin 300171, China Chen Miao, Master candidate, The Fourth Clinical Medical College of Xinjiang Medical University, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, Nos. 11672332, 11102235; the National Natural Science Foundation of China, No. 11932013; the National Key Research and Development Plan of China, No. 2016YFC1101500; the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 15JCYBJC28600; the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 17JCDJC5400; Tianjin Science and Technology Support Key Project, No. 17YFZCSY00620; Science and Technology Military-Civilian Integration Project of Tianjin, No.18ZXJMTG00260

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脑源性神经营养因子：是一种来源于脑组织的分子质量为12.3 kD的多肽或蛋白质，对神经系统损伤等具有一定的治疗潜能，能通过多种机制营养神经元，促进其再生和生长发育。

胶原：广泛分布于细胞外基质中，能够为神经细胞的增殖、分化和代谢提供适宜的微环境，具有免疫原性低、生物降解性和生物相容性好等特点，缺点在于其力学性能较差。

硫酸肝素：是一种黏多糖，是神经细胞基底膜、细胞外基质的重要组成部分，能够调节生物活性，促进神经纤维的再生。

背景：研究表明胶原和硫酸肝素交联后可有效固定生长因子，显著改善脊髓损伤大鼠的神经运动功能恢复。

目的：观察负载脑源性生长因子胶原/硫酸肝素支架移植修复颅脑创伤的效果。

方法：制作胶原支架、胶原/硫酸肝素支架与负载脑源性神经营养因子的胶原/硫酸肝素支架，检测胶原支架、胶原/硫酸肝素支架的孔隙率、吸水率、压缩模量和压缩应力；检测载脑源性生长因子胶原/硫酸肝素支架的体外缓释性能；检测胶原/硫酸肝素支架与负载脑源性神经营养因子的胶原/硫酸肝素支架的细胞毒性与细胞相容性。将48只SD大鼠随机分4组干预：对照组开骨窗后缝合，空腔组仅制作颅脑创伤空腔模型，支架组、生长因子支架组颅脑创伤后空腔处分别植入胶原/硫酸肝素支架、负载脑源性神经营养因子的胶原/硫酸肝素支架，术后分别进行改良神经功能缺损评分、水迷宫测试与脑损伤形态学观察。动物实验获得武警特色医学中心伦理委员会批准。

结果与结论：①胶原/硫酸肝素支架的孔隙率、压缩模量和压缩应力高于胶原支架(P < 0.05)，吸水率低于胶原支架(P < 0.05)；②胶原/硫酸肝素支架无细胞毒性，负载脑源性神经营养因子后更加有利于脑微血管内皮细胞的增殖；脑微血管内皮细胞在负载脑源性神经营养因子支架微孔内生长良好，分布均匀；③形态学观察显示，两支架组损伤灶处可见大量新生神经细胞及神经纤维，其中以生长因子支架组的新生神经细胞数量及神经纤维密度更高；④生长因子支架组大鼠的逃逸潜伏期短于空腔组、支架组(P < 0.01，P < 0.05)，象限停留时间和平台穿越次数高于支架组、空腔组(P < 0.01，P < 0.05)；⑤生长因子支架组术后3-7周的改良神经功能缺损评分低于支架组、空腔组(P < 0.05，P < 0.01)；⑥结果表明，负载脑源性神经营养因子胶原/硫酸肝素支架移植可以促进大鼠颅脑创伤后神经运动功能的恢复。

ORCID: 0000-0003-2076-3606(张健)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 颅脑创伤, 胶原支架">, , 胶原/硫酸肝素支架">, , 脑源性神经营养因子">, , BDNF">, , 水迷宫">, , 脑微血管内皮细胞

Abstract:

BACKGROUND: The porous scaffold fabricated with collagen and heparin sulfate can effectively immobilize neurotrophic factor and greatly improve neurological and locomotor function recovery.

OBJECTIVE: To investigate the effect of collagen/heparan sulfate scaffold loaded with brain-derived neurotrophic factor in the treatment of traumatic brain injury (TBI).

METHODS: Collagen scaffolds, collagen/heparan sulfate scaffolds and collagen/heparan sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor were prepared. The porosity, water absorption, compression modulus and compression stress of collagen scaffolds and collagen/heparan sulfate scaffolds were measured. The in vitro sustained-release performance of collagen/heparan sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor was measured. The cytotoxicity and cytocompatibility of collagen/heparin sulfate scaffolds and collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor were detected. Forty-eight Sprague-Dawley rats were randomly assigned to undergo corresponding interventions: opening bone window followed by suture (control group), induction of craniocerebral trauma (model group), induction of craniocerebral trauma + implantation of collagen/heparin sulfate scaffolds (scaffold group), and induction of craniocerebral trauma + implantation of collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor (brain-derived neurotrophic factor group). After surgery, modified neurological severity scoring and Morris water maze test were performed to evaluate the recovery of neurological and locomotor function. Rat cerebral morphology was performed. This study was approved by the Animal Ethics Committee of Characteristic Medical Center of Chinese People's Armed Police Force, China.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The porosity, compression modulus and compression stress of the collagen/heparin sulfate scaffold were significantly higher than those of the collagen scaffold (P < 0.05), and the water absorption rate of the collagen/heparin sulfate scaffold was lower than that of the collagen scaffold (P < 0.05). (2) Collagen/heparin sulfate scaffolds had no cytotoxicity, and collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor were more conducive to the proliferation of cerebral microvascular endothelial cells; cerebral microvascular endothelial cells grew well and distributed evenly in the micropores of the collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor. (3) There were a large number of newly formed nerve cells and nerve fibers in the lesions in the scaffold and brain-derived neurotrophic factor groups. The number of nerve cells and the density of nerve fibers in the scaffold group were higher compared with the brain-derived neurotrophic factor group. (4) In the brain-derived neurotrophic factor group, escape latency was shorter (P < 0.01, P < 0.05), quadrant stay time and the number of crossing the platform were higher (P < 0.01, P < 0.05) compared with the scaffold and model groups. (5) The modified neurological severity score in the brain-derived neurotrophic factor group was significantly lower than that in the scaffold and model groups, respectively at postoperative 3-7 weeks (P < 0.05, P < 0.01). (6) These results suggest that collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor can promote neurological and locomotor function recovery in rats after traumatic brain injury.

Key words: traumatic brain injury">, , collagen scaffold">, , collagen/heparin sulfate scaffold">, , brain-derived neurotrophic factor">, , BDNF, water maze">, , cerebral microvascular endothelial cells

中图分类号:

张健, 陈淼, 李伟鑫, 叶益超, 徐会友, 马珂, 陈旭义, 孙洪涛, 张赛. 负载脑源性神经营养因子胶原/肝素硫酸支架促进颅脑创伤大鼠神经运动功能的恢复 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(34): 5538-5544.

Zhang Jian, Chen Miao, Li Weixin, Ye Yichao, Xu Huiyou, Ma Ke, Chen Xuyi, Sun Hongtao, Zhang Sai. Collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor promote neurological and locomotor function recovery in rats after traumatic brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(34): 5538-5544.

图/表（结果） 4

2.1 负载BDNF胶原/硫酸肝素支架的特点扫描电镜结果发现，胶原/硫酸肝素支架的孔隙分布均匀，具有良好的多孔结构和孔隙间连通性，见图2A，有利于细胞的增殖和迁移。胶原/硫酸肝素支架负载BDNF后，ELISA试剂盒测定BDNF释放量，结果显示在1-6 d，BDNF以平均2.8 ng/d的速率释放，第7-14天，BDNF以平均1.68 ng/d的速率释放，第15-20天以平均1.07 ng/d的速率释放，之后释放速率逐渐下降，见图2B。胶原支架和胶原/硫酸肝素支架的吸水率分别为(1 383.7±86.7)%，(996.8±63.2)%，孔隙率分别为(54.2±6.8)%，(86.5±7.7)%，压缩应力分别为(124.6± 11.1)，183.6±16.4) kPa，压缩模量分别为(1.95±0.24)，(4.23±0.26)MPa。相比于胶原支架，胶原/硫酸肝素支架的吸水率明显较低(P < 0.05)，孔隙率、压缩应力、压缩模量明显较高(P < 0.05)，见图2C-F。

2.2 负载脑BDNF胶原/硫酸肝素支架的细胞生物相容性共聚焦显微镜下观察到大鼠脑微血管内皮细胞呈典型的梭形细胞，特异性标志物CD31表达阳性，见图3A-C。脑微血管内皮细胞与负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架共培养 8 d后观察到，细胞在支架微孔内生长良好，分布均匀，见图3D，E。CCK-8实验结果显示，各组吸光度值与培养时间呈正相关，时间越长吸光度值越大；共培养第3天开始，负载BDNF胶原/硫酸肝素支架组吸光度值明显高于胶原/硫酸肝素支架组、对照组(P < 0.05)，而胶原/硫酸肝素支架组和对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3F，说明胶原/硫酸肝素支架无细胞毒性，负载BDNF后更加有利于大鼠脑微血管内皮细胞的增殖，具有较好的细胞生物相容性。

2.3 支架体内修复实验形态学改变各组大鼠均未发现有感染、浆液瘤或炎症等并发症。

图4A为术后7周各组具有代表性的脑组织大体观及损伤区苏木精-伊红染色。苏木精-伊红染色显示，对照组神经细胞胞质均匀，无细胞皱缩、深染、细胞形态缺失及水肿等病理性改变；空腔组见损伤灶处神经细胞大量丢失，新生神经细胞数量少，损伤灶周围可见大量神经细胞出现水肿、核皱缩变形、胞质不均匀等病理性改变；支架组和生长因子支架组损伤灶处可见大量新生神经细胞及神经纤维，损伤灶周围神经细胞水肿、胞质不均匀及核皱缩变形等病理性改变明显较空腔组减轻，生长因子支架组新生神经细胞数量及神经纤维密度明显多于支架组。空腔组、支架组、生长因子支架组脑组织受损体积百分比分别为(2.96±0.23)%，(1.24±0.16)%，(0.74±0.11)%，生长因子支架组、支架组显著低于空腔组(P < 0.01，P < 0.05)，见图4B。

2.4 支架体内修复实验神经运动功能恢复情况在水迷宫测试空间学习阶段发现，随着训练时间的延长，各组大鼠的逃逸潜伏期(即登陆平台所花费的时间)逐渐缩短，见图5A，其中生长因子支架组、支架组的逃逸潜伏期短于空腔组(P < 0.01，P < 0.05)，而生长因子支架组的逃逸潜伏期短于支架组(P < 0.05)，见图5C。在空间记忆阶段(图5B)，对照组、空腔组、支架组、生长因子支架组的象限停留时间(在隐藏平台象限花费时间)分别为(44.788±4.475)，(19.646±3.140)，(29.742±3.990)，(38.050±3.912) s，平台穿越次数分别为(6.875±1.452)，(1.250±0.969)，(3.875± 0.927)，(5.750±0.968)次。生长因子支架组、支架组的象限停留时间(在隐藏平台象限花费时间)和平台穿越次数均显著高于空腔组(P < 0.01，P < 0.05)，但均低于对照组 (P < 0.05，P < 0.01)，见图5D，E。

mNSS评分结果显示，随着时间的推移，除对照组外，其余各组大鼠评分均呈现下降趋势，从术后第3周开始，生长因子支架组、支架组mNSS评分低于空腔组(P < 0.01，P < 0.05)，生长因子支架组低于支架组(P < 0.05)，图5F。

参考文献

[1] JIANG QS, LIANG ZL, WU MJ, et al. Reduced brain-derived neurotrophic factor expression in cortex and hippocampus involved in the learning and memory deficit in molarless SAMP8 mice.Chin Med J (Engl).2011;124(10):1540-1544.

[2] MATSUMOTO T, RAUSKOLB S, POLACK M, et al. Biosynthesis and processing of endogenous BDNF: CNS neurons store and secrete BDNF, not pro-BDNF.Nat Neurosci. 2008;11(2):131-133.

[3] MITROSHINA EV, MISHCHENKO TA, USENKO AV, et al. AAV-Syn-BDNF-EGFP Virus Construct Exerts Neuroprotective Action on the Hippocampal Neural Network during Hypoxia In Vitro.Int J Mol Sci. 2018;19(8). pii:E2295.

[4] NILLESEN ST, GEUTJES PJ, WISMANS R, et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF.J Control Release.2006;116(2):88-90.

[5] SUN B, CHEN B, ZHAO Y, et al. Crosslinking heparin to collagen scaffolds for the delivery of human platelet-derived growth factor.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2009; 91(1):366-372.

[6] MOCHIZUKI M, GÜÇ E, PARK AJ, et al. Growth factors with enhanced syndecan binding generate tonic signalling and promote tissue healing.Nat Biomed Eng. 2020;4(4):463-475.

[7] CHEN C, ZHAO ML, ZHANG RK, et al. Collagen/heparin sulfate scaffolds fabricated by a 3D bioprinter improved mechanical properties and neurological function after spinal cord injury in rats.J Biomed Mater Res A.2017;105(5):1324-1332.

[8] LI X, ZHANG R, TAN X, et al. Synthesis and Evaluation of BMMSC-seeded BMP-6/nHAG/GMS Scaffolds for Bone Regeneration.Int J Med Sci.2019;16(7):1007-1017.

[9] GAO W, LI F, LIU L, et al. Endothelial colony-forming cell-derived exosomes restore blood-brain barrier continuity in mice subjected to traumatic brain injury.Exp Neurol. 2018; 307(1): 99-108.

[10] LAI BQ, FENG B, CHE MT, et al. A Modular Assembly of Spinal Cord-Like Tissue Allows Targeted Tissue Repair in the Transected Spinal Cord.Adv Sci(Weinh).2018;5(9):1800261.

[11] WANG L, WANG J, WANG F, et al. VEGF-Mediated Cognitive and Synaptic Improvement in Chronic Cerebral Hypoperfusion Rats Involves Autophagy Process.Neuromol Med.2017;19(2-3):423-435.

[12] WEN Z, XU X, XU L, et al. Optimization of behavioural tests for the prediction of outcomes in mouse models of focal middle cerebral artery occlusion.Brain Res.2017;1665(12): 88-94.

[13] JOHNSON VE, STEWART W, WEBER MT, et al. SNTF immunostaining reveals previously undetected axonal pathology in traumatic brain injury.Acta Neuropathol. 2016; 131(1):115-135.

[14] TAN HP, GUO Q, HUA G, et al. Inhibition of endoplasmic reticulum stress alleviates secondary injury after traumatic brain injury. Neural Regen Res. 2018;13(5): 827-836.

[15] SHI W, NIE D, JIN G, et al. BDNF blended chitosan scaffolds for human umbilical cord MSC transplants in traumatic brain injury therapy.Biomaterials.2012;33(11):3119-3126.

[16] GENTLEMAN E, LAY AN, DICKERSON DA, et al. Mechanical characterization of collagen fibers and scaffolds for tissue engineering.Biomaterials.2003;24(21):3805-3813.

[17] SIMIONESCU DT, LU Q, SONG Y, et al. Biocompatibility and remodeling potential of pure arterial elastin and collagen scaffolds. Biomaterials.2006;27(5):702-713.

[18] CORNWELL KG, LEI P, ANDREADIS ST, et al.Crosslinking of discrete self-assembled collagen threads: Effects on mechanical strength and cell-matrix interactions.J Biomed Mater Res A. 2007;80(2):362-371.

[19] ZHAO S, WANG Z, CHEN J, et al. Preparation of heparan sulfate-like polysaccharide and application in stem cell chondrogenic differentiation.Carbohydr Res. 2015;401(12): 32-38.

[20] LU Q, ZHANG S, HU K, et al. Cytocompatibility and blood compatibility of multifunctional fibroin/collagen/heparin scaffolds. Biomaterials.2007;28(14):2306-2313.

[21] 甘晓,南吴力.硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架修复周围神经损伤[J].中国组织工程研究,2016,20(25):3744-3749.

[22] CHEN YS, CHANG JY, CHENG CY, et al. An in vivo evaluation of a biodegradable genipin-cross-linked gelatin peripheral nerve guide conduit material.Biomaterials. 2005; 26(18):3911-3918.

[23] VÖGTLE T, SHARMA S, MORI J, et al. Heparan sulfates are critical regulators of the inhibitory megakaryocyte-platelet receptor G6b-B.Elife.2019;8.pii: e46840.

[24] CHEN L, LV Y, GUAN L, et al. Analysis of properties of collagen membranes before and after crosslinked. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi.2008;22(2):183-187.

[25] KADOYA K, TSUKADA S, LU P, et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury.Neuron. 2009; 64(2):165-172.

[26] CACIALLI P, PALLADINO A, LUCINI C.Role of Brain-Derived Neurotrophic Factor During the Regenerative Response After Traumatic Brain Injury in Adult Zebrafish.Neural Regen Res. 2018;13(6):941-944.

[27] BHATTAMISRA SK, YAP KH, RAO V, et al. Multiple Biological Effects of an Iridoid Glucoside, Catalpol and Its Underlying Molecular Mechanisms.Biomolecules.2019;10(1).pii: E32.

[28] ELAHI FM, CASALETTO KB, LA JOIE R, et al. Plasma biomarkers of astrocytic and neuronal dysfunction in early- and late-onset Alzheimer's disease.Alzheimers Dement. 2019. pii: S1552-5260(19)35373-7.

[29] HØRLYCK LD, MACOVEANU J, VINBERG M, et al. The BDNF Val66Met Polymorphism Has No Effect on Encoding-Related Hippocampal Response But Influences Recall in Remitted Patients With Bipolar Disorder.Front Psychiatry.2019;10:845.

[30] PANAGIOTAKOPOULOU V, BOTSAKIS K, DELIS F, et al. Anti-neuroinflammatory, protective effects of the synthetic microneurotrophin BNN-20 in the advanced dopaminergic neurodegeneration of "weaver" mice.Neuropharmacology. 2020;165:107919.

[31] HASSANNEJAD Z, ZADEGAN SA, VACCARO AR, et al. Biofunctionalized peptide-based hydrogel as an injectable scaffold for BDNF delivery can improve regeneration after spinal cord injury.Injury.2019;50(2):278-285.

[32] LAMPE KJ, KERN DS, MAHONEY MJ, et al. The administration of BDNF and GDNF to the brain via PLGA microparticles patterned within a degradable PEG-based hydrogel: Protein distribution and the glial response.J Biomed Mater Res A. 2011;96(3):595-607.

引言

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2019年4至9月在天津市武警特色医学中心神经创伤及修复研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 14 d龄SD雄性大鼠，体质量13-15 g；成年雄性SD大鼠，体质量190-200 g，均由解放军军事医学科学院提供，许可证号：SCXK-2012-0004。

1.3.2 主要试剂与仪器 BDNF(PeproTech Inc，美国)；CCK-8试剂盒、BDNFELISA 试剂盒、青/链霉素双抗溶液、Ⅱ型胶原酶、DNA 酶、人纤维连接蛋白、细胞外基质培养基、硫酸肝素、异硫氰酸荧光素荧光染料(Sigma，美国)；大鼠抗CD31多克隆抗体(BD，美国)；内皮细胞生长培养基2(Lonza，美国)；特级澳洲胎牛血清；(兰州百灵公司)；DMEM 培养基(Gibco，美国)；Ⅰ型胶原蛋白(Coriong matrige，美国)；0.5%牛血清白蛋白(Solarbio science＆technology co.北京，中国)；冷冻干燥机(CHRIST，Vaihingen，Germany)；材料试验机(E1000；Instron，Norwood，MA)；多功能酶标仪(Bio Tek，Synergy2，美国)；可控皮质冲击装置(eCCI Model 6.3；VCU，Richmond，VA，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 支架的制备称取1 gⅠ型胶原蛋白、50 mg硫酸肝素，混合于50 mL乙酸溶液(0.05 mol/L)中，磁力搅拌仪均匀搅拌30 min，置于4 ℃冰箱内12 h，形成凝胶状混合液。将混合液曝光于紫外光(365 nm，18 W/cm²)下10-15 min产生交联反应，之后将其放入冷冻干燥机中冻干48 h，取出后依次浸入1%NaOH溶液中12 h、去离子水中48 h，裁切成 2 mm×3 mm×3 mm圆柱体后用⁶⁰Co灭菌。Ⅰ型胶原蛋白支架依同理获取。将灭菌的胶原/硫酸肝素支架浸入200 µL BDNF(0.2 mg/L)溶液中，之后置于4 ℃冰箱中孵育24 h，即可获取负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架。

1.4.2 支架的性能胶原/硫酸肝素支架及Ⅰ型胶原支架的性能测试。

孔隙率：用乙醇置换法测定支架的孔隙率。测定乙醇的初始体积为V_a。然后将支架浸泡在含有乙醇的量筒中，直至无气泡从支架中逸出，测定此时乙醇的体积为V_b。将支架从量筒中移出，测定剩余乙醇体积为V_c。支架孔隙率(%)=(V_a-V_c)/(V_b-V_c)×100%^[8]。每个样本测定3次，取平均值。

吸水率：通过测量吸水性来评估支架的亲水特性。记录冻干支架的质量为m₁。然后将支架浸泡在蒸馏水中24 h，用滤纸吸干多余水分后重新称质量，记为m₂。支架的吸水率=(m₂-m₁)/m₁×100%^[8]。每个样本测定3次，取平均值。

压缩应力和压缩模量：将支架置于0.01 mol/L PBS中过夜，使用通用材料试验机对支架样本在100 N负载、10%最大压缩应变条件下进行压缩力学性能测试，以获得压缩应力和弹性模量^[7]。

大鼠BDNF累计释放量测定：将负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架置于12孔板中，加入1 mL PBS后置于37 ℃温箱。分别在2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28 d收集上清液，并重新加入1 mL PBS替换，按照BDNF ELISA试剂盒操作方法在各时间点测量上清液中BDNF量并记录。

1.4.3 大鼠脑微血管内皮细胞的培养和鉴定^[9] 将14 d龄 SD大鼠脱颈处死，超净台下剥离出脑组织并置入4 ℃含有无菌PBS的培养皿中，分离去除间脑、小脑、脑干、丘脑和脑膜等，后置于干燥无菌滤纸上滚动，以除去脑表面血管及残留脑膜。在4 ℃ PBS中进一步用显微镊去除大脑皮质内血管，将剩余脑组织用显微剪剪切至为1 mm³左右小块。依次加入1%的Ⅱ型胶原酶、DNA酶，放入37 ℃温箱中消化90 min，间隔20 min左右晃动一次。将充分消化脑组织以300×g离心10 min，保留沉淀。收集沉淀后加入20%的无菌牛血清白蛋白，1 000×g离心20 min，去上清，收集沉淀。细胞外基质培养基重悬，将沉淀接种于包被人纤维连接蛋白的六孔板，每3 d更换培养基1次。7-10 d后行CD31免疫荧光染色鉴定，在激光共聚焦显微镜下观察大鼠脑微血管内皮细胞的形态。

1.4.4 支架细胞生物相容性测试

CCK-8检测细胞毒性：将第2代大鼠脑微血管内皮细胞依次接种于96孔板中的胶原/硫酸肝素支架及负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架内，以不含支架的作为对照组，接种细胞浓度为1×10⁷ L^-1，每孔100 μL。置于体积分数5%CO₂湿化培养箱中37 ℃孵育7 d，每2 d更换一次培养基。在孵育1，3，5，7 d时，每组随机取3孔并加入30 μL CCK-8，温箱中培养2 h，移除培养基后采用多功能酶标仪读取 450 nm处的吸光度值。

支架和细胞共培养：将第2代大鼠脑微血管内皮细胞接种于负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架内，接种细胞浓度为1×10⁷ L^-1，每孔100 μL。共培养7 d后，分别用2%戊二醛、 1%四氧化锇固定样本，采用丙酮梯度脱水，经液氮快速冷冻后进行干燥^[10]，最后在扫描电镜下观察细胞支架共培养的超微结构，以评估支架的细胞生物相容性，同理观察胶原/硫酸肝素支架形态结构。

1.4.5 颅脑创伤模型制备和支架植入取成年雄性SD大鼠48只，50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，头部备皮后俯卧位固定于立体定位架。以冠状缝后2 mm、矢状缝外侧4 mm为标志，逐层切开头皮暴露颅骨，开一直径5 mm骨窗，随机分为4组，每组12只：对照组切开头皮，打开骨窗后缝合；空腔组、支架组、生长因子支架暴露脑组织后给予可控皮质冲击装置打击，建立颅脑创伤模型。打击参数设置为：深度2 mm，冲击速度4.5 m/s，停留时间120 ms。在手术显微镜下切开硬脑膜，用环钻于受打击区取出直径2 mm的圆柱形脑组织。充分止血后，支架组植入胶原/硫酸肝素支架于空腔中，生长因子支架组植入负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架于空腔中(图1)。随后逐层缝合，给予小动物呼吸机吸氧，置恒温毯上，完全苏醒后送回笼内饲养。

1.4.6 形态学观察术后7周，从各组分别取大鼠8只并给予腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，依次经生理盐水、40 g/L多聚甲醛灌注后剥离脑组织观察损伤灶变化情况。随后将脑组织用40 g/L多聚甲醛浸泡24 h，石蜡包埋切片后进行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察形态学变化，并通过ImageJ软件计算各组大鼠受损脑组织体积，具体计算公式为(V_u-V_i)/V_u×100%(V_u=健侧半脑体积，V_i=损伤侧半脑体积)。

1.4.7 神经运动功能测试

水迷宫实验：术后第31-36天进行水迷宫实验，以评估各组大鼠空间学习和空间记忆能力恢复情况。水迷宫水池的直径为150 cm，高度为60 cm，分均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个象限，将45 cm的水与墨汁混合后注入水池使其浑浊，一直径10 cm的平台被淹没在第Ⅳ象限中心水面以下2 cm处，并通过一系列线索，训练各组大鼠来寻找隐藏平台，训练时间为5 d。测试时需将大鼠从水池边缘被置于水中，如在60 s内仍未到达Ⅳ象限隐藏平台，需引导大鼠到达平台并停留10-20 s。之后连续6 d对大鼠进行空间学习测试，记录逃逸潜伏期(大鼠到达隐藏平台花费时间)。第7天对各组大鼠进行空间记忆能力测试，记录象限停留时间(在象限Ⅳ中花费的总时间的百分比)和平台穿越次数。采用视频跟踪系统(Ethovision 2.0，Noldus，Wageningen，荷兰)收集并分析大鼠的游泳轨迹及空间学习、记忆等相关数据^[11]。

改良神经功能缺损评分mNSS：损伤后1-7周对各组大鼠行mNSS量表评分，包括反射、运动、感觉和平衡测试等，以评估神经功能恢复情况。mNSS量表共18分，评分越高神经系统功能损害越严重。具体步骤可见WEN等^[12]的描述。简单来说，首先在术前对各组大鼠进行训练，确定基线评分(0分)，之后采用盲法在不同时间点对损伤后大鼠神经功能缺损情况评估和分析。

1.5 主要观察指标胶原/硫酸肝素支架的孔隙率、吸水率、压缩模量、压缩应力及细胞相容性，以及负载BDNF胶原/硫酸肝素支架修复大鼠颅脑创伤空腔的效果。

1.6 统计学分析使用SPSS 15.0软件(SPSS，Chicago，IL，USA)进行数据处理，多组间比较使用单因素方差分析(ANOVA)，2组间比较使用Student's t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

讨论

颅脑创伤后常引起局部脑组织损伤坏死形成空腔灶，导致感觉、运动功能减退^[13-14]，损伤后的神经修复仍是一个具有挑战性的临床难题^[15]，寻找合适的促进受损脑组织恢复的治疗方法是十分有必要的。神经生物医学工程的快速发展为神经组织的再生和修复提供了期望，神经生物材料的研发也逐渐受到重视。蛋白质和多糖属于天然聚合物，具有神经生物组织工程所要求的易降解特性，是制备生物材料支架的最佳选择之一。Ⅰ型胶原已被证实广泛分布于细胞外基质中，能够为神经细胞的增殖、分化和代谢提供适宜的微环境，具有免疫原性低、生物降解性和生物相容性好等特点^[16-17]，但其缺陷在于其力学性能较差^[18]。硫酸肝素是一种黏多糖，是神经细胞基底膜、细胞外基质的重要组成部分，对神经纤维的再生具有积极意义^[19]。相关研究已证实，胶原蛋白和硫酸肝素间交联后能有效改善支架的力学性能^[20]。胶原与硫酸肝素均为构成细胞外基质的重要组成部分^[21-23]，更贴合于生物体内的实际微环境结构，因此由二者交联形成的复合支架在体内的排异反应较其他具有促进神经修复能力的支架材料(如聚乳酸^[24])更低，更加利于外来支架在体内的降解和吸收，生物活性更强。实验主要以Ⅰ型胶原蛋白(一种结构细胞外基质蛋白)和硫酸肝素(一种线性多糖)为主要成分制备生物支架，负载BDNF后植入大鼠颅脑创伤模型空腔灶，观察其力学性能改变及疗效。实验发现胶原与硫酸肝素交联后的孔隙率、压缩应力、压缩模量均增高，吸水率降低，表明该复合支架的力学性能得到增强。

目前临床上促进颅脑创伤后神经功能恢复的途径之一是向体内递送各类神经营养因子，有利于各类神经组织的生长发育、再生，对神经递质的传递也具有积极意义^[25]。BDNF属于神经营养因子家族中的成员，分布广泛，具有促进神经突触传递、神经细胞生长等功效，对维持正常生长发育具有重要作用^[26]。一些研究已证明，将BDNF负载于神经生物材料后能够通过控释作用延长神经营养因子的释放，从而在体内更好的发挥逆转神经损伤、促进神经系统修复等生物学效应^[27-30]。SHI等^[15]将BDNF负载于壳聚糖支架并测定脑源性生长因子释放曲线发现，30 d后BDNF依然能够从壳聚糖支架中持续性释放，并且释放的BDNF可诱导大鼠海马区神经干细胞分化为神经元。HASSANNEJAD等^[31]研究也发现，将BDNF负载于肽基水凝胶后能够持续性释放21 d，释放出的BDNF能够有效刺激受损脊髓背根神经节的再生。此外，LAMPE等^[32]将BDNF负载于聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球钟，发现BDNF持续释放时间可以达到56 d，并能够发挥生物学效应。实验将BDNF负载至胶原/硫酸肝素支架，同样发现BDNF可以从支架上缓慢释，说明胶原/硫酸肝素支架能够用于控释BDNF，有助于BDNF持续性在体内发挥作用。体外实验中扫描电镜证明了大鼠脑微血管内皮细胞能够在负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架上迁移生长，CCK-8试验证明大鼠脑微血管内皮细胞在负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架上的增殖效果较对照组和单纯支架组更佳，表明BDNF与支架的结合生物相容性较好，并能够有效促进颅脑创伤后的血管修复。颅脑创伤后早期血管增生的改善有利于缓解水肿、增加损伤区血供，有助于颅脑创伤患者的恢复。神经运动功能的恢复是颅脑创伤预后的关键指标，也是临床治疗的终极目标。体内实验结果显示，负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架水迷宫测试和mNSS评分较单纯支架组更好，提示了胶原/硫酸肝素负载BDNF能够在体内构建有效的分子递送平台，提升颅脑创伤后神经运动功能的恢复。与神经运动功能恢复效果一致的是，负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架组空腔灶体积明显较单纯支架组和空腔组更小。此外，负载BDNF的胶原/硫酸肝素支架内部孔隙结构均匀、丰富，机械性能较胶原支架明显改善，有利于神经细胞的迁移和增殖，为颅脑创伤后神经组织的再生修复提供了理想的局部微环境。

综上所述，实验于大鼠颅脑创伤模型空腔灶中植入负载BDNF的胶原/硫酸肝素生物支架，构建了适于神经组织再生、修复的微环境，并确定该支架具有神经组织工程应用的潜力，将进一步开发不同类型的复合支架，如支架与神经干细胞或外泌体结合以获取最佳临床疗效。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

负载脑源性神经营养因子胶原/肝素硫酸支架促进颅脑创伤大鼠神经运动功能的恢复

Collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with brain-derived neurotrophic factor promote neurological and locomotor function recovery in rats after traumatic brain injury

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[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[3]	刘建友, 贾中伟, 牛佳伟, 曹鑫杰, 张栋, 魏杰. 构建股骨3D数字化模型提出一种新的股骨颈前倾角测量方法[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3779-3783.
[4]	黄茂茂, 胡月, 王彬川, 张驰, 谢羽婕, 王剑雄, 汪丽, 胥方元. 缺血性脑卒中康复近10年国际文献计量学及可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3725-3733.
[5]	朱蕊, 曾庆, 黄国志. 铁死亡与脑卒中[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3734-3739.
[6]	李珊珊, 尤冉, 郭笑霄, 赵露, 王艳玲, 陈曦. 视神经再生机制研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3740-3745.
[7]	王震, 蔺海旗, 何霏, 林文弢. 运动激活骨骼肌卫星细胞：增龄性肌衰减症及肌肉损伤修复的运动预防和治疗[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3752-3759.
[8]	宋世雷, 陈跃平, 章晓云, 李时斌 , 赖渝, 周毅. 五苓散治疗骨关节炎潜在分子机制及网络药理学与分子对接[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3185-3193.
[9]	李震, 黄永辉, 孙继芾, 孙海涛. 黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 165-171.
[10]	胡广, 关智宇, 张开伟. 三七总皂苷干预去势骨质疏松性骨折模型大鼠的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 172-177.
[11]	耿彬, 夏亚一. 调控骨质疏松模型小鼠的ERK5蛋白信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 178-185.
[12]	李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 186-190.
[13]	李平, 林煜, 陈翔, 刘振涛, 肖莉莉, 林学义, 华鹏. 二至丸提取物干预去势骨质疏松雌性模型大鼠的骨重建特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 191-195.
[14]	刘杏, 魏晓菡, 邓洁, 李仲铭. 骨骼肌钝挫伤兔模型制备与打击力度的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 196-200.
[15]	黄旭东, 易志勇, 韩清民. 经筋手法干预膝骨关节炎模型兔骨骼肌收缩力学的改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 201-204.