调控骨质疏松模型小鼠的ERK5蛋白信号通路

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2955

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (2): 178-185.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2955

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调控骨质疏松模型小鼠的ERK5蛋白信号通路

耿彬1，2，夏亚一1，2

1兰州大学第二医院关节外科，甘肃省兰州市 730000；2甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2020-03-10 修回日期:2020-03-14 接受日期:2020-04-15 出版日期:2021-01-18 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 夏亚一，博士，教授，主任医师，博士生导师，兰州大学第二医院关节外科，甘肃省兰州市 730000；甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃省兰州市 730000
作者简介:耿彬，男，1984年生，汉族，山西省交城县人，2013年兰州大学毕业，博士，硕士生导师，主要从事关节外科方面研究和工作。
基金资助:
国家自然科学基金(81960403)；国家自然科学基金(81874017)

Involvement of ERK5 signaling pathway in osteoporosis development in mice

Geng Bin1, 2, Xia Yayi1, 2

1Department of Joint Surgery, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; 2Gansu Provincial Key Laboratory of Bone and Joint Disease Research, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2020-03-10 Revised:2020-03-14 Accepted:2020-04-15 Online:2021-01-18 Published:2020-11-21
Contact: Xia Yayi, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Joint Surgery, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Gansu Provincial Key Laboratory of Bone and Joint Disease Research, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Geng Bin, MD, Master’s supervisor, Department of Joint Surgery, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Gansu Provincial Key Laboratory of Bone and Joint Disease Research, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81960403; the National Natural Science Foundation of China, No. 81874017

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
ERK5(Extracellular signal regulated kinase 5)：是MAPK家族成员之一，其发现较晚(1995年才发现)，是由2 451 bp 的开放阅读框架编码816 个氨基酸形成的蛋白质，ERK5 不同于其他MAPK 激酶的一个特点就是拥有一个巨大的羧基端。ERK5 磷酸化后并不能直接参与调节下游的信号转录，必须要经过核转位进入细胞核内才能发挥正常的功能。ERK5对于机械刺激、应激反应、氧化应激、高渗环境、细胞因子、炎性因子等均敏感，是维持细胞正常功能较重要的一类蛋白分子，不过目前对其的研究较少。
XMD8-92：是一种ERK5的高效特异性抑制剂，可以抑制体外实验中EGF诱导的ERK5激活，而且在体内实验中不会导致实验小鼠的死亡，可以被用于体内实验。有研究表明XMD8-92在肺癌、宫颈癌和胰腺肿瘤动物模型中能够阻断ERK5的活化，显著抑制肿瘤生长，不过尚未见在骨质疏松症的研究中有过报道。

背景：虽然ERK5对于成骨细胞的生存、增殖和分化十分重要，但其对于骨组织骨代谢平衡的具体作用还不清楚。
目的：证实通过高选择性ERK5活性抑制剂XMD8-92抑制ERK5活性及其下游靶因子，将导致小鼠发生骨质疏松并加重地塞米松诱导的骨质疏松症。
方法：①体内实验：地塞米松诱导建立骨质疏松症小鼠模型。实验分4组：空白对照组(PBS)：XMD8-92组(50 mg/kg)；地塞米松组(50 mg/kg)；XMD8-92(50 mg/kg)+地塞米松(50 mg/kg)组，连续给药5周。②细胞实验：实验分为空白对照组；XMD8-92组(5 μmol/L)；地塞米松组(10×10-6 mol/L)；XMD8-92+地塞米松组(先后使用5 μmol/L XMD8-92和10×10-6 mol/L的地塞米松)，均孵育1 h；另外，使用表皮生长因子进行ERK5激活诱导。③检测小鼠体内和MC3T3-E1细胞内ERK5的活性；进行小鼠的骨量、骨小梁相关参数、机械应力测试及组织学观察；检测MC3T3-E1细胞中核因子κB受体活化因子配体/骨保护素的蛋白表达及XMD8-92在成骨细胞增殖和凋亡中的作用。实验已经过兰州大学第二医院伦理委员会审查通过(伦理审查批件：2016-D44)。
结果与结论：①XMD8-92可以明显抑制表皮生长因子诱导的成骨细胞内ERK5激活；②XMD8-92改变了骨组织微结构，出现骨量减少和更加严重的地塞米松诱导的骨质疏松症；③XMD8-92能够明显降低小鼠骨组织的生物力学性能；④XMD8-92能够上调核因子κB受体活化因子配体/骨保护素比率、通过抑制Cyclin B1和CDK1的蛋白表达来降低成骨细胞增殖活性以及上调FasL蛋白表达进而促进成骨细胞凋亡；⑤研究表明，ERK5蛋白信号在维持骨量中起着重要的作用，尤其是在骨质疏松或糖皮质激素性骨质疏松症等疾病条件下ERK5活性的改变应被视为骨代谢平衡异的重要原因之一。

https//orcid.org/0000-0002-1505-3645 (耿彬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 骨质疏松, 骨量, 通路, 因子, 蛋白, 鼠, 实验

Abstract: BACKGROUND: Although extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) is an essential transducer of external signals for osteoblasts growth, differentiation, and survival, the effects of ERK5 signaling on bone homeostasis in vivo have not yet been described.
OBJECTIVE: To elucidate whether the inhibition of ERK5 activity and its downstream targets by XMD8-92 results in osteoporosis and aggravates dexamethasone-induced osteoporosis.
METHODS: In vivo experiment: A mouse model of osteoporosis was induced by dexamethasone. There were four groups: blank control group (PBS); XMD8-92 group (50 mg/kg); dexamethasone group (50 mg/kg); XMD8-92+dexamethasone group (50 mg/kg XMD8-92 plus 50 mg/kg dexamethasone). Administration was done for 5 continuous weeks. Cell experiment: There were four groups: blank control group; XMD8-92 group (5 μmol/L); dexamethasone group (10×10-6 mol/L); XMD8-92+dexamethasone group (treatment with 5 μmol/L XMD8-92 followed by 10×10-6 mol/L dexamethasone). Cells were incubated for 1 hour. In addition, ERK5 activation was induced using epidermal growth factor. ERK5 activity in mice and MC3T3-E1 cells were detected. We further detected bone mass, bone architecture and mechanical stress of the trabecular bone, measured the expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand/osteoprotegerin (RANKL/OPG) and observed the roles of XMD8-92 in osteoblast proliferation and apoptosis. The study protocol was approved by the Ethics Committee of the Second Hospital of Lanzhou University (No. 2016-D44).
RESULTS AND CONCLUSION: XMD8-92 could block ERK5 phosphorylation, change the architecture of the trabecular bone, reduce bone mass and aggravate dexamethasone-induced osteoporosis. XMD8-92 could significantly reduce the biomechanical properties of bone tissues in mice. XMD8-92 could up-regulate RANKL/OPG rate, lower osteoblasts vitality by inhibiting Cyclin B1 and CDK1 expression, and promote osteoblast apoptosis by up-regulating the expression of FasL. The novel findings suggest that ERK5 activity plays an important role in maintenance of bone mass, and altered ERK5 activation in disease conditions such as osteoporosis or dexamethasone-induced osteoporosis should be considered as a potential mechanism for abnormal bone homeostasis.

Key words: bone, osteoporosis, bone mass, pathway, factor, protein, mouse, experiment

中图分类号:

耿彬, 夏亚一. 调控骨质疏松模型小鼠的ERK5蛋白信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 178-185.

Geng Bin, Xia Yayi. Involvement of ERK5 signaling pathway in osteoporosis development in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(2): 178-185.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用昆明小鼠12只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 小鼠体内和MC3T3-E1细胞内ERK5的活性在小鼠体内腹腔注射XMD8-92，骨组织内的ERK5磷酸化水平被明显抑制，见图1 A，B。以往的研究证实ERK5能够被表皮生长因子所激活[30]，而且以往的研究证实XMD8-92的最佳浓度为5 μmol/L，且不会影响其他MAPK信号通路[14]，此次体外实验表明XMD8-92可以明显抑制表皮生长因子诱导的成骨细胞内ERK5激活，见图1 C，D。
XMD8-92作用于MC3T3-E1细胞的免疫荧光染色结果显示XMD8-92可以明显抑制ERK5核移位的亚细胞转位，见图1E。因为磷酸化的ERK5会转移至核内调控下游靶因子表达[14]，XMD8-92可以阻断这一过程，进一步证实XMD8-92可以抑制成骨细胞内ERK5的活性。

2.3 小鼠的骨量及骨小梁相关参数变化小鼠被腹腔注射XMD8-92和/或地塞米松。μ-CT分析显示XMD8-92干预后导致小鼠股骨骨小梁的结构变稀疏，见图2。与对照组相比，骨密度定量显示XMD8-92可使股骨松质骨密度减少约11.4% (P < 0.01，见图2B)。骨体积分数、骨小梁数、骨小梁厚度也分别降低了8.0%、10.7%和5%，而骨小梁离散度和骨小梁模式因子分别增加了17.3%和20.3%(见图2 C-G)。这些结果表明，XMD8-92处理后的小鼠骨体积更小，骨小梁数目和厚度更少，且骨小梁间隙更大。
另外，腹腔注射过量的地塞米松 5周后成功建立小鼠骨质疏松症模型，结果提示XMD8-92能够显著加重塞米松诱导的骨质疏松症(见图2A)。XMD8-92+地塞米松诱导的小鼠股骨骨密度显著降低(-19.4%，P < 0.01)，骨体积分数降低(-20.2%，P < 0.001)，骨小梁数降低(-16.0%， P < 0.001)，骨小梁厚度(-22.6%，P < 0.001)，但骨小梁离散度和骨小梁模式因子增加(+20.6 和+22.5，P < 0.001，见图2 C-G)。
同样，苏木精-伊红染色结果也显示XMD8-92处理后的小鼠、地塞米松处理后的小鼠和XMD8-92+地塞米松诱导后的小鼠其股骨均出现不同程度的骨质流失，见图2 H-O。
结果表明，抑制ERK5活性能够降低小鼠的骨量，并加重地塞米松诱导的骨质疏松症。

2.4 小鼠骨组织的力学性质变化见图3。XMD8-92能够明显降低小鼠骨组织的生物力学性能，如与对照组小鼠比较XMD8-92组断裂点的压力降低(-9.9%，P < 0.01，见图3 B，C)。此外，与地塞米松处理后的小鼠相比，XMD8-92+地塞米松处理后小鼠断裂点的压力降低了28.6%(P < 0.001，见图3 B，C)。

2.5 MC3T3-E1细胞中RANKL/OPG的蛋白表达 RANKL和骨保护素在骨重塑过程中起着重要作用，由成骨细胞合成并分泌，其表达量的变化能够反映出成骨细胞或破骨细胞的活性，间接显示骨形成和骨吸收的动态平衡关系，是检测骨质疏松症常用的生物学指标[1-3]。Western blotting结果显示XMD8-92和地塞米松显著提高了MC3T3-E1细胞中RANKL的蛋白水平(P < 0.05和P < 0.001，见图4 A和B)，而且XMD8-92能够进一步促进地塞米松诱导的RANKL上调(P < 0.001，见图4 A和B)。相反，XMD8-92和地塞米松明显下调了骨保护素蛋白的表达，且XMD8-92能够进一步促进地塞米松对骨保护素的下调作用 (P < 0.001，见图4 A和B)。结果提示，ERK5活性的抑制能够明显上调RANKL并下调骨保护素的蛋白表达，XMD8-92可以通过调控RANKL/OPG的蛋白表达来调节骨量的变化。

2.6 成骨细胞的凋亡和增殖结果 XMD8-92能够明显导致成骨细胞的凋亡，且会加重地塞米松诱导的成骨细胞凋亡(P < 0.001，见图5 A-D)。进一步的检测凋亡相关的下游靶标FasL的蛋白表达显示，XMD8-92通过抑制ERK5的磷酸化后，会促进FasL的表达(P < 0.001)，最终导致成骨细胞的凋亡。同时，XMD8-92+地塞米松处理后的成骨细胞的FasL表达量最高(P < 0.001)，也提示XMD8-92通过ERK5-FasL信号通路协同地塞米松促进成骨细胞的凋亡。见图5E和F。

MTT实验结果所示，XMD8-92抑制ERK5活性后，MC3T3-E1的增殖活性明显降低(见图6 A)。进一步的对ERK5信号下游的靶标进行检测显示XMD8-92能够降低成骨细胞内Cyclin B1和CDK1的蛋白表达(P < 0.001)，同时XMD8-92+地塞米松组中Cyclin B1和CDK1的蛋白表达量最低(P < 0.001，见图6 B，C)。一般地，细胞循环中的关键点能够调控细胞修复、细胞凋亡和增殖[33-34]，而Cyclin B1和CDK1是调控G2/M阶段的关键调控点[35-37]。因此，抑制ERK5活性会导致阻断G2/M期进展，最终导致细胞增殖活性降低。

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引言

骨组织是一个动态变化的器官，它的强度和结构是通过骨形成和骨吸收来维持平衡的[1]，这一过程被称为骨重塑，是由成骨细胞和破骨细胞进行调节的[2-3]。若骨吸收增加而骨形成减少，将导致骨丢失或骨质疏松症的发生[4]。
骨质疏松症，尤其是糖皮质激素性骨质疏松症(GCs-induced osteoporosis，GIO)，主要病因是由成骨细胞数量减少导致抑制骨形成，次要病因包括：成骨细胞的分化减少和凋亡增加，换句话说成骨细胞的功能在骨质疏松症发生发展中具有关键作用[5-6]。地塞米松是一种强效合成糖皮质激素，是一种免疫抑制剂，不良反应包括导致严重的骨量丢失(出现糖皮质激素性骨质疏松症) [5]。地塞米松能够显著降低成骨细胞数量和骨形成率，同时增加骨吸收和破骨细胞寿命[7-8]，最终导致糖皮质激素性骨质疏松症的发生。继绝经后妇女和高龄之后，糖皮质激素性骨质疏松症已成为导致骨量减少的第三大发病因素，且其中20%的患者最终发展为骨质疏松症[5]。因此，探索参与骨重塑的新细胞或分子机制将有助于为骨质疏松症或糖皮质激素性骨质疏松症的治疗提供新的理论依据。
在成骨细胞中，与骨质疏松症发生有关的分子靶点包括Wnt信号通路、Notch信号通路、骨形态发生蛋白信号通路、细胞生长因子、下游的激酶(ERK1/2、AKT、JNK)以及转录因子(AP-1、RUNX)等[5]。此外，临床研究表明绝经后骨质疏松或糖皮质激素性骨质疏松症伴有患者骨组织内脂肪细胞分化增多[9-10]。以往的研究表明机械应力能够促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖并抑制其凋亡，其中细胞外信号调节激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5)信号通路起着重要作用[11-14]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族包括ERK5、p38、ERK1/2和JNK。ERK5是在1995年新发现的MAPK家族成员[15-16]。激活后的ERK5能够将外部环境信号(机械负荷、氧化应激、生长因子和高渗透压等)转换为细胞的生物学效应(增殖、分化和凋亡)[17-20]。虽然ERK5对成骨细胞功能至关重要，但是ERK5信号通路对生物体内骨代谢的影响尚未见报道。
假设小鼠体内ERK5活性降低会导致骨量减少并加重糖皮质激素性骨质疏松症。事实上，ERK5基因敲除会导致小鼠胚胎性致死性[21-25]。XMD8-92(一种新的高选择性ERK5活性抑制剂)能够用于小鼠且不会导致其致死[26-27]。有研究表明XMD8-92在肺癌、宫颈癌和胰腺肿瘤动物模型中能够阻断ERK5的活化，显著抑制肿瘤生长[26，28]。在此次研究中，想要阐明XMD8-92是否会抑制ERK5活性及其下游靶点，从而导致小鼠骨质疏松症并加重地塞米松诱导的骨质疏松症(dexamethasone-induced osteoporosis，DIO)。因此，在小鼠腹腔内注射XMD8-92和/或地塞米松，并在体内外进一步检测XMD8-92对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)/骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的蛋白表达影响、成骨细胞增殖和凋亡的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞体外实验和动物体内实验。
1.2 时间及地点于2015年1月至2018年12月在兰州大学第二医院(甘肃省骨关节疾病研究重点实验室)内完成。
1.3 材料
1.3.1 实验用主要试剂和仪器 XMD8-92(R&D Systems，美国)，地塞米松磷酸钠注射液 (DEX，大连美仑生物，中国)；α-MEM培养基和胎牛血清(FBS，Life Technologies，美国)。抗体有：ERK5、骨保护素、RANKL、FasL、Cyclin B1、CDK1(Abcam，美国)， phospho-ERK5 Thr218/tyr220 (P-ERK5，Cell Signaling Technology，美国)；β-actin、PBS、0.1% Triton X-100、Hoechst33258(Sigma，美国)；二抗(Invitrogen，英国)；40 g/L多聚甲醛(苏州泽科生物有限公司，中国)；鼠源性重组表皮生长因子(EGF，Peprotech，美国)；DAPI、MTT、二甲基亚砜(索莱宝，中国)；TUNEL反应混合物(罗氏，德国)；双能X射线骨密度(DXA)测试仪(Discovery，Hologic，美国)；micro-computed Tomography(μ-CT，micro-CT Skyscan1176，比利时)；电子万能试验机(Shimadzu，日本)；酶标仪(Bio Tek，美国)；BCA蛋白测定系统(碧云天，中国)；VersaDoc可视化成像系统(Bio-Rad，美国)。
1.3.2 实验动物 6月龄SPF级雄性昆明系小鼠12只，由甘肃省中医药大学实验动物中心提供，许可证号SYXK (甘)2015-0005。
1.3.3 实验细胞 MC3T3-E1细胞系由国家实验细胞资源共享平台(北京协和细胞资源中心)提供。
1.4 实验方法
1.4.1 动物实验

(1)动物实验的干预和模型的建立：所有动物分笼饲养，每笼3只，实验环境标准化(12 h白天/黑夜循环，22 ℃室温)，避免噪声或者强光刺激，自由进食和饮水，实验前必须进行适应环境1周。为了观察ERK5蛋白在动物体内的作用，使用了骨质疏松症动物模型，该模型通过腹腔注射地塞米松实现，使用双能X射线骨密度(DXA)测试仪来进行骨质疏松模型鉴定，可以同时观察ERK5对正常动物的影响和对骨质疏松症动物的影响。实验分4组：空白对照组腹腔注射PBS；XMD8-92组腹腔注射XMD8-92(一种新的高选择性ERK5活性抑制剂，50 mg/kg)；地塞米松组腹腔注射地塞米松(50 mg/kg)；XMD8-92+地塞米松组腹腔注射XMD8-92(50 mg/kg)+地塞米松(50 mg/kg)[26，28-29]，1次/d，连续给药5周。随后，小鼠麻醉后被处死，并在6 h内收集骨组织(股骨)样本。实验已经过兰州大学第二医院伦理委员会审查通过(伦理审查批件：2016-D44)。

(2)双能X射线骨密度测定：在5周的不同干预后，使用双能X射线骨密度(DXA)测试仪进行检测。小鼠被麻醉后，俯卧位置于检测托盘上，使用小动物骨密度测试模块来进行检测，框取感兴趣的股骨区域进行检测骨密度。每只小鼠的双侧股骨均被检测，双侧股骨平均骨密度作为每个个体的骨密度进行后续统计分析。
(3)μ-CT 检测：在上述实验结束6 h内，麻醉小鼠被颈椎脱臼处死，使用micro-computed Tomography(μ-CT)进行小鼠股骨远端3D重建和骨小梁相关参数检测。骨小梁的测定参数有：相对骨体积或骨体积分数(bone volume fraction，BV/TV)，骨小梁数(trabecular number，Tb.N)，骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，骨小梁离散度(trabecular separation，Tb.Sp)，骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor，Tbpf)。
(4)组织学检测：在μ-CT 检测后，骨组织标本使用40 g/L多聚甲醛在4 ℃环境下固定2 d，10% EDTA脱钙1周，并石蜡包埋切片，进行苏木精-伊红染色。
(5)机械应力测试(三点弯曲实验)：使用电子万能试验机进行三点弯曲实验。在生物力学实验之前，所有股骨样本均置于室温下进行解冻，并且使用PBS 保持潮湿。股骨样本保持水平放置在三点弯曲实验模块上，均保持10 mm 的跨度，压缩负荷在股骨中点进行直接加载。压缩位移保持0.1 mm/s 的速度，直到出现完全骨折。断裂点压力负荷(Breaking force，MAX，N/mm2)代表完全骨折时的弯曲负荷。整个负荷变形曲线通过Trapezium X Materials测试软件(Shimadzu，日本)进行实时记录。
1.4.2 细胞实验
(1)细胞培养及施加干预：在体积分数5% CO2、37 ℃的环境下，使用完全培养基(含体积分数10%FBS，100 U/mL 青霉素和100 mg/L链霉素)培养小鼠源性MC3T3-E1 细胞，达到90%的细胞融合后，以1∶3 比例传代培养。使用胰蛋白酶消化细胞，每3 d传1代，取第3-6代细胞进行实验。实验分组：空白对照组；XMD8-92组：5 μmol/L XMD8-92孵育1 h；地塞米松组：10×10-6 mol/L的地塞米松孵育1 h；XMD8-92+地塞米松组：先后使用5 μmol/L XMD8-92和10×10-6 mol/L的地塞米松孵育1 h。
(2)MC3T3-E1 细胞体外ERK5活性的检测：为了检测XMD8-92对成骨细胞内ERK5活性的抑制作用，MC3T3-E1 细胞被加入5 μmol/L XMD8-92干预1 h后，使用表皮生长因子干预10 min进行ERK5激活诱导[30]。实验分为空白对照组；表皮生长因子组；XMD8-92组；XMD8-92 +表皮生长因子组。
(3)免疫组织荧光染色：MC3T3-E1细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100通透30 min。样本被3% BSA阻断30 min，4 ℃环境过夜孵育一抗，PBS漂洗3次后孵育二抗2 h，并使用DAPI复染细胞核。
(4)细胞凋亡检测：使用Hoechst 33258 染色和TUNEL染色来检测成骨细胞的凋亡。①Hoechst 33258染色凋亡细胞检测：细胞以5×108 L-1被接种在20×50 mm盖玻片上培养24 h。在XMD8-92和/或地塞米松干预后，PBS漂洗2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，在常温下暗室内使用Hoechst33258染色10 min，凋亡细胞表现为明亮的染色凝结核、凋亡小体或核碎片，最终测定凋亡细胞数占总细胞数的百分比；②TUNEL凋亡细胞检测：40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，在冰上使用透性溶液孵育2 min，再用TUNEL反应混合物在37℃湿温箱内干预2 h，使用580 nm的激发波长，在荧光显微镜下观察样品。有红色荧光的细胞被定义为凋亡细胞。
(5)细胞增殖活性测试(MTT实验)：细胞被种植于96 孔板(1×103 细胞/孔)，一式3份。在XMD8-92 干预后，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h。活细胞内的MTT 盐被裂解形成不能溶解的紫色formazan 结晶。然后每孔中加入二甲基亚砜，震荡10 min。使用酶标仪检测490 nm 的光吸收度。
(6)Western blot 检测：MC3T3-E1细胞在含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液(Beyotime Biotechnology, China)中裂解，离心澄清。骨组织提取物在含有1% Triton X-100和蛋白酶抑制剂的Tris缓冲盐水(200 mm NaCl和20 mm Tris-HCl)中裂解[31]。使用2种不同的方法来检测p-ERK5的水平，原因是在骨组织样本中蛋白水平较低，而细胞样本中蛋白水平则较高，因此使用不同的检测方法有助于提高结果的准确性。实验采用在MC3T3-E1细胞中ERK5的活性通过抗phospho-ERK5 (Thr218/tyr220)抗体直接检测，而在骨组织提取物中的ERK5活性通过迁移速率法进行检测的[26，32]。蛋白浓度采用BCA蛋白测定系统测定。使用8%-15% SDS-PAGE分离等量蛋白，电泳转移到PVDF膜上，在4 ℃条件下用一抗(ERK5、骨保护素、RANKL、FasL、Cyclin B1、CDK1， phospho-ERK5)孵育过夜。在TBST洗涤3次之后，PVDF膜与二次抗体一起孵育2 h。蛋白条带使用VersaDoc可视化成像系统成像。
1.5 主要观察指标 ①小鼠体内和MC3T3-E1细胞内ERK5的活性；②小鼠的骨量、骨小梁相关参数及组织学观察；③小鼠骨组织的力学性质变化；④MC3T3-E1细胞中RANKL/OPG的蛋白表达；⑤成骨细胞的凋亡和增殖结果。
1.6 统计学分析所有数据均以x±s来表示。MTT 分析使用双因素重复测量方差分析。其他统计分析使用单因素方差分析，两两比较使用LSD统计方法。P < 0.05 表示差异有显著性意义。使用SPSS 17.0 软件进行统计学分析。使用Sigma plot 12.5 软件进行统计图分析。使用Image-Pro 6.0 软件进行Western blotting 图像分析。

讨论

虽然体外细胞的研究表明ERK5信号蛋白参与了成骨细胞的生存、增殖和分化过程[11-14，38-39]，但其在体内实验或者在骨组织内环境稳定中的作用还未见相关报道。此次研究发现XMD8-92抑制小鼠骨组织内的ERK5活性将导致骨组织内骨量减少甚至出现骨质疏松症等不良后果。
由于ERK5基因敲除可导致小鼠胚胎致死，并伴有严重的心血管缺陷[21-25]，因此在体内检测ERK5蛋白信号的作用一直非常困难。不过，XMD8-92的出现解决了动物不耐受的问题，可以显著抑制小鼠体内的ERK5活性，且不会出现胚胎致死[26-27]。为了证实ERK5的活性是维持体内骨量所必需的这一科学假设，实验在体内和体外检测了XMD8-92和骨质疏松症(或塞米松诱导的骨质疏松症)之间的关系。此次研究的主要发现是：①XMD8-92通过抑制小鼠体内ERK5活性会导致骨量减少，甚至出现骨质疏松症；②ERK5活性的失活可以加重小鼠塞米松诱导的骨质疏松症。这些发现得到了以下实验结果的有力支持：①XMD8-92抑制了MC3T3-E1细胞和骨组织内的ERK5蛋白的磷酸化水平；②XMD8-92的干预会导致体内骨量减少和塞米松诱导的骨质疏松症的加重；③XMD8-92显著上调RANKL/OPG比率，并加剧地塞米松诱导的RANKL/OPG比率升高；④XMD8-92通过上调FasL表达促进成骨细胞凋亡，并促进地塞米松诱导的成骨细胞凋亡；⑤XMD8-92通过抑制Cyclin B1和CDK1信号表达来抑制成骨细胞增殖活力，并进一步降低地塞米松诱导的Cyclin B1和CDK1信号表达。
MAPK信号在将细胞外信号转化为生物学效应的过程中起重要作用，并能够调控各类细胞增殖、分化、凋亡等多种功能[40]。除了ERK5外，其他MAPK成员也能影响骨代谢平衡，比如：敲除成骨细胞和骨细胞内的p38α信号可以阻止雌激素缺陷引起的小鼠骨量减少[41]；MKK3和MKK6是p38的2个上游激酶，可以调节因雌激素分泌减少而引起的骨质疏松症[42]；在大鼠骨质疏松模型中，ERK1/2信号与脂肪生成和骨形成相关[43-44]；核因子κB活性下降通过上调成骨细胞内JNK的活性导致骨形成的增加[45]。然而，ERK5信号在成骨细胞体内和体外的作用的相关研究很少。在此次研究中，XMD8-92显著抑制G2/M细胞周期期过程，并通过上调成骨细胞FasL(凋亡相关的蛋白)水平而增加细胞凋亡。有趣的是，XMD8-92对地塞米松抑制成骨细胞增殖和促进成骨细胞凋亡也有显著的协同作用。成骨细胞增殖减少和凋亡增多将导致骨量减少，最终发生骨质疏松症。到目前为止，ERK5对成骨细胞RANKL/OPG比率的调节也尚未见报道。此次研究发现XMD8-92抑制ERK5活性可上调RANKL/OPG比率，并进一步提高地塞米松诱导的RANKL/OPG比率。众所周知，RANKL/OPG比率的上升是导致骨质疏松症的重要分子机制，因此ERK5活性与RANKL/OPG比率的负相关是导致骨质疏松症的一大原因。
XMD8-92抑制小鼠成骨细胞内ERK5的活性导致骨质疏松症和加重塞米松诱导的骨质疏松症的分子机制可能是：①XMD8-92抑制小鼠骨组织内ERK5的磷酸化水平，并上调了RANKL /OPG比率；②XMD8-92抑制ERK5活性，通过下调Cyclin B1和CDK1的蛋白表达进而抑制G2/M细胞周期导致成骨细胞增殖活性降低；③XMD8-92通过抑制ERK5活性下调了FasL蛋白的表达，最终诱发成骨细胞凋亡增多。上述改变最终导致成骨细胞数量减少，并通过RANKL /OPG比率上调了破骨细胞活性，最终诱发小鼠骨质疏松症的发生。
综上所述，实验证实了XMD8-92抑制小鼠成骨细胞内ERK5的活性会对骨组织骨量有深远的影响。这是XMD8-92及其靶向ERK5蛋白在体内调节骨形成的首次报道。研究还证实，在骨质疏松症或糖皮质激素性骨质疏松症等疾病条件下ERK5活性的下调可能被视为骨组织代谢平衡异常的潜在诱发因素之一。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

调控骨质疏松模型小鼠的ERK5蛋白信号通路

Involvement of ERK5 signaling pathway in osteoporosis development in mice

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