五苓散治疗骨关节炎潜在分子机制及网络药理学与分子对接

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3203

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (20): 3185-3193.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3203

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五苓散治疗骨关节炎潜在分子机制及网络药理学与分子对接

宋世雷，陈跃平，章晓云，李时斌，赖渝，周毅

广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2019-12-23 修回日期:2019-12-28 接受日期:2020-07-26 出版日期:2021-07-18 发布日期:2021-01-15
通讯作者: 章晓云，硕士，主治医师，广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011
作者简介:宋世雷，男，1994年生，浙江省人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事骨与关节疾病及运动损伤研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81760796，81960803)，项目负责人：陈跃平；广西自然科学基金课题(2015GXNSFAA139136)，项目负责人：陈跃平；广西卫生厅重点课题(S201419-05)，项目负责人：陈跃平；广西高校青年教师基础能力提升项目(2019KY0352)，项目负责人：章晓云；广西中医药大学2019年校级科研课题(2019QN027)，项目负责人：章晓云；广西中管局自筹经费项目(GZZC2019096)，项目负责人：章晓云；广西中医药大学一流学科(2019XK029)，项目负责人：章晓云；2016年全国名老中医黄有荣传承工作室建设项目、广西中医药大学岐黄工程高层次人才团队培育项目(2018004)

Potential molecular mechanism of Wuling powder in treating osteoarthritis based on network pharmacology and molecular docking

Song Shilei, Chen Yueping, Zhang Xiaoyun, Li Shibin, Lai Yu, Zhou Yi

Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2019-12-23 Revised:2019-12-28 Accepted:2020-07-26 Online:2021-07-18 Published:2021-01-15
Contact: Zhang Xiaoyun, Master, Attending physician, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Song Shilei, Master candidate, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760796, 81960803 (both to CYP); Guangxi Natural Science Foundation, No. 2015GXNSFAA139136 (to CYP); Key Project of Guangxi Health Department, No. S201419-05 (to CYP); Guangxi University Young Teachers’ Basic Ability Improvement Project, No. 2019KY0352 (to ZXY); 2019 School-level Scientific Research Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2019QN027 (to ZXY); Self-Financing Project of Guangxi Administration of Traditional Chinese Medicine, No. GZZC2019096 (to ZXY); First-level Discipline Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2019XK029 (to ZXY); 2016 National Famous Traditional Chinese Medicine Heritage Studio Construction Project & Qihuang Engineering Project for High-level Talent Team Cultivation of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2018004

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
网络药理学特点：作为一门新学科被广泛运用于研究中药治疗疾病潜在的分子机制，它通过药物-基因-疾病多层次的网络中药机制分析，系统预测中药对致病基因潜在的药效靶点，科学阐述中药可能在疾病中的作用方式。
骨关节炎中医病机：是一种以关节疼痛、功能障碍为主要表现的骨科常见疾病，在中医属于“痹证”范畴，中国历代医家认为“风、寒、湿”三邪是该病的主要病因。

背景：目前临床运用五苓散治疗膝关节炎疗效确切，但其药理作用、分子机制及药物活性物质尚未明确。
目的：基于网络药理学方法寻找五苓散在治疗骨关节炎方面存在的潜在分子机制，阐述该类分子及相关信号通路作用，为进一步提取关键药物化合物提供理论基础。
方法：运用中药数据库分析平台TCMSP筛选五苓散的活性成分及对应靶点，整合Gene Cards，OMIM和DigSee疾病数据库得到骨关节炎相关靶点，将两者运用Venny平台进行映射交集得到五苓散治疗骨关节炎的潜在作用靶点。利用 Cytoscape 软件构建五苓散治疗骨关节炎的“单味药-活性成分-作用靶点”网络和蛋白质相互作用网络，并使用 David 数据库对五苓散治疗骨关节炎的作用靶点进行GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析，最后运用PyMOL等软件对五苓散的关键活性成分与关键靶点进行分子对接验证。
结果与结论：①共筛选得到五苓散“单味药-活性成分-作用靶点”活性成分包括β-谷甾醇、儿茶素及花旗松素等52个；②蛋白互作分析提示五苓散治疗骨关节炎关键靶点26个，包括可促进软骨细胞增殖，并抑制相关炎性细胞因子表达的雌激素受体1，参与骨关节内炎症反应的肿瘤蛋白p53以及介导细胞凋亡的泛素连接酶CUL3蛋白等；③分子对接结果显示亲和力最低的儿茶素和NTRK1进行分子对接良好，表明预测的五苓散的关键活性成分与治疗骨关节炎的关键作用靶点具有较好的结合活性；④GO富集分析得到GO条目共709个，包括生物过程649个，细胞成分22个和分子功能38个，主要涉及对机体雌激素、炎症和脂多糖的反应；⑤KEGG通路富集分析得到关键蛋白模块的相关通路，包括参与软骨细胞氧化应激、炎症及细胞凋亡过程的AGE-RAGE、白细胞介素17、肿瘤坏死因子、p53及影响软骨细胞增殖与修复的雌激素信号通路等；⑥结果证实，五苓散内具有的活性化合物β-谷甾醇、儿茶素、花旗松素和常春藤皂苷可能通过调节雌激素受体1、TP53、CUL3和MCM2相关蛋白靶点的表达，调控相关信号通路，从而发挥减缓软骨细胞凋亡、加强软骨细胞增殖修复及减轻炎症反应的作用。

https://orcid.org/0000-0002-2572-0229 (章晓云)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: ">骨, 软骨, 骨关节炎, 中药, 分子, 炎症, 细胞, 增殖, 凋亡, 网络药理学

Abstract: BACKGROUND: Wuling power has an effective effect in the clinical treatment of knee arthritis, but its pharmacological effects, but its molecular mechanisms and drug active components are not yet clear.
OBJECTIVE: Based on the network pharmacology method, the potential molecular mechanism of Wuling powder in the treatment of osteoarthritis was explored, and the role of these molecules and related signaling pathways was elaborated, providing a theoretical basis for further extraction of key drug compounds.
METHODS: TCMSP was used to screen the active components and corresponding targets of Wuling powder, and Gene Cards, OMIM and DigSee disease databases were integrated to obtain the related targets of osteoarthritis. The potential targets of Wuling powder in the treatment of osteoarthritis were obtained by mapping and intersection on the Venny platform. The network of “single drug-active component-interaction target” and protein-protein interaction network of Wuling powder in the treatment of osteoarthritis were constructed by using the software of Cytoscape, and the functional enrichment analysis of GO and the enrichment analysis of KEGG pathway of Wuling powder in the treatment of osteoarthritis were carried out by using David database. Finally, the key active components and key targets of Wuling powder were verified through molecular docking by using PyMOL and other software.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 52 active ingredients including β-sitosterol, catechin and taxifolin were screened. The protein-protein interaction analysis indicated that there were 26 key targets of Wuling powder in the treatment of osteoarthritis, including estrogen receptor 1 (ESR1), which can promote the proliferation of chondrocytes and inhibit the expression of related inflammatory cytokines, tumor protein p53 (tumor protein), which is involved in the inflammatory reaction of osteoarthritis p53, and ubiquitin ligase CUL3 (cullin3) that mediates apoptosis. The results of molecular docking showed that catechin with the lowest affinity and NTRK1 had a good molecular docking, indicating that the predicted key active components of Wuling powder have a good binding activity with the key targets of osteoarthritis treatment. There were 709 GO items in total, including 649 biological processes, 22 cell components and 38 molecular functions, which are mainly involved in the response to estrogen, inflammation and lipopolysaccharide. KEGG pathway enrichment analysis showed that the related pathways of key protein modules included AGE-RAGE signaling pathway, interleukin-17 signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, p53 signaling pathway, and estrogen signaling pathway, which are involved in the process of oxidative stress, inflammatory response and apoptosis of chondrocytes. The results showed that the active compounds β-sitosterol, catechin, taxifolin and hederagenin in Wuling powder could regulate relevant signaling pathways by regulating the expression of ESR1, TP53, CUL3 and MCM2 related protein targets, which can slow down the apoptosis of chondrocytes, strengthen the proliferation and repair of chondrocytes, and reduce the inflammatory response.

Key words: ">bone, cartilage, osteoarthritis, traditional Chinese medicine, molecule, inflammation, cell, proliferation, apoptosis, network pharmacology

中图分类号:

宋世雷, 陈跃平, 章晓云, 李时斌 , 赖渝, 周毅. 五苓散治疗骨关节炎潜在分子机制及网络药理学与分子对接[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3185-3193.

Song Shilei, Chen Yueping, Zhang Xiaoyun, Li Shibin, Lai Yu, Zhou Yi. Potential molecular mechanism of Wuling powder in treating osteoarthritis based on network pharmacology and molecular docking[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(20): 3185-3193.

图/表（结果） 11

2.1 活性化合物的筛选结果利用TCMSP数据库检索共收集得到五苓散的化学成分436个，其中茯苓、猪苓、泽泻、桂枝和白术分别为44，41，61，220和70个，根据设定的OB≥30%与DL≥0.18的筛选标准进行筛选，得到复方中共50个活性化学成分，猪苓、茯苓、白术、泽泻和桂枝的活性成分分别为11，15，7，10和7个，其中茯苓和猪苓有2个交集化合物，桂枝和猪苓有1个交集化合物，活性成分的基本信息见表1。

2.2 五苓散治疗骨关节炎潜在作用靶点预测通过TCMSP数据库得到五苓散中活性成分靶点52个；通过检索Gene Cards，OMIM和DigSee数据库，共获得骨关节炎相关靶点2 854个，运用平台取得共有基因26个，即五苓散治疗骨关节炎的潜在作用靶点，见图1。

2.3 “单味药-活性成分-作用靶点”网络根据上述分析所得的潜在作用靶点的预测结果，运用Cytoscape软件中的“merge”功能构建“五苓散单味药-活性成分-作用靶点”网络，见图2。网络总共包括48个节点(22个活性成分节点和26个靶点节点)和60条边，不同颜色的椭圆形代表不同的药物，每条边表示单味药活性成分与作用靶点之间的关系。同时构建“五苓散治疗骨关节炎的调控网络”，见图3。该网络中度值排名前5位的化合物分别是β-谷甾醇(beta-sitosterol)、儿茶素(catechin)、花旗松素(taxifolin)、3β-乙酰氧基苍术酮(3β-acetoxyatractylone)、常春藤皂苷(hederagenin)分别能与15，7，6，5，4个靶点连接，对治疗骨关节炎具有重要的意义，其基本信息见表2。

2.4 PPI网络及网络拓扑分析结果借助Bisogenet(Version 3.0.0)中的DIP，BIOGRID，HPRD，INTACT，MINT，BIND等各大数据库和Cytoscape软件来处理共有蛋白基因，初步得到一个2 738个节点、63 635条边的PPI网络图。再运用Cytoscape中的CytoNCA插件，以DC>61进行1次筛选，得到一个648个节点、26 153条边的 PPI网络图，再以Betweenness值(BC)>4 000进行2次筛选，得到一个12个节点、40条边的PPI网络图，其过程见图4。度值越高，在整个网络中起到的作用越大，度值排名前5的蛋白基因为神经营养酪氨酸受体激酶1(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1，NTRK1)、雌激素受体1(Estrogen Receptor 1，ESR1)、肿瘤蛋白p53(Tumor Protein p53，Tp53)、泛素连接酶CUL3蛋白(Cullin3，CUL3)微小染色体维持蛋白2(Minichromosome Maintenance Complex Component 2，MCM2)。这些度值较大的蛋白基因在整个网络中起着关键的作用。同时这些蛋白基因所对应的靶点可能是五苓散治疗骨关节炎的关键靶点。

2.5 GO和KEGG富集分析结果 GO富集分析得到GO条目(P < 0.05)共709个，包括生物过程(BP)649个、细胞成分(CC)22个和分子功能(MF)38个，并依据P值排序选取每个模块排名前20位的条目，见图5。最终结果提示，生物学过程的相关条目与对辐射的反应(response to radiation )、对雌二醇的反应(response to estradiol)、对抗生素的反应(response to antibiotic)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide )、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin )等有关；细胞成分的相关条目主要包括膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、线粒体外膜(mitochondrial outer membrane)、细胞器外膜(organelle outer membrane)等；分子功能的相关条目主要包括核受体活性(nuclear receptor activity)、转录因子活性(transcription factor activity)、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)等。

KEGG通路富集分析共得到91条通路，根据P值排序，选取前20位的条目，见图6。关键蛋白模块的相关通路主要涉及AGE-RAGE信号通路(AGE?RAGE signaling pathway in diabetic complications)、雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、白细胞介素17信号通路(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)和p53信号通路(p53 signaling pathway)等。

2.6 KEGG关系网络构建结合五苓散成分-靶点网络、核心靶蛋白PPI网络，将上述可能参与到骨关节炎过程的前20条KEGG信号通路进行数据及属性文件编排，通过Cytoscape 3.7.2软件得到“KEGG关系网络图”，见图7。结果可以明显看出五苓散的各有效成分是通过多靶点、多信号通路共同起到治疗骨关节炎的作用，其中天冬氨酸蛋白水解酶3(CASP3)、Bax蛋白、BcL2蛋白、人源全长重组蛋白(RELA)和天冬氨酸蛋白水解酶8(CAPS8)为主要靶点蛋白。

2.7 分子对接结果一般认为配体与受体结合越稳定结合能越低，发生作用的可能性越大，以结合能≤?5.0 kJ/mol作为标准，对预测的关键活性成分和关键靶点进行分子对接验证。分子对接结果显示五苓散的关键活性成分与关键靶点对接的亲和力远小于?5.0 kJ/mol，由此表明预测的五苓散的关键活性成分与治疗骨关节炎的关键作用靶点具有较好的结合活性，证明该研究的预测较为可靠，结果见表3。选取亲和力最低的儿茶素和NTRK1进行分子对接展示，见图8。

参考文献

[1] 贺自克,王上增,沈锦涛.基于Hedgehog通路探讨补肾活血方对实验性膝骨性关节炎兔退变软骨的保护作用[J].中国病理生理杂志,2020,36(4):700-706.
[2] 钱凯,杜彦仪,韩隆胤,等.基于网络药理学探讨五苓散治疗类风湿关节炎的作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2019, 25(19):138-146.
[3] ABRAMOFF B, CALDERA FE. Osteoarthritis: pathology, diagnosis, and treatment options. Med Clin North Am. 2020;104(2): 293-311.
[4] HAO DA C, XIAO PG. Network pharmacology: a Rosetta Stone for traditional Chinese medicine. Drug Dev Res. 2014;75(5): 299-312.
[5] 张彦琼,李梢.网络药理学与中医药现代研究的若干进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2015,29(6):883-892.
[6] 段贤春,黄石,彭代银,等.网络药理学在中药复方研究中的应用[J].中国药理学通报,2020,36(3):303-308.
[7] 曲凡,杨锡燕.五苓散合黄连解毒汤加减治疗难治性高血压的临床效果[J].中国老年学杂志,2020,40(4):692-694.
[8] 汝锦龙.中药系统药理学数据库和分析平台的构建和应用[D].咸阳:西北农林科技大学,2015.
[9] 胡聪,黎红维,吴琳静,等.基于网络药理学的苍耳散治疗鼻炎作用机制研究[J/OL].中华中医药学刊:1-19[2020-06-14]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1546.R.20200108.1307.019.html.
[10] 浦冬青,刘政,梁佳玮,等.基于网络药理学及分子对接探讨热毒宁注射液抑制新型冠状病毒肺炎炎症风暴机制[J/OL].中药药理与临床:1-17[2020-06-14]. https://doi.org/10.13412/j.cnki.zyyl.20200603.001.
[11] 廖姿,张家琼,付先芸,等.基于网络药理学的“大黄-桃仁”配伍治疗子宫腺肌病的作用机制研究[J/OL].中国中药杂志:1-10[2020-06-14]. https://doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm.20200520.403.
[12] 耿玮,梁巍,叶智斌,等.苍术酮对结直肠癌细胞HT29凋亡的机制[J].中成药, 2018,40(4):937-940.
[13] 孙东东,程海波,沈卫星,等.补肾活血方中5种黄酮类成分的体外抗炎活性[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(7):137-141.
[14] 曾莉萍,徐贤柱,饶华,等.杜仲叶β-谷甾醇对成骨细胞和卵巢颗粒细胞的影响[J].时珍国医国药,2012,23(5):1051-1053.
[15] 柳海平,周明旺,李盛华,等.骨关节炎软骨细胞增殖相关信号通路研究进展[J].中国矫形外科杂志,2018,26(23): 2163-2166.
[16] WANG YJ, ZHANG HQ, HAN HL, et al. Taxifolin enhances osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells partially via NF-κB pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2017;490(1):36-43.
[17] ZHANG HQ, WANG YJ, YANG GT, et al. Taxifolin Inhibits Receptor Activator of NF-κB Ligand-Induced Osteoclastogenesis of Human Bone Marrow-Derived Macrophages in vitro and Prevents Lipopolysaccharide-Induced Bone Loss in vivo. Pharmacology. 2019;103(1-2): 101-109.
[18] TIAN K, SU Y, DING J, et al. Hederagenin protects mice against ovariectomy-induced bone loss by inhibiting RANKL-induced osteoclastogenesis and bone resorption. Life Sci. 2020;244:117336.
[19] 李健,姚玉龙,张磊磊,等.雌激素在软骨中作用机制研究进展[J].中国矫形外科杂志,2016,24(23):2156-2159.
[20] MA H, WU W, YANG X, et al. Genetic effects of common polymorphisms in estrogen receptor alpha gene on osteoarthritis: a meta-analysis. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(8):13446-13454.
[21] HAYANO S, KOMATSU Y, PAN H, et al. Augmented BMP signaling in the neural crest inhibits nasal cartilage morphogenesis by inducing p53-mediated apoptosis. Development. 2015;142(7):1357-1367.
[22] 张国梁,王跃文,普日布苏荣,等.p53/miR-502-5p/TRAF2通路对骨关节炎软骨细胞损伤的影响[J].中国病理生理杂志, 2018,34(7):1283-1290.
[23] 庞琳娜,徐连那,董红宇.p53基因在类风湿关节炎骨代谢中的作用[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(3):327-330, 337.
[24] ZHAO Y, XIONG X, SUN Y. Cullin-RING Ligase 5: Functional characterization and its role in human cancers. Semin Cancer Biol. 2020. Doi:10.1016/j.semcancer.2020.04.003.
[25] 程庆华. Cullin-1调节骨肉瘤细胞增殖及转移机制研究[D].南京:南京医科大学, 2018.
[26] 郭会芹,赵焕,李楠,等.MCM2免疫细胞化学检测在宫颈癌筛查中的意义[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(16): 1213-1216.
[27] 刘畅,王娜,李玉坤,等.晚期糖基化终末产物对骨组织细胞代谢的影响[J].中国组织工程研究,2020,24(27):4376-4382.
[28] 黄文舟,王丽丽,殷嫦嫦,等.晚期糖基化终末产物通过氧化应激诱导大鼠软骨细胞损伤[J].中国病理生理杂志,2016, 32(11):2036-2042.
[29] 赵峻,马翅,杨娜娜,等.晚期糖基化终末产物致软骨细胞炎性反应的潜在机制[J].中国组织工程研究,2018,22(24): 3786-3791.
[30] LIU Y, PENG H, MENG Z, et al. Correlation of IL-17 level in synovia and severity of knee osteoarthritis. Med Sci Monit. 2015;21: 1732-1736.
[31] CHEN B, DENG Y, TAN Y, et al. Association between severity of knee osteoarthritis and serum and synovial fluid interleukin 17 concentrations. J Int Med Res. 2014;42(1): 138-144.
[32] BAI Y, GAO S, LIU Y, et al. Correlation between Interleukin-17 gene polymorphism and osteoarthritis susceptibility in Han Chinese population. BMC Med Genet. 2019;20(1):20.
[33] WANG Z, ZHENG C, ZHONG Y, et al. Interleukin-17 Can Induce Osteoarthritis in Rabbit Knee Joints Similar to Hulth’s Method. Biomed Res Int. 2017;2017: 2091325.
[34] KHOTIB J, UTAMI NW, GANI MA, et al. The change of proinflammatory cytokine tumor necrosis factor α level in the use of meloxicam in rat model of osteoarthritis. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2019. Doi: 10.1515/jbcpp-2019-0331.
[35] ABDEL GALIL SM, EZZELDIN N, FAWZY F, et al. The single-nucleotide polymorphism (SNP) of tumor necrosis factor α -308G/A gene is associated with early-onset primary knee osteoarthritis in an Egyptian female population. Clin Rheumatol. 2017; 36(11):2525-2530.
[36] KOU S, WU Y. Meta-analysis of tumor necrosis factor alpha -308 polymorphism and knee osteoarthritis risk. BMC Musculoskelet Disord. 2014;15:373.
[37] ZHU X, YANG S, LIN W, et al. Roles of cell cyle regulators cyclin d1, cdk4, and p53 in knee osteoarthritis. Genet Test Mol Biomarkers. 2016;20(9):529-534.
[38] 周绪昌,邹军,吴伟.p53调控骨关节炎软骨细胞凋亡[J].中国生物化学与分子生物学报,2019,35(3):280-285.

引言

骨关节炎是一种以关节疼痛、功能障碍为主要表现的骨科常见疾病，在中医属于“痹证”范畴[1]，中国历代医家认为“风、寒、湿”三邪是该病的主要病因[2]，三者可侵犯体表，阻碍经络气血运行，如《黄帝内经》中“风寒湿三气杂至，合而为痹”。现代医学发现骨关节炎发病机制为多种因素引起关节软骨退化及关节边缘炎性增生，西医主要以非类固醇类抗炎药、降钙素及二膦酸类药物进行消炎镇痛、改善关节功能为主，但上述药物的长期使用会对机体骨质、胃肠道及心血管造成损伤，具有一定的治疗局限性[3]。而中医中药具有药物毒性低、疗效确切的优势，但方剂中药种类较多，中药有效成分又过于复杂，这加大了通过药理实验研究复方作用机制的难度与经费消耗，限制了中药治疗骨关节炎的研究发展[4]。
网络药理学作为一门新学科被广泛运用于研究中药治疗疾病潜在的分子机制，它通过药物-基因-疾病多层次的网络中药机制分析，系统预测中药对致病基因潜在的药效靶点，科学阐述中药可能在疾病中的作用方式，为中药治疗疾病提供理论基础支持，这极大降低了科研难度与经费耗损，促进中医药事业的推广[5-6]。
五苓散源于《伤寒杂病论》，该方以泽泻为君，利水渗湿；以茯苓猪苓为臣，增强君药利水渗湿之力，以白术、桂枝为佐，既健脾利湿，又助阳化气，温经通络 [7]。因此骨关节证属“风、寒、湿”三者都可在五苓散加减的基础上进行治疗，并且目前临床运用五苓散治疗膝关节炎疗效确切，但其药理作用、分子机制及药物活性物质尚未明确，因此通过网络药理学对五苓散治疗骨关节炎的作用机制进行系统、整体研究，为五苓散治疗骨关节炎提供一定理论基础支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 活性成分的筛选文章通过使用中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)查询猪苓、茯苓、白术、泽泻与桂枝五味中药化学成分，设定口服生物利用度(OB≥30%)和药物相似性(DL≥0.18)的标准筛选各味中药的关键活性成分，建立五苓散生物活性成分的集合[8]。
1.2 活性成分靶点的预测利用TCMSP数据库查询五苓散各个活性成分对应的靶蛋白，并通过蛋白数据库(UniProt)(https://www.uniprot.org/)以选择物种为“人类(Homo Sapiens)检索，获取各个靶蛋白所对应的靶基因名，建立获取的靶基因名合集，删除重复基因，所得结果即为五苓散活性成分的靶点[9]。
1.3 骨关节炎治疗靶点的预测以“骨关节炎”的英文“Osteoarthritis”为关键词分别在Gene Cards (http://www.genecards/)，OMIM(https://omim.org/)和DigSee (https://digsee.com/en/)疾病数据库检索相关靶点，整合3个数据库的查找结果并删除重复项，最后所得靶点即为骨关节炎的相关靶点。
1.4 潜在作用靶点的预测将五苓散中活性成分的靶点和骨关节炎的相关靶点上传至Venny平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行映射取交集，获得五苓散治疗骨关节炎的潜在作用靶点。
1.5 “单味药-活性成分-作用靶点”网络的构建构建单位药活性成分及其作用靶点、靶点与骨关节炎的相互作用关系，并导入到Cytoscape 3.7.2 软件(http://www. cytoscape.org/)，通过Cytoscape 软件中“merge”工具将五苓散各个中药的网络进行合并，形成五苓散治疗骨关节炎的“单味药-活性成分-作用靶点”网络图及“五苓散治疗骨关节炎的调控网络”[10-11]。
1.6 PPI网络的构建及网络拓扑分析
Bisogenet (Version 3.0.0)是基于Cytoscape的一个新的基因网络构建、可视化和分析工具，搭载DIP，BIOGRID，HPRD，INTACT，MINT和BIND等分析蛋白质之间相互作用的数据库。为了进一步研究五苓散的作用机制，将五苓散的作用靶点导入到Bisogenet中，限定研究物种为“Homo Sapiens”获得蛋白互作关系，并运用Cytoscape中的CytoNCA插件，设置degree值(DC)>61和Betweenness值(BC)>200，进行筛选富集程度高的蛋白互作关系，构建PPI核心网络图。
1.7 GO富集分析与KEGG富集分析通过DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)对潜在靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析，分别研究五苓散治疗骨关节炎的主要生物功能与主要信号通路，其中P < 0.05代表富集结果显著，并通过R语言软件制作GO富集分析图及KEGG富集分析气泡图。
1.8 KEGG关系网络构建先分别建立通路、基因相互作用关系和节点属性、基因相互作用关系，并导入Cytoscape 3.7.2 软件(http://www. cytoscape.org/)中，选取前20个KEGG信号通路，构建五苓散治疗骨关节炎的“KEGG-基因”的关系网络图。
1.9 主要观察指标 ①主要的单味药-活性成分-作用关键化合物成分；②PPI网络及网络拓扑分析后五苓散关键蛋白基因；③筛选后关键基因在KEGG和GO富集的结果；④关键基因与关键化合物分子对接结果。

讨论

文章通过对五苓散进行靶点筛选发现单味药-活性成分-作用靶点网络显示β-谷甾醇、儿茶素、花旗松素、3β-乙酰氧基苍术酮、常春藤皂苷能匹配到较多的靶点，可能是五苓散治疗骨关节炎的关键成分。3β-乙酰氧基苍术酮作为白术提取物的一种挥发油，虽然目前缺乏3β-乙酰氧基苍术酮相关研究报道，但是有研究发现另一种白术提取挥发油类物质苍术酮可以通过刺激PI3K/AKT通路影响下游mTOR信号因子[12]，调节细胞凋亡的发生，而作为同类物质的3β-乙酰氧基苍术酮可能也存在相关机制对细胞凋亡与炎症反应有一定影响。有实验研究发现儿茶素可以抑制炎症因子白细胞介素6与一氧化氮在大鼠细胞内的表达，阻碍炎症在骨关节内的发生，起到保护关节软骨细胞的作用[13]。有研究发现β-谷甾醇可通过刺激成骨细胞骨保护素mRNA表达促进成骨作用，同时下调破骨细胞分化因子的分泌抑制破骨作用达到护骨效果，并且作用卵巢颗粒细胞，上调雌二醇的表达[14]，而雌激素水平的下降是造成骨关节炎的关键原因之一已被多个研究证实[15]。然而花旗松素虽作为一种植物雌激素，却不能刺激雌激素受体通路作用于成骨细胞，但是它不仅可提升成骨细胞活性因子的表达，还可抑制肿瘤坏死因子α作用下核转录因子κB的核移位，阻止核转录因子κB对骨细胞的破坏作用[16]，并且随着对花旗松素的进一步研究，发现它抑制人骨髓巨噬细胞核转录因子κB配体诱导的破骨作用受体，抑制体内脂多糖诱导的骨丢失[17]。目前对常春藤皂苷的研究较少，但有研究发现它可减少骨表面破骨细胞数量和活性[18]，并认为它是通过减弱RANKL诱导的细胞内活性氧产生和降低MAPK信号通路(ERK和p38)激活，抑制下游c-Fos和NFATc1的诱导的骨丢失途径实现的，但是尚未有更多的研究对其进行佐证。
蛋白互作网络表明ESR1，Tp53，CUL3和MCM2可能是五苓散治疗骨关节炎的关键靶点。骨关节炎主要由软骨细胞凋亡、炎性因子及相关水解蛋白破坏软骨细胞引起的，而上述4个蛋白对这一病因有着各自不同的关联。在雌激素内分泌系统中，雌激素受体1是信号转导途径中必不可少的介质，以往体外和体内实验都报道了激素受体1是对软骨细胞的潜在保护作用，其主要通过刺激生长因子如转化生长因子β、胰岛素样生长因子1的表达促进软骨细胞增殖，并抑制相关炎性细胞因子如白细胞介素1，6和肿瘤坏死因子α的分泌保护细胞不被破坏，它还可调节影响关键软骨形成相关蛋白基质金属蛋白酶(MMP)的表达[19]。另有研究认为骨关节炎的发生可能与激素受体1是基因的突变有关，激素受体1是基因单核苷酸多态性的变异是造成骨关节炎的因素之一，但通过循证医学方式发现此结论存在争议，需要更进一步的实验去证实[20]。而p53是肿瘤抑制基因的原型，最初发现被视作为与SV-40病毒的T抗原共沉淀的53-kD核磷蛋白，它对细胞周期，DNA修复，诱导细胞凋亡具有调控作用[21]。近年来有研究发现p53对炎性因子白细胞介素6具有抑制作用，可减轻软骨损伤，并抑制基质金属蛋白酶的活性，使其侵袭活性丧失，达到治疗骨关节炎的作用[22-23]。CUL1是Cullin基因组中成员之一，是泛素连接酶E3复合体的核心成分，CUL1蛋白所组装的复合体SCF(Skp-Cull-F box蛋白)是一个多亚基蛋白质复合物，具有典型的泛素连接酶活性，可介导许多细胞周期如癌细胞相关蛋白的凋亡降解过程[24]。有研究发现在骨肉瘤细胞中，当Cullin 1高表达时基质金属蛋白酶9的表达也随之升高[25]，反之则降低，这说明Cullin1对基质金属蛋白酶9有调控作用，而基质金属蛋白酶蛋白优势细胞降解蛋白，会加速细胞的凋亡，而这一结果也可能发生在骨关节炎软骨细胞中。MCM2是微小染色体维持蛋白家族成员之一，具有高度保守性，它在DNA复制过程中作为解旋酶对细胞增殖起着重要的作用，MCM蛋白表达的下调会引起细胞增殖能力的丢失，并且MCM mRNA 水平会跟随细胞周期变化而变化[26]。
从富集分析结果可知，在五苓散治疗骨关节炎的过程中主要涉及的信号通路为AGE-RAGE信号通路、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、p53信号通路，这与软骨细胞的增殖修复、细胞凋亡与炎症机制的形成有紧密联系。晚期糖基化终末产物(AGEs)作为一种异质性生物大分子，是由葡萄糖、氨基酸及脂肪通过非酶糖基化反应形成的不可逆的终末期产物，被认为是加快人体衰老及关节慢性退化的原因之一。近些年的研究表明当晚期糖基化终末产物与其特异性受体(RAGE)结合会促进氧化应激及炎性反应[27]，导致机体产生病理改变(包括细胞的增生与坏死)，黄文舟等[28]的动物实验中发现晚期糖基化终末产物通过氧化应激诱导大鼠软骨细胞损伤，它主要上调了软骨细胞凋亡相关分子Bax/Bcl-2 和caspase-3水平的，并增加体内基质金属蛋白酶3，13表达及Ⅱ型胶原含量，而基质金属蛋白酶(MMPs)会引起胶原蛋白的分解，破坏胶原蛋白结构的稳定性，导致软骨弹性下降，增加关节磨损可能。而赵骏等[29]通过观察晚期糖基化终末产物对人关节软骨细胞炎性因子、基质降解因子表达及核因子κB活化水平的影响，发现当提升晚期糖基化终末产物浓度时，可诱导人关节软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1α，1β以及软骨细胞核中核因子κB p65表达增多，该类因子的表达升高也可破坏软骨细胞外基质，然而上述因子的表达也可通过上调核因子κB的表达实现，因此认为骨关节炎的发生可AGE/RAGE/核转录因子κB有关。
白细胞介素17作为一种由CD4+T细胞分化的T辅助17细胞产生的促炎性细胞因子，与骨关节炎发生有密切关联。有研究发现骨关节炎患者膝关节白细胞介素17含量明显高于正常膝关节，白细胞介素17与骨关节炎的疼痛水平和严重程度成正比[30-31]，BAI等[32]比较骨关节炎患者与正常人血清和滑膜液中白细胞介素17的水平与骨关节炎严重程度与上述研究结果一致。目前已证实白细胞介素17有5个受体(白细胞介素17RA-RD和SEF)和6个成员(白细胞介素17A-F)，当白细胞介素17与其受体结合会刺激成纤维细胞和上皮细胞释放白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6，8，并与上述炎症因子协同作用，上调促进软骨基质降解的多种因子表达，如基质金属蛋白酶和一氧化氮等，加快软骨细胞损伤[33]。因此激活白细胞介素17信号通路可能会加快软骨细胞的凋亡，加重关节炎的严重程度。
骨关节炎的发生机制可能与炎症因子如C-反应蛋白、白细胞介素和肿瘤坏死因子家族成员在关节中高表达有关。其中肿瘤坏死因子α作为一种促炎细胞因子，可由软骨细胞，单核细胞，成骨细胞和滑膜组织产生的，并诱导软骨细胞和滑膜细胞自身产生其他细胞因子，参与炎症、免疫调节、增殖和凋亡等多种生理病理过程[34]。肿瘤坏死因子α的作用机制较为广泛，它可与其受体结合抑制细胞外基质的主要成分连接蛋白和Ⅱ型胶原的合成；它还可刺激促炎和促代谢介质的合成，如基质金属蛋白酶1，3，13，白细胞介素6，8等，这些介质具有引起关节炎症、诱导发热、降解软骨基质蛋白的能力，此外当阻断肿瘤坏死因子α受体可抑制软骨中一氧化氮的产生，而一氧化氮他是滑膜组织中潜在的凋亡介质[35-36]，这说明肿瘤坏死因子α信号通路引发骨关节炎的作用具有多机制特点，而寻找调控该信号通路治疗骨关节炎的发病是治疗新思路。
p53抑癌基因是细胞凋亡的重要调节因子，当细胞DNA受损时，p53蛋白在G1/S界面停止生长，直到损伤修复，如果损伤严重，p53提高在组织内的表达诱导细胞凋亡，有研究证实骨关节炎的发生与软骨细胞p53信号高表达有关[37]。但目前p53的细胞凋亡相关信号通路尚未明确，有学者认为p53作用机制主要为上调凋亡因子Bax表达[38]，加速细胞内线粒体凋亡，而p53信号表达的上调又受多种因素影响如细胞内活性氧、一氧化氮/p38/核转录因子κB信号、MAPK信号通路等。这说明调节p53在骨关节炎中的表达需要抑制上述因素相关蛋白的基础上，降低Bax的表达。
综上所述，文章利用网络药理学及分子对接技术对五苓散治疗骨关节炎的潜在活性成分、靶点、信号通路和作用机制等进行了分析，结果表明五苓散内的活性化合物β-谷甾醇、儿茶素、花旗松素和常春藤皂苷可能通过影响雌激素受体1、Tp53、CUL3和MCM2相关蛋白靶点的表达，调控AGE-RAGE、白细胞介素17、肿瘤坏死因子和p53信号通路对软骨细胞的增殖、修复、凋亡及细胞炎症反应的影响，发挥减缓软骨细胞凋亡、加强软骨细胞增殖修复及减轻炎症反应的作用，这为五苓散治疗骨关节炎的临床应用提供参考依据，同时为进一步深入研究和实验设计的优化提供新的思路和方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

五苓散治疗骨关节炎潜在分子机制及网络药理学与分子对接

Potential molecular mechanism of Wuling powder in treating osteoarthritis based on network pharmacology and molecular docking

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[4]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[5]	袁家威, 张海涛, 揭珂, 曹厚然, 曾意荣. 基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1428-1433.
[6]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[7]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[8]	刘志超, 张帆, 孙旗, 康晓乐, 袁巧妹, 柳根哲, 陈江. 不同静水压下人椎间盘髓核细胞的形态和活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1172-1176.
[9]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[10]	李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.
[11]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[12]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[13]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[14]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[15]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.