黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2969

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (2): 165-171.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2969

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黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制

李震，黄永辉，孙继芾，孙海涛

江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000

收稿日期:2019-12-24 修回日期:2019-12-27 接受日期:2020-02-22 出版日期:2021-01-18 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 黄永辉，硕士，主任医师，江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000
作者简介:李震，男，1993年生，江苏省连云港市人，汉族，江苏大学毕业，硕士。
基金资助:
镇江市科技项目(SH2017007)

Role and mechanism of focal adhesion kinase in inducing osteogenic differentiation of mouse embryonic fibroblasts cells

Li Zhen, Huang Yonghui, Sun Jifu, Sun Haitao

Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China

Received:2019-12-24 Revised:2019-12-27 Accepted:2020-02-22 Online:2021-01-18 Published:2020-11-21
Contact: Huang Yonghui, Master, Chief physician, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
About author:Li Zhen, Master, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Zhenjiang City, No. SH2017007

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
永生化小鼠胚胎成纤维细胞：具备间充质干细胞相关生物特性，具有自我更新和多向分化潜能，同时可以通过质粒转染或基因改造来表达异位基因，是分析基因功能的合适的细胞模型，多被用作为骨髓间充质干细胞的代生干细胞模型，以研究中胚层细胞的分化机制。此次研究通过对比黏着斑激酶敲除前后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化，明确黏着斑激酶在成骨分化过程中调控作用及机制。
黏着斑激酶：被作为骨组织工程中“生物材料/支架”“种子细胞”“生长因子”3个要素的桥梁分子，对其在相关种子细胞成骨分化过程中的作用及机制的研究，对于骨组织工程的发展及应用尤为重要。此课题通过静默小鼠胚胎成纤维细胞黏着斑激酶的表达，明确其在调控小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的效应及机制，为骨组织工程应用于临床治疗大面积骨缺损及骨质疏松、成骨发育不全等代谢性骨病提供了新的治疗方式及作用靶点。

背景：黏着斑激酶被作为骨组织工程中“生物材料/支架”“种子细胞”“生长因子”3个要素的桥梁分子，研究其在相关种子细胞成骨分化过程中的作用及机制，对于骨组织工程的发展及应用尤为重要。
目的：探讨黏着斑激酶在诱导永生化小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中的作用及机制。
方法：在相同的诱导条件下诱导野生型及黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化，在相同的诱导条件下诱导经磷脂酰肌醇3-激酶特异性磷酸化抑制剂和细胞外调节蛋白激酶磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化。在显微镜下观察不同诱导时期细胞形态改变，蛋白免疫印迹技术检测早期成骨相关蛋白表达水平及相应的磷脂酰肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶磷酸化水平，Real-time PCR检测成骨相关基因转录水平，最后在成骨诱导3周后对诱导细胞进行茜素红钙结节染色。
结果与结论：①相同的诱导条件下黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞的成骨效应较保留斑激酶的小鼠胚胎成纤维细胞组明显下降；②加入磷脂酰肌醇3-激酶特异性磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后，小鼠胚胎成纤维细胞与对照组相比成骨相关蛋白表达水平及成骨效应明显下降；③加入细胞外调节蛋白激酶磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后，小鼠胚胎成纤维细胞与对照组相比成骨相关蛋白表达水平及成骨效应明显下降；④提示静默黏着斑激酶表达可通过降低磷脂酰肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶(1/2)磷酸化水平，降低成骨相关蛋白表达水平，进而抑制小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化。

https://orcid.org/0000-0001-8294-2859 (李震)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 黏着斑激酶, 永生化, 小鼠, 胚胎, 成纤维细胞, 细胞外调节蛋白激酶, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Focal adhesion kinase (FAK) is regarded as a bridge molecule of “biomaterial/scaffold,” “seed cell,” and “growth factor” in bone tissue engineering. Exploration on the role and mechanism of focal adhesion kinase in inducing osteogenic differentiation of related seed cells is particularly important for the development and application of bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To determine the role and mechanism of FAK in inducing osteogenic differentiation of immortalized mouse embryonic fibroblasts (iMEF).
METHODS: Under the same induction conditions, the iMEF cells with (iMEFFAK+/+ cells) or without FAK knockout (iMEFFAK-/- cells), treated with or without PI3K/AKT phosphorylation inhibitor LY294002 or ERK1/2 phosphorylation inhibitor U0126, were induced to differentiate into osteoblasts. The morphological changes of iMEFs (iMEFFAK+/+ and iMEFFAK-/-) at different induction periods were observed under a microscope. Runx2 protein levels and corresponding p-ERK1/2 and p-AKT levels were detected by western blot. RT-PCR technology was used to detect the transcription level of Runx2 gene. Finally, the induced iMEFs (iMEFFAK+/+ and iMEFFAK-/-) were stained with alizarin red staining for calcium nodules 3 weeks after osteogenesis induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The osteogenic effect of iMEFFAK-/- cells was lower than that of iMEFFAK+/+ cells under the same induction conditions. Both the expression levels of Runx2 and the osteogenic effect of iMEFFAK+/+ cells and iMEFFAK-/- cells treated with LY294002 decreased significantly compared with the control group. Both the expression levels of Runx2 and the osteogenic effect of iMEFFAK+/+ cells and iMEFFAK-/- cells treated with U0126 decreased significantly compared with the control group. To conclude, silencing FAK expression can inhibit osteogenic differentiation of mouse embryonic fibroblasts by reducing the levels of PI3K/AKT, serine/threonine protein kinase, and ERK1/2 phosphorylation levels

Key words: focal adhesion kinase, immortalization, mouse, embryo, fibroblast, ERK1/2 , osteogenic differentiation

中图分类号:

李震, 黄永辉, 孙继芾, 孙海涛. 黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 165-171.

Li Zhen, Huang Yonghui, Sun Jifu, Sun Haitao. Role and mechanism of focal adhesion kinase in inducing osteogenic differentiation of mouse embryonic fibroblasts cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(2): 165-171.

图/表（结果） 11

2.1 iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-的鉴定 iMEFFAK+/+ 为贴壁生长的多突的纺锤形或星形的扁平细胞多呈多角形，呈集落样生长；iMEFFAK-/-较iMEFFAK+/+体积明显缩小，且多呈梭形(图1)。分别对2种细胞蛋白进行免疫蛋白印迹检测，FAK敲除后的iMEFFAK-/-细胞不表达FAK蛋白(图2)。分别采用划痕实验及Cell Counting Kit-8实验检测细胞的迁移及增殖能力，结果表明iMEFFAK-/-细胞的迁移及增殖能力均较iMEFFAK+/+细胞有不同程度下降(图3，4)。以上结果均可对两种细胞进行形态及功能学的有效鉴定，从而允许后续实验进行。

2.2 FAK参与增强iMEF细胞的成骨分化待贴壁生长的iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞同时融合达80%后，分别加入相同的成骨诱导培养基，在相同的诱导条件下对两株细胞定向诱导，并对细胞形态进行观察。如图5所示，诱导1周后，两株细胞相对于诱导前，由长梭形变为不规则的多角形，胞质内细胞颗粒明显增多；诱导2周后，细胞可见重叠生长，细胞质内充满黑色颗粒，细胞间可见少量钙质沉积；诱导3周后，细胞结节中心的细胞结构逐渐丧失，细胞间钙结节大量形成。分别采用Western blot、RT-PCR 检测诱导前期(诱导前、诱导3 d、诱导1周)iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/- 细胞RUNX2蛋白及基因的表达情况(图6，7)，其结果显示：诱导前期iMEFFAK-/- 较iMEFFAK+/+ RUNX2蛋白及基因表达量明显下降(P < 0.01)。最后采用茜素红钙结节染色方法分别对诱导21 d后的iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-钙结节染色并在光学显微镜下观察钙结节的密度差异(图8)。结果显示：经过21 d诱导的iMEFFAK-/- 细胞较iMEFFAK+/+ 细胞钙结节沉积量明显下降。结合上述实验，可以得出结论：静默FAK表达可降低Runx2表达，继而降低小鼠胚胎成纤维细胞的成骨效应。即FAK可正向调控Runx2表达继而增强小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化，静默FAK表达可明显降低小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化效应。

2.3 FAK可通过改变ERK和AKT磷酸化水平影响iMEF细胞的成骨分化为进一步探索静默FAK表达如何降低小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化效应，首先通过Western blot技术分别检测iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞的P-PI3K p85(Y458)、P-AKT (Ser473)、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)表达水平，发现iMEFFAK-/-细胞P-PI3K p85(Y458)、P-AKT(Ser473)、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)水平相对于iMEFFAK+/+细胞均有不同程度下降(图9)。

为进一步验证假设：静默FAK表达是否可通过降低PI3K/AKT、ERK1/2磷酸化水平，进而降低RUNX2基因表达水平，最终抑制降低iMEF细胞的成骨分化。接下来，将iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞均匀等量接种于六孔板中，待细胞生长至80%左右加入成骨诱导培养基，处理组分别加入PI3K/AKT抑制剂LY294002和ERK1/2抑制剂U0126同诱导培养基共同诱导(换液后需重新添加，持续抑制)。分别在诱导早期和诱导21 d对成骨效应进行检测，结果示：①加入LY294002处理的iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞与对照组相比早期RUNX2表达量及晚期成骨效应明显下降；②加入U0126处理的iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞与对照组相比早期RUNX2表达量及晚期成骨效应明显下降(图10，11)。因此得出在小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中，PI3K/AKT、ERK1/2的磷酸化水平与Runx2及其成骨分化效应成正相关。根据iMEFFAK-/-细胞P-PI3K p85(Y458)、P-AKT(Ser473)、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)水平相对于iMEFFAK+/+细胞均下降，最终得出结论，静默FAK表达可通过降低PI3K/AKT、ERK1/2磷酸化水平，降低Runx2表达水平，进而抑制小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化。

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引言

骨质疏松症是骨科常见的疾病，是以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变[1]，可严重影响患者生活质量，甚至危及患者生命。此外严重创伤、大面积感染及骨肿瘤术后造成的大面积骨缺损，也是目前骨科治疗面临的巨大难题。近年来，随着组织工程学研究的发展，现提出“生物材料/支架”+“种子细胞+“生长因子”新的治疗理念，主要用于骨质疏松、难愈合性骨折等疾病治疗。成骨细胞是维持骨代谢平衡的重要的功能细胞，起源于具有多向分化潜能的间充质干细胞。间充质干细胞属于多能干细胞,其在特定的诱导条件下，可分化成骨、软骨、肌肉等，向多种细胞定向分化[2-5]。在再生医学领域，间充质干细胞被作为理想种子细胞用于骨组织工程，主要应用于骨质疏松、难愈合性骨折等疾病治疗的研究。
永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts, iMEF)具备间充质干细胞相关生物特性，具有自我更新和多向分化潜能[6-8]，同时可以通过质粒转染或基因改造来表达异位基因，是分析基因功能合适的细胞模型，多被用作为骨髓间充质干细胞的代生干细胞模型，以研究中胚层细胞的分化。Runx2是成骨细胞特异性转录因子，与果蝇Runt蛋白具有高度同源性，其DNA结构域与果蝇Runt蛋白具有高度的同源性，与核心结合因子β形成异源二聚体，特异识别并结合其共有序列，可增加骨钙蛋白、骨唾液蛋白、Ⅰ型胶原等成骨基因的表达，是干细胞向成骨细胞定向分化及不成熟成骨细胞成骨分化过程中关键的转录因子[9-10]。Runx2作为转化生长因子β和骨形成蛋白等多种细胞因子的共同信号分子及Wnt、Notch、MAPK等多种信号通路下游分子[11-13]，其在转录和蛋白水平上的特异性改变对成骨分化检测及临床骨质疏松症等成骨分化不全等疾病的治疗具有重要意义[14-15]。黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，通过整合来自细胞外压力、营养、细胞黏着等多方面的信号，参与多条信号转导通路。现有研究已证实FAK能够调节细胞迁移和血管生成[16-17]，尤其在肿瘤细胞的进展和转移中起重要作用[18-19]。研究表明FAK在胚胎干细胞及整个胚胎发育过程中均高度表达，在调节胚胎干细胞的增殖、指导干细胞谱系的分化的过程中起到关键作用[19-21]。此外，目前已证实参与影响成骨细胞成骨分化过程的相关物理因素如磁场等[22]，化学因子如一氧化氮、组蛋白 H1等，以及生物力学等多种因素[23-25]，均可由FAK整合。因此FAK作为骨组织工程中“生物材料/支架”“种子细胞”“生长因子”3个要素的桥梁分子，研究其在相关种子细胞成骨分化过程中的作用及机制对于骨组织工程的发展及应用尤为重要。成骨方面，FAK通过何种方式影响胚胎干细胞成骨分化尚缺乏足够研究。
课题通过对比FAK敲除前后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化效应，以及特异性抑制相关分子磷酸化表达，探索静默FAK表达是否及如何影响小鼠胚胎成纤维细胞的成骨效应，明确FAK参与调节成骨通路的下游分子，以便于通过特异性加强相关分子表达，进而为促进骨组织工程的成骨分化效果及临床上治疗大面积骨缺损及骨质疏松、成骨发育不全等代谢性骨病提供新的治疗方式及作用靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计小鼠胚胎成纤维细胞成骨诱导分化实验。
1.2 时间及地点于2019年2至10月在江苏大学医学院基础医学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株 iMEF，包括保留FAK基因的iMEF，以及敲除FAK基因的iMEF(购于ATCC细胞库，并于江苏大学医学院基础医学实验室复苏、传代、冻存)，下文分别用iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-表示。
1.3.2 主要试剂 DMEM高糖培养基(Gibco有限公司)，青霉素-链霉素(南京维森特生物技术有限公司)，胰蛋白酶(南京维森特生物技术有限公司)，新生胎牛血清(Gibco有限公司)，细胞PBS(南京维森特生物技术有限公司)，茜素红(上海生工生物工程有限公司)，维生素C(Sigma公司)，甘油磷酸钠(上海生工生物工程有限公司)，地塞米松(上海全宇科技动物药业有限公司)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)，RNA提取试剂Trizol( Takara 公司)，SYBR GreenⅠ试剂(Takara公司)，牛血清白蛋白(上海翊圣生物科技有限公司)，PVDF膜(Millipore生物科技有限公司)，ECL化学发光液(天能科技有限公司)，蛋白分子量Marker(天能科技有限公司)，蛋白分子量Marker(天能科技有限公司)，P-PI3K p85(Y458)抗体、P-AKT(Ser473)、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204，Cell Signaling Technology公司)，Runx2抗体(Abcam公司)，兔抗、鼠抗(南京贝迪生物科技有限公司)，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)AKT抑制剂LY294002(MCE公司)，MEK/ERK1/2磷酸化抑制剂U0126(MCE公司)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养与处理 iMEF细胞培养采用DMEM培养基培养。复苏iMEF细胞于含有体积分数10%胎牛血清、50 mg/L青霉素、50 mg/L链霉素DMEM培养基中。细胞培养环境为 37 ℃，体积分数5%CO2及饱和湿度，待细胞生长至80%-90%时，用胰酶进行消化后传代或液氮冻存保留。
1.4.2 iMEF细胞诱导成骨分化待iMEF细胞生长至80%，将DMEM培养基换为成骨诱导培养基(在含体积分数10%胎牛血清、50 mg/L青霉素、50 mg/L链霉素的DMEM培养基基础上加上50-100 mg/L维生素、10 mmol/L甘油磷酸钠、0.1 μmol/L地塞米松)诱导分化，每3 d换液，诱导3周后进行茜素红染色。

1.4.3 Real-time PCR 检测将处于指数生长状态的iMEF细胞均匀等量地接种于3个六孔板中(上排为iMEFFAK+/+细胞、下排为iMEFFAK-/-细胞)，待细胞生长至80%左右加入成骨诱导培养基。分别于诱导前、诱导3 d、诱导1周时，采用Trizol法提取细胞总RNA，并按反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，通过Real-time PCR检测成骨指标基因Runx2的表达情况。引物序列，见表1。

1.4.4 Western blot检测将处于指数生长状态的iMEF细胞均匀等量接种于3个六孔板中(上排为iMEFFAK+/+细胞，上排各孔分别标记为1.1、1.2、1.3，下排为iMEFFAK-/-细胞，下排各孔分别标记为2.1、2.2、2.3)，待细胞生长至80%左右加入成骨诱导培养基，同时于1.2、2.2实验孔加入PI3K/AKT磷酸化抑制剂LY294002(浓度为50 μmol/L)、于1.3、2.3实验孔加入MEK/ERK1/2磷酸化抑制剂U0126(浓度为50 μmol/L)。分别于诱导前、诱导3 d、诱导1周时，采用RIPA裂解细胞提取细胞蛋白，经过BCA法进行蛋白定量处理后采用Western blot技术检测Runx2蛋白表达水平及PI3K/AKT、ERK1/2磷酸化水平。
1.4.5 茜素红染色将处于指数生长状态的iMEF细胞均匀等量接种于3个六孔板中(上排为iMEFFAK+/+细胞，上排各孔分别标记为1.1、1.2、1.3，下排为iMEFFAK-/-细胞，下排各孔分别标记为2.1、2.2、2.3)，待细胞生长至80%左右加入成骨诱导培养基，同时于1.2、2.2实验孔加入PI3K/AKT磷酸化抑制剂LY294002(浓度为50 μmol/L)、于1.3、2.3实验孔加入MEK/ERK1/2磷酸化抑制剂U0126(浓度为50 μmol/L)。待细胞经过诱导满21 d后，根据茜素红染色说明进行钙结节染色。
1.4.6 Cell Counting Kit-8(CCK-8)及划痕实验
划痕实验检测细胞迁移：取生长状态良好的对数生长期iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞，计数后均匀种于六孔版，置于培养箱中孵育24 h后用枪头做垂直划痕。用PBS轻轻洗细胞3次，去除划下的细胞后，加入无血清培养基。培养箱中分别培养0，6，12 h取样，拍照。划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-6/12 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
CCK-8实验检测细胞增殖：取生长状态良好的对数生长期iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞，每孔按2×103个接种至96孔板中，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，继续培养48 h，弃掉培养基，每孔加入新鲜配制的含10 μL的毒性检测液CCK8，置于培养箱中继续培养2 h后，用酶标仪测波长为450 nm的吸光度(A)值。实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。按公式计算细胞相对增殖率=[(iMEFFAK-/-A值-空白组A值)/ iMEFFAK+/+A值-空白组A值]×100%，以分组为横坐标，48 h细胞相对增殖率为纵坐标，绘制柱状图。
1.5 主要观察指标通过Western blot、RT-PCR技术检测iMEFFAK+/+及iMEFFAK-/-细胞成骨诱导早期Runx2蛋白表达及转录水平的差异，最终在诱导分化21 d后对iMEFFAK+/+及iMEFFAK-/-细胞所形成的钙结节进行茜素红染色。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0软件进行数据处理，实验独立重复 3 次，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，检验水准α=0.05。

讨论

间充质干细胞属于多能干细胞，具有强大的自我增殖能力和多向分化潜能，其在特定的诱导条件下,可分化成骨、软骨、肌肉、脂肪等，向多种细胞定向分化[2-5]。在再生医学领域，间充质干细胞被作为理想种子细胞用于骨组织工程，主要应用于骨质疏松、难愈合性骨折等疾病治疗的研究。iMEF具备间充质干细胞相关生物特性，具有自我更新和多向分化潜能[6-8]，同时可以通过质粒转染或基因改造来表达异位基因，是分析基因功能的合适细胞模型，多被用作为骨髓间充质干细胞的代生干细胞模型，以研究中胚层细胞的分化。
Runx2是成骨细胞特异性转录因子，与果蝇Runt蛋白具有高度同源性，其共有的DNA 结合 runt 结构域，与核心结合因子β形成异二聚体，并结合其共有序列，可增加骨钙蛋白、骨唾液蛋白、Ⅰ型胶原等成骨基因的表达，是干细胞向成骨细胞定向分化及不成熟成骨细胞成骨分化过程中关键的转录因子[9-10]。Runx2作为转化生长因子β和骨形成蛋白等多种细胞因子的共同信号分子及Wnt、Notch、MAPK 等多种信号通路的下游分子[11-13]，其在转录和蛋白水平上的特异性改变对成骨分化检测及临床骨质疏松症等成骨分化不全等疾病的治疗具有重要意义[14-15]。
FAK是一种胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，集中在黏着斑附近，通过整合来自细胞外压力、营养、细胞黏着等多方面的信号，参与多条信号转导通路。现有研究已证实FAK能够调节细胞迁移和血管生成[16-17]，尤其在肿瘤细胞的进展和转移中起重要作用[18-19]。研究表明FAK在胚胎干细胞及整个胚胎发育过程中均高度表达，在调节胚胎干细胞的增殖、指导干细胞谱系的分化过程中起到关键作用[20-22]。如FAK基因敲除的小鼠在经历异常的中胚层分化表现出早期的胚胎致死率增高[23]、FAK敲除的胚胎细胞中胚层细胞的迁移率远低于正常胚胎细胞[24]。此外，目前已证实的参与影响成骨细胞成骨分化过程的相关物理因素如磁场、超声波等，化学因子如一氧化氮、组蛋白H1等，以及生物力学等多种因素[25-32]，均可由FAK整合。FAK作为“生物材料/支架”“种子细胞”“生长因子”的桥梁分子，其在相关种子细胞成骨分化过程中的作用及机制研究，对于骨组织工程的发展及应用尤为重要。目前关于FAK在成骨细胞成骨分化过程中的研究绝大多数集中在细胞外信号是否由FAK介导整合进而影响成骨细胞成骨分化[33-34]，然而，在整合相关细胞外信号后，FAK如何及通过何种方式影响胚胎干细胞成骨分化尚缺乏足够证据证实。通过对FAK在成骨通路中机制的研究，尤其是明确FAK参与调节成骨通路的下游分子，可为促进骨组织工程成骨分化效果，及临床上治疗大面积骨缺损及骨质疏松、成骨发育不全等代谢性骨病，提供新的作用及治疗靶点。
PI3K是胞质内的脂类激酶，受多种生长因子刺激而激活后，可将质膜上的PIP2磷酸化为PIP3。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K下游关键蛋白之一，PI3K/AKT通路广泛存在于细胞中，参与调控细胞的多种生物学特性[35-36]，现关于PI3K/AKT通路在成骨细胞成骨分化过程中的起到的促进/抑制作用尚存在争议[37-39]。值得一提的是目前关于PI3K/AKT通路在成骨分化过程中的机制研究多集中在定向分化细胞如前体成骨细胞系MC3T3-E1，关于其在多能干细胞成骨分化过程中调控机制了解尚少。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是存在于胞浆内的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，其接受细胞外的刺激通过MAPK信号转导通路的三级激酶级联反应致使细胞出现相应的生物学效应。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导Elk-1、ATF、Ap-1、c-fos和c-Jun的转录活化，调控细胞的多种生物学特性，其中包括成骨、成软骨分化等[40]。然而就ERK1/2在多能干细胞成骨分化过程中的调控作用仍然存在较大争议[41-44]。
此次课题为探究FAK在小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中的作用及机制，首先对iMEFFAK+/+、iMEFFAK-/-细胞进行定向诱导成骨分化，通过观察2种细胞在相同诱导条件下的成骨差异，明确FAK在诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中起到的调控作用。实验发现，无论是细胞的成骨早期的RUNX2蛋白及mRNA水平，或者是成骨晚期的钙结节表达量，iMEFFAK-/- 细胞均较iMEFFAK+/+表达下降。因此得到第一个结论：静默FAK表达可降低Runx2表达，继而降低小鼠胚胎成纤维细胞的成骨效应，即FAK可正向调控Runx2表达继而增强小鼠胚胎成纤维干细胞成骨分化。此外通过Western blot检测发现iMEFFAK-/-细胞PI3K/AKT、ERK1/2的磷酸化水平较iMEFFAK+/+细胞均有不同程度的下降。就FAK-Runx2及p-PI3K/AKT、p-ERK1/2是否存在相关性，及其对小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的效应作者做出以下研究，在相同的诱导条件下诱导经过PI3K/AKT磷酸化抑制剂LY294002和ERK1/2磷酸化抑制剂U0126处理的小鼠胚胎成纤维细胞，通过Western blot技术检测早期Runx2蛋白表达水平，RT-PCR技术检测Runx2基因转录水平，在成骨诱导21 d后对诱导细胞进行胞茜素红钙结节染色。结果表明随着PI3K/AKT、ERK1/2磷酸化水平的降低，小鼠胚胎成纤维干细胞无论是保留FAK基因的iMEF，或者是敲除FAK基因的iMEF，其Runx2蛋白表达水平、基因转录水平以及成骨效应均随之下降，因此作者得出结论：在小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中，PI3K/AKT、ERK1/2的磷酸化水平与Runx2及其成骨分化效应成正相关。结合以上实验最终得出结论：静默FAK表达可通过降低PI3K/AKT、ERK1/2磷酸化水平，降低Runx2表达水平，进而抑制小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化。反之，FAK通过增强PI3K/AKT、ERK1/2磷酸化水平，提高Runx2表达水平，进而促进小鼠胚胎成纤维干细胞成骨分化，形成细胞外相关信号-FAK-PI3K-AKT-Runx2、细胞外相关信号-FAK- ERK1/2-Runx2细胞通路。在成骨通路中PI3K-AKT及ERK1/2之间的相互关系，以及上述2条信号通路的完善，尚需进一步实验研究发现与证实。
总而言之，通过对FAK在成骨通路机制的研究，尤其是明确FAK参与调节成骨通路的下游分子后，通过特异性加强相关分子表达，对促进骨组织工程的成骨分化效果，及临床上治疗大面积骨缺损及骨质疏松、成骨发育不全等代谢性骨病，提供新的治疗方式及作用靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制

Role and mechanism of focal adhesion kinase in inducing osteogenic differentiation of mouse embryonic fibroblasts cells

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