构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.003

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (23): 3621-3627.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.003

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构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株

刘慧萍，钟晓龙，赵晴，黄文起，安珂

中山大学附属第一医院麻醉科，广东省广州市 510080

出版日期:2015-06-04 发布日期:2015-06-04
通讯作者: 安珂，博士研究生，副教授，副主任医师，硕士生导师，中山大学附属第一医院麻醉科，广东省广州市 510080
作者简介:刘慧萍，女，1990年生，江西省萍乡市人，汉族，中山大学附属第一医院在读硕士，主要从事慢性神经病理痛的机制及治疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81171468)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金(200805581112)

Construction of human telomerase reverse transcriptase-immortalized rat bone marrow mesenchemal stem cell strains

Liu Hui-ping, Zhong Xiao-long, Zhao Qing, Huang Wen-qi, An Ke

Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Online:2015-06-04 Published:2015-06-04
Contact: An Ke, Studying for doctorate, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Liu Hui-ping, Studying for master’s degree, Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171468; the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education, Ministry of Education, No. 200805581112

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞具有取材方便、多向分化及低免疫原性等优点，是转基因细胞移植镇痛领域中的理想载体细胞，但由于骨髓中间充质干细胞含量有限、体外培养的复制性衰老等问题，制约其在镇痛研究中的应用。
目的：构建永生化大鼠骨髓间充质干细胞株，为转基因细胞移植镇痛提供载体细胞来源。
方法：构建携带人端粒酶反转录酶基因的慢病毒pLV-Puro-EF1α-hTERT并转染第3代骨髓间充质干细胞后进行嘌呤霉素筛选，获得阳性细胞克隆并扩大培养，分别采用RT-PCR和TRAP法检测转染细胞人端粒酶反转录酶的表达和端粒酶活性，同时观察细胞形态、增殖和诱导分化能力、表面分子以及Nestin、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达，检测细胞染色体核型和致瘤性。
结果与结论：人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以体外连续培养超过30代。与未转染的细胞和对照病毒转染的细胞相比，慢病毒转染的骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶mRNA表达、端粒酶活性以及细胞增殖能力均提高，细胞周期主要处于G2/M以及S期，增殖指数明显升高；细胞表面分子CD29、CD44、CD90表达阳性率大于70%，而CD34、CD45表达阳性率不足5%，胞浆Nestin的表达阳性，而MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ未见表达，保留了干细胞成骨、成脂、成神经的分化能力，细胞形态、染色体核型均正常，裸鼠接种无致瘤性。以上结果提示成功构建了人端粒酶反转录酶基因修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株，为转基因细胞移植用于镇痛研究提供了生物学性状均一、稳定的安全载体细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 人端粒酶反转录酶, 骨髓间充质干细胞, 永生化, 镇痛, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Because of convenient source, multi-lineage differentiation and low immunogenicity, bone marrow mesenchymal stem cells are the ideal cell type to serve as vectors of transgenic cells in pain management. However, the replicative senescence and small amount of cells obtained from the bone marrow restrict the application of bone marrow mesenchymal stem cells in pain research.
OBJECTIVE: To construct human telomerase reverse transcriptase (hTERT)-immortalized rat bone marrow mesenchymal stem cells as transgenic cellular vectors for pain therapy.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were obtained from whole rat bone marrow, and then transfected with a lentivirus containing the hTERT (pLV-Puro-EF1α-hTERT) followed by puromycin selection. hTERT expression and telomerase activity in these transfected cells were determined by RT-PCR and TRAP. Morphological changes, capacity of cell growth and multi-lineage differentiation, chromosome karyotype and
tumorigenicity were observed in vitro. Moreover, the expression of cell surface molecule, Nestin, MHC-I and MHC-II in transfected cells were also detected by flow cytometry and immunocytochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone marrow mesenchymal stem cells genetically modified by hTERT could be cultured and passaged through 30 generations in vitro. Compared to the primary and negative transfected cells, the hTERT-modified bone marrow mesenchymal stem cells showed higher expression of hTERT mRNA, telomerase activity and cell proliferation. Most of transfected cells stayed at G2/M and S stages. The proliferation index of the transfected cells were increased dramatically. The positive rates of CD29, CD44 and CD90 were over 70%, but the positive rates of CD34 and CD45 were less than 5%. Transfected cells were positive for Nestin in the cytoplasm, but negative for MHC-1 and MHC-11. In addition, this cell line continued to exhibit the characteristics of fibroblastic bone marrow mesenchymal stem cells, including phenotype, differentiation into osteoblasts, adipocytes and neuron-like cells. No chromosome abnormality and tumor formation were observed in this experiment. Taken together, these data suggests that the rat bone marrow mesenchymal stem cells immortalized by hTERT gene are constructed successfully and still maintain major stem cells characteristics, which provide safe and stable cell vectors as research base for pain therapy.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Telomerase, RNA-Directed DNA Polymerase

中图分类号:

R394.2

刘慧萍，钟晓龙，赵晴，黄文起，安珂. 构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3621-3627.

Liu Hui-ping, Zhong Xiao-long, Zhao Qing, Huang Wen-qi, An Ke. Construction of human telomerase reverse transcriptase-immortalized rat bone marrow mesenchemal stem cell strains [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3621-3627.

图/表（结果） 8

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态开始时获得的杂细胞较多，随着传代次数的增加，杂细胞越来越少。至第4代，可见贴壁生长的细胞形态较均一，多呈长梭形或多角形，细胞集落漩涡状生长，见图1A。当细胞体外培养至第9代时，仍保持旺盛的增殖能力和典型的间充质干细胞形态，见图1B。之后，细胞增殖活力逐渐下降，第14代的细胞传代时间由三四天延长到六七天，细胞形态呈现衰老表现，见图1C。
2.2 永生化骨髓间充质干细胞的构建收集慢病毒上清液和空载体病毒上清液感染的第3代骨髓间充质干细胞。基因转染组细胞可以在体外连续培养超过30代，细胞形态未见明显异常，待融合度达90%时细胞间存在明显的接触性抑制，见图2A；空载体组细胞的生长速度略慢于基因转染组，而且细胞老化现象比较严重，见图2B。
2.3 RT-PCR检测结果提取细胞总RNA，经反转录后合成cDNA，行PCR检测hTERT基因的表达。结果显示，基因转染组骨髓间充质干细胞的hTERT表达量明显高于未转染组和空载体组骨髓间充质干细胞，见图3。

2.4 端粒酶活性检测结果 TRAP法扩增端粒酶的端粒重复序列后，多功能酶标检测带荧光的扩增产物，用?FL/?R比值的大小表示端粒酶活性的大小。阳性细胞(Hela cells)、基因转染组、空载体组和未转染组骨髓间充质干细胞的?FL/?R的比值分别为0.613 9±0.032 7，0.413 3± 0.022 3，0.259 2±0.030 3，0.230 9±0.018 6。与空载体组和未转染组相比，基因转染组端粒酶活性明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明hTERT可以提高细胞端粒酶活性，见图4。Unheated为检测样品；heated为阴性对照样品，其端粒酶在提取后立即85 ℃高温处理10 min，使其活性降至很低。

2.5 基因转染组骨髓间充质干细胞的生物学特性
2.5.1 干细胞表型的鉴定流式细胞仪检测发现，基因转染组骨髓间充质干细胞高表达CD29，CD44，阳性率分别为95.16%，85.08%，而CD34，CD45呈低表达，阳性率分别为0.21%，0.09%，见图5A。免疫细胞化学法检测发现，基因转染组骨髓间充质干细胞胞浆Nestin表达阳性，见图5B，而MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表达阴性(图略)。

2.5.2 增殖能力的检测细胞计数法绘制生长曲线图，与第14代空载体组、未转染组骨髓间充质干细胞相比，第30代基因转染组骨髓间充质干细胞增长速率明显增快，见图6A。流式细胞仪检测PI染色后细胞周期变化，与第14代空载体组、未转染组骨髓间充质干细胞相比，第30代基因转染组骨髓间充质干细胞处于增殖期(G2/M%+S%)的细胞数目明显较多，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图6B。结果表明转染hTERT基因后，细胞增殖能力明显升高。

2.5.3 定向诱导分化的鉴定
成骨诱导：镜下见细胞诱导后变大，胞浆内颗粒明显增多，细胞间钙质沉积，钙结节明显，经茜素红S染色后呈红色结节(图7A)。
成脂诱导：成脂诱导约3 d后，镜下细胞内可见小脂滴出现，约2周后脂滴数量明显增加并融合，细胞由长梭形变为椭圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉积(图7B)。
成神经诱导：细胞经预诱导后形态发生皱缩，不规则，边缘可见多个细长突起。正式诱导后细胞形态发生改变，在诱导5 h后趋于稳定，似神经元样细胞(图7C)。免疫细胞化学检测显示诱导后的神经元细胞表达Nestin、NSE、GFAP(图7D-F)，而MAP2表达弱阳性(图略)。

2.5.4 核型分析结果第30代基因转染组骨髓间充质干细胞经秋水仙素处理2 h后，染色体行Gimesa染色，镜下见染色体数目为(40.25±1.49)条，细胞为二倍体细胞。挑选出染色体分散好的基因转染组骨髓间充质干细胞作核型分析，20对+XY，结果见图8。

2.5.5 致瘤性每周持续观察裸鼠背部皮肤，SW480细胞接种第7天后可见接种部位出现米粒状凸起，并随着时间的延长不断增大，在接种后第28天，可见明显肿块，见图9A。而接种第30代基因转染组骨髓间充质干细胞的裸鼠直至观察结束，接种部位未见有任何大小的肿物形成，见图9B，说明基因转染的骨髓间充质干细胞无致癌风险。

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引言

材料方法

设计：基因水平，开放性实验研究。
时间及地点：2013年4月至2015年3月在中山大学附属第一医院转化医学中心实验室和中山大学北校区动物实验中心完成。
材料：
实验动物：①SPF级4周龄SD大鼠4只，体质量80-100 g，由中山大学东校区动物实验中心提供。②SPF级4周龄BALB/c-nu小鼠10只，雌性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

构建人端粒酶反转录酶修饰永生化大鼠骨髓间充质干细胞株所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
质粒pLV-Puro-EF1α-hTERT，质粒pPGK-Puro	Cyagen Biosciences(广州)
DMEM/F-12、胎牛血清、胰蛋白酶	Gibco
β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、吲哚美辛、胰岛素、IBMX、秋水仙素	Sigma
RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒	Takara
PE anti-mouse/rat CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、anti-rat Nestin、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ	Biolegend
TRAPEZE^® XL Telomerase Detection Kit	Millipore
流式细胞仪	BD
PCR仪	Bio-Rad
倒置显微镜	Olympus
多功能酶标仪	Molecular Devices

实验方法：
大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养：采用全骨髓贴壁培养法，SD大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，体积分数为75%乙醇全身浸泡消毒10 min。在无菌条件下分离其股骨及胫骨，暴露骨髓腔，用DMEM/F12培养基反复冲洗髓腔，细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃上清，培养基重悬后计数，接种于25 cm2塑料培养瓶中，放入37 ℃、体积分数为5%CO2的恒温培养箱中培养。48 h后半量换液，之后每3 d全量换液1次，待细胞融合密度达90%时，PBS清洗2次，0.25%胰酶消化5 min，1 000 r/min离心5 min，以   1︰2比例传代培养。
载体的构建及包装：利用Gateway法构建慢病毒载体pLV-Puro-EF1α-hTERT和pLV-Puro。取对数生长期的293FT细胞，Lipofectamine法转染质粒，48 h后收集细胞上清液，3 000 r/min离心15 min，收集上清0.45 μm过滤器过滤，50 000×g离心1.5 h沉淀病毒颗粒，200 μL培养液重悬病毒，药物筛选法测定病毒滴度。
慢病毒转染：取第3代生长良好的大鼠骨髓间充质干细胞，加入MOI为20的慢病毒颗粒，以及终质量浓度为      5 mg/L的polybrene。转染8 h后，更换新鲜培养液继续培养，待细胞融合度达90%，加入含2 mg/L Puro的培养液进行筛选，2周后可获得阳性细胞克隆，采用有限稀释法分离并扩大培养。
RT-PCR检测hTERT mRNA的表达：分别提取阳性细胞克隆总RNA，行RT-PCR反应。GAPDH引物序列：上游5’-CCT TCC GTG TTC CTA CCC-3’，下游5’-CAA CCT GGT CCT CAG TGT AG-3’；hTERT引物序列：上游5’-GGC TTC AAG GCT GGG AGG AA C-3’，下游5’-AGC ACA CAT GCG TGA AAC CTG-3’。PCR循环条件：94 ℃4 min预变性，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35个循环，72 ℃ 5 min充分延伸。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察结果。
TRAP法检测细胞端粒酶活性：按TRAPEZE® XL Telomerase Detection Kit说明书操作，提取细胞端粒酶，以Hela细胞为阳性对照，PCR法扩增端粒重复序列，多功能酶标仪检测扩增后产物的荧光强度，?FL/?R的比值大小与端粒酶活性的高低成正相关。
细胞表面分子的检测：常规消化收集转染后骨髓间充质干细胞，调节细胞浓度为1×1010 L-1，取100 μL每管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45和CD90室温避光孵育30 min，PBS清洗3遍后用流式细胞仪检测分析。
免疫细胞化学法：取转染后的骨髓间充质干细胞，待细胞生长至80%融合度，弃培养液，40 g/L多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100破膜，正常山羊血清摇床封闭，加入一抗Rabbit Anti-Nestin、Rabbit Anti-MHC-Ⅰ、Rabbit Anti- MHC-Ⅱ(1︰200稀释)，4 ℃孵育过夜。弃一抗液，加入相应的二抗Goat Anti-Rabbit(1︰100稀释)，室温避光孵育1 h。细胞核行Hoechest染色，室温避光摇床孵育15 min，荧光显微镜下观察。
细胞增殖能力的测定：细胞以2×104/孔的密度接种至24孔培养板，每隔24 h取3个复孔常规消化离心，细胞计数板计数，连续7 d。以时间为横坐标，细胞数的平均值为纵坐标绘制生长曲线。
细胞周期的检测：细胞常规消化离心后，加入体积分数为75%冰乙醇固定，4 ℃过夜。次日，1 500 r/min离心5 min，预冷的PBS清洗2遍，200目细胞过滤膜过滤细胞悬液，以除去细胞团块。加入RNA 酶溶液至终质量浓度为50 mg/L，37 ℃孵育30 min。再加入PI染液至终质量浓度为50 mg/L，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测。
细胞分化能力的鉴定：
成骨诱导：取转染后的骨髓间充质干细胞，待细胞生长至70%融合度，加入成骨诱导液(1 mmol/L地塞米松、   1 mol/L β-甘油磷酸钠、50 mmol/L抗坏血酸)继续培养，每3 d换液1次，持续诱导两三周后进行茜素红S染色。
成脂诱导：取转染后的骨髓间充质干细胞，待细胞生长至80%-90%融合度，加入成脂诱导A液(含1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX)，72 h后更换为成脂诱导B液(含10 mg/L胰岛素)，24 h后再次更换回成脂诱导A液，如此重复诱导约4个循环，进行油红O染色。
成神经诱导：取转染后的骨髓间充质干细胞，待细胞生长至80%-90%融合度，加入成神经元诱导A液(DMEM/F12、10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子)，24 h后，更换为成神经元诱导B液(DMEM/F12、200 μmol/L BHA)，每隔1 h镜下观察细胞形态变化。诱导成功的细胞用免疫细胞化学法检测Nestin、NSE、MAP2、GFAP的表达。
核型分析：取生长良好的转染后骨髓间充质干细胞，0.1 mg/L秋水仙素处理2 h。常规消化离心后，0.075 mol/L KCl进行低渗处理，加入新鲜配置的甲醇/冰乙醇(3︰1)预固定液，混匀后800 r/min离心10 min；弃上清，加入新鲜配置甲醇/冰乙酸(3︰2)固定液，室温固定30 min，反复固定3次。弃上清，重悬细胞沉淀后，涂片，Gimesa染色。
裸鼠接种实验：细胞收集计数后按1×107/只接种到Balb/c裸小鼠的背部皮下，同时以相同数量的人结肠癌细胞SW480接种Balb/c裸小鼠作为阳性对照，观察接种部位肿块生长情况，持续观察4周。
主要观察指标：①大鼠骨髓间充质干细胞的形态。②hTERT基因转染后骨髓间充质干细胞hTERT mRNA的表达、端粒酶活性的变化。③hTERT基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性，包括细胞形态、表面分子及特征性蛋白的表达、增殖以及分化能力、染色体核型分析和致瘤性等。
统计学分析：采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，结果以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于慢性疼痛患病率高以及对其发病机制的了解不够透彻，一直成为当今疼痛治疗领域的一大难点。传统的药物疗法效果不完善、长期服用不良反应大，并产生耐药性^[5]。而转基因细胞移植镇痛为疼痛的治疗开辟了新途径。移植细胞类似于“生物微泵”不断地分泌多种镇痛物质，如多肽类物质、神经营养因子等，修复替代受损的神经组织，减轻神经周围的炎症反应，最终达到缓解疼痛的目的。作者前期研究发现，鞘内移植镇痛基因如前甘丙肽原基因、人脑啡肽基因等修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株可以有效地减轻慢性神经病理性疼痛^[6]，移植后细胞可以向鞘内组织分泌甘丙肽^[7]、人脑啡肽^[8]，后者通过结合相应的受体起到镇痛效果，从而验证了这一治疗途径的有效性及其应用前景。
然而，相较于星形胶质细胞、胚胎干细胞和神经干细胞，骨髓间充质干细胞取材便利、体外扩增能力强、诱导分化为多种组织细胞、旁分泌作用以及低免疫原性等优点，是目前研究应用最为广泛的干细胞之一。但是其在体外多次培养传代后，细胞生长逐渐减慢，大多数细胞不可避免地进入M1期(衰老)或M2期(危机)，最终细胞衰老而死亡。以往的研究表明，端粒的缩短与细胞衰老密切相关，随着细胞在体外不断分裂，端粒越来越短，当端粒缩短到一定极限后，细胞将停滞在M2期(危机)^[9]。端粒的合成主要依靠端粒酶，而人端粒酶反转录酶是端粒酶的催化亚基，它可以反转录合成端粒来补充缩短的端粒，维持端粒的长度，帮助细胞渡过M2期(危机)，从而获得无限增殖能力，最终达到永生化^[10]。
研究表明，导入外源性hTERT基因可改善细胞增殖能力。Sagong等^[11]发现hTERT通过反转录病毒转染猪肺泡巨噬细胞后，激活了细胞的端粒酶活性，细胞在体外近乎无限传代，且增殖速率、细胞形态、冻存后复苏活力无明显差异。而Zou等^[12]发现应用靶向hTERT基因的小干扰RNA可以通过降低膀胱癌细胞hTERT表达、抑制端粒酶活性来抑制细胞增殖能力，证实改变细胞端粒酶的活性高低最终可以提高或减弱细胞的增殖能力。正常骨髓间充质干细胞端粒酶活性低，因此通过转染外源性hTERT基因来提高细胞增殖能力、获得永生化细胞系，从而为骨髓间充质干细胞的移植应用提供充足细胞来源成为新的研究热点。
Bourgine等[13]通过慢病毒转染将hTERT基因导入人骨髓间充质干细胞中，转染后细胞端粒酶的活性提高约4倍，细胞在体外近乎无限增殖，与人骨髓间充质干细胞达到35群体倍增数其增殖能力即丧失相比，转染后细胞可培养至270群体倍增数而仍保持增殖能力。Liang等^[14]成功利用转染hTERT基因建立人脐带间充质干细胞系，新建细胞系增殖能力明显提升且保持分化功能，裸鼠接种无致瘤危害。Piper等^[15]研究将表达hTERT载体导入人骨髓间充质干细胞，通过添加或去除诱导剂对比发现，与hTERT基因诱导前相比，诱导后细胞的端粒酶活性升高，体外培养细胞寿命更长。
实验用全骨髓贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，体外培养到第4代时可得到大量纯度较高、贴壁生长的骨髓间充质干细胞。利用慢病毒的高效转染特性，将hTERT基因导入骨髓间充质干细胞，得到的转化细胞表达hTERT阳性，细胞端粒酶活性提高。转染后的骨髓间充质干细胞仍呈现典型的长梭形或多角形，呈集落生长；高表达CD29、CD44，几乎不表达造血干细胞的表面标志CD34、CD45；胞浆特异性蛋白Nestin表达阳性，而不表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ；体外培养至第30代的基因转染组骨髓间充质干细胞生长增殖能力明显高于第14代未染组和空载体组骨髓间充质干细胞，而且维持其成骨、成脂、成神经分化特性，同时细胞染色体核型未见改变，裸鼠接种后未见致癌风险。
总之，利用慢病毒转染人端粒酶反转录酶基因成功构建永生化骨髓间充质干细胞株，为未来慢性神经病理痛的转基因细胞移植治疗研究提供了丰富的安全载体细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株

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