p53抑制剂对扩增晚期人骨髓间充质干细胞活力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：p53抑制剂能否直接干预骨髓间充质干细胞活力及其可能的机制尚不完全清楚。
目的：探讨p53抑制剂PFT-α对体外扩增培养晚期骨髓间充质干细胞衰老进程的影响，寻找延缓人骨髓间充质干细胞复制性衰老的关键靶点。
方法：qPCR检测扩增早、晚期人骨髓间充质干细胞p53、p21和p15 mRNA的表达。20 µmol/L p53抑制剂 PFT-α或等量二甲基亚砜分别作用晚期人骨髓间充质干细胞2周，β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老细胞阳性率，TUNEL染色法检测细胞凋亡情况。300 µmol/L H2O2作用于人骨髓间充质干细胞30 min，CCK-8法检测细胞抗氧化应激能力。
结果与结论：qPCR显示晚期人骨髓间充质干细胞p15，p21，p53 mRNA表达水平分别较早期人骨髓间充质干细胞增高(1.45±0.23)倍，(1.51±0.14)倍，(1.78±0.14)倍(P < 0.05)。PFT-α组衰老细胞阳性率(41±5)%低于二甲基亚砜组(63±7)%(P < 0.05)，但PFT-α组与二甲基亚砜组细胞凋亡率差异无显著性意义(P > 0.05)。经H2O2处理后，CCK-8结果显示PFT-α组吸光度值为二甲基亚砜组(1.27±0.13)倍(P < 0.001)，以上结果表明p53信号通路激活可能是导致人骨髓间充质干细胞衰老的重要因素，应用p53抑制剂PFT-α能够增强晚期人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 复制性衰老, 骨髓间充质干细胞, p53, PFT-α, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It is not fully understood that whether p53 inhibitor can directly intervene in the viability of bone marrow mesenchymal stem cells and the possible mechanism.
OBJECTIVE: To investigate the effect of p53 inhibitor, PFT-α, on the aging process of bone marrow mesenchymal stem cells in late-phase amplification and to discover the key target to delay the replicative senescence of human bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The expression levels of p53, p21, and p15 mRNA in human bone marrow mesenchymal stem cells in both early and late-phase amplification were detected by quantitative PCR assay. Then, human bone marrow mesenchymal stem cells in late-phase amplification were respectively treated with 20 µmol/L PFT-α or an equivalent amount of dimethyl sulfoxide for 2 weeks. The positive rate of aging cells was determined by SA-β-Gal staining. The apoptosis was detected by TUNEL staining. Human bone marrow mesenchymal stem cells were treated with 300 µmol/L H2O2 for 30 minutes, and then cellular anti-oxidative stress capacity was detected by cell counting kit-8 assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The quantitative PCR assay showed that the mRNA expression level of p15,
p21 and p53 in human bone marrow mesenchymal stem cells in late-phase amplification was significantly increased (1.45±0.23), (1.51±0.14) and (1.78±0.14) times as much as that in early phase amplification (P < 0.05). The positive rate of aging cells in PFT-α group was significantly lower than that in the dimethyl sulfoxide group [(41±5)% vs. (63±7)%, P < 0.05)]. However, there was no significant difference in apoptosis rate between PFT-α group and dimethyl sulfoxide group. After treatment with H₂O₂, the absorbance value in the PFT-α group was (1.27±0.13) times as much as that in the dimethyl sulfoxide group (P < 0.001). The above results demonstrate that the activation of p53 signaling pathway may be an important factor of causing aging of human bone marrow mesenchymal stem cells. Application of p53 inhibitor PFT-α can enhance the anti-oxidative stress capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells in late phrase amplification.

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Key words: 干细胞, 骨髓干细胞, 复制性衰老, 骨髓间充质干细胞, p53, PFT-α, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

中图分类号:

R394.2

贺泽斌，赵云鹤，杨桂姣，陆利. p53抑制剂对扩增晚期人骨髓间充质干细胞活力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3616-3620.

He Ze-bin, Zhao Yun-he, Yang Gui-jiao, Lu Li. Effect of p53 inhibitor on viability of human bone marrow mesenchymal stem cells in late-phase amplification [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3616-3620.

图/表（结果） 4

2.1 体外扩增培养人骨髓间充质干细胞衰老相关基因的表达变化见图1。

运用qPCR比较早、晚期人骨髓间充质干细胞衰老相关基因p15、p21、p53的表达变化，结果显示扩增晚期人骨髓间充质干细胞p15、p21、p53表达水平较早期显著增高，其中晚期人骨髓间充质干细胞p15 mRNA表达水平较早期细胞显著增高(1.45±0.23)倍(P < 0.05)，差异有显著性意义；晚期人骨髓间充质干细胞p21 mRNA表达水平较早期细胞显著增高(1.51±0.14)倍(P < 0.001)，晚期人骨髓间充质干细胞p53 mRNA表达水平较早期细胞显著增高(1.78±0.14)倍(P < 0.001)，差异有非常显著性意义。
2.2 p53抑制剂PFT-α对人骨髓间充质干细胞SA-β-Gal活性的影响 SA-β-Gal染色结果显示二甲基亚砜组阳性细胞着色较深(图2A)，阳性细胞率为(63±7)%(图2C)，而PFT-α组阳性细胞着色浅淡(图2B)，阳性细胞率为(41±5)%(图2C)，显著低于二甲基亚砜组(P < 0.05)，提示抑制p53活性能够延缓人骨髓间充质干细胞衰老进程。

2.3 p53抑制剂PFT-α对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示PFT-α组阳性细胞率(57.45±10.4)%与二甲基亚砜组(48.42±7.2)%相比较差异无显著性意义 (P > 0.05)，提示抑制p53活性并未影响晚期人骨髓间充质干细胞的凋亡(图3)。

2.4 p53抑制剂PFT-α增强人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力二甲基亚砜组与PFT-α组分别应用300 µmol/L H2O2处理30 min，CCK-8检测结果显示，PFT-α组细胞吸光度值是二甲基亚砜组的(1.27±0.13)倍(P < 0.001)，表明抑制p53活性能够增强人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力(图4)。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于2013-09-10/2014-07-18在山西医科大学解剖学实验室及中心实验室完成。
材料：

p53抑制剂干预后晚期人骨髓间充质干细胞活力检测所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清	HyClone
DMEM	Gibco
0.25%胰蛋白酶	Sigma
PFT-α，β-半乳糖苷酶染色试剂盒，TUNEL检测液	碧云天生物技术研究所
RNAiso PLUS提取试剂盒，5×PrimeScript^® RT Master Mix，SYBR^®Premix Ex Taq^TM试剂盒	TAKARA公司
CCK-8试剂盒	Dojindo
酶标仪	德国Thermo公司
倒置荧光显微镜	日本Olympus公司

人骨髓间充质干细胞购自 ScienCell Research Laboratory，标本采集自38岁健康男性青年捐献者。
实验方法：
细胞体外培养：人骨髓间充质干细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。在Olympus倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待贴壁细胞生长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代。依据体外传代次数将人骨髓间充质干细胞分为早期组(第3代或第4代)与晚期组(>10代)。
传代扩增晚期人骨髓间充质干细胞依照处理条件不同分为PFT-α组和二甲基亚砜对照组，其中PFT-α组每天用 20 µmol/L PFT-α作用4 h，连续2周，对照组加入等体积二甲基亚砜。
qPCR检测衰老相关基因的表达：选取早期和晚期人骨髓间充质干细胞，按照 RNAiso PLUS提取试剂盒说明书提取细胞内总RNA，分光光度法检测RNA浓度和纯度，5×PrimeScript® RT Master Mix冰浴反转500 ng RNA，取 2 μL反转录产物cDNA，采用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒配置反应体系，StepOnePlusTM System进行Real Time PCR扩增，采用??CT法进行相对定量分析。内参GAPDH引物序列为F：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，R：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’；目的基因p53引物序列为F：5’-GGA CCC TGT CAC CGA GAC CCC-3’，R：5’-GGG AGG AGA GTA CGT GCA CAT AAC AG-3’；目的基因p21引物序列为F：5’- GGA TGT CCG TCA GAA CCC AT-3’，R：5’- CCC TCC AGT GGT GTC TCG GTG-3’；目的基因p15引物序列为F：5’-TCT CCG TTG GCC GGA GGT CA-3’，R：5’-TGG CAG GGT CTG CGC AGT TG-3’，引物设计合成均由华大基因完成。
衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和衰老细胞计数：传代扩增晚期PFT-α组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞，制备细胞爬片，经PBS洗涤后，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色试剂盒固定液，室温固定15 min，弃去细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育过夜，普通光学显微镜下观察并计数胞浆被染成深蓝色细胞(即衰老细胞)的百分数。
TUNEL染色检测凋亡细胞：传代扩增晚期PFT-α组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，40 g/L多聚甲醛固定细胞30-60 min，PBS洗涤后加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min，PBS洗涤2次，加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，用抗荧光淬灭封固液封固后荧光显微镜下观察。
CCK-8法检测抗氧化应激损伤能力：传代扩增晚期PFT-α组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞，按照CCK-8试剂盒的操作步骤检测细胞的存活能力，将人骨髓间充质干细胞按1×103/孔接种于96孔板中，24 h后加入300 µmol/L H2O2作用30 min，随后更换为含10 µL CCK-8检测试剂的培养液，37 ℃培养箱孵育4 h，测定450 nm处吸光度。
主要观察指标：①倒置显微镜观察细胞形态。②实时荧光定量PCR技术检测衰老相关基因p53，p21，p15的表达水平。③传代扩增晚期PFT-α组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞的衰老细胞和凋亡细胞阳性率以及抗氧化应激损伤的能力。
统计学分析：结果采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据采用两独立样本t 检验，以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

人骨髓间充质干细胞是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞^[6]，并具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤后修复[7-8]。然而，组织工程需要高浓度细胞进行移植接种，源自体内的人骨髓间充质干细胞存在数量上的局限性，需经体外扩增后用于移植治疗^[9-12]。伴随体外扩增传代次数增多，人骨髓间充质干细胞出现老化现象，细胞增殖和分化潜能下降，为细胞治疗的临床应用带来了困难^[13-14]。因此，探索人骨髓间充质干细胞衰老的分子机制，研究开发延缓人骨髓间充质干细胞衰老的药物，维持人骨髓间充质干细胞活性将为衰老等相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。
p53在细胞周期调节、分化、衰老、凋亡等多种生物过程中发挥重要作用^[15]。Liu等^[16-18]的研究结果表明p53基因沉默能够延缓细胞衰老进程，而p53基因过表达可引起细胞胞体增大、衰老标志物β-Gal活性上调、细胞增殖能力下降等老化征象。近期Peng等[19]研究发现成体皮肤干细胞等生长停滞、衰老、凋亡和功能障碍与p53基因信号的改变相关。本实验运用qPCR检测发现晚期人骨髓间充质干细胞中p53、p21、p15表达较早期组显著增高^[20]，提示人骨髓间充质干细胞衰老，细胞活力降低可能与p53及其相关基因p21、p15激活有关。应用p53抑制剂PFT-α能够有效降低晚期人骨髓间充质干细胞中衰老标志物SA-β-Gal阳性细胞率，提示p53信号通路在人骨髓间充质干细胞复制性衰老中发挥关键性作用，抑制p53活性可延缓细胞老化。
氧化损伤是导致细胞衰老的重要因素。正常情况下，细胞内具有清除自由基的酶系统，氧化和抗氧化维持平衡^[21-23]。氧化应激状况下，活性氧产生过多，过多的氧自由基攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸、蛋白、核酸等，引起严重DNA损伤，基因组不稳定和继发突变，促使细胞老化甚至凋亡[24-27]。本实验用300 µmol/L H2O2处理人骨髓间充质干细胞30 min，CCK-8法观察PFT-α对细胞抗氧化应激损伤的影响。实验结果发现，PFT-α组人骨髓间充质干细胞的细胞活力较二甲基亚砜组明显增高，表明PFT-α可提高细胞抗氧化应激损伤能力，从而有效延缓细胞衰老。细胞凋亡是基因调控的细胞程序性死亡，与细胞衰老密切相关。近期Li等[28-29]研究发现，降低p53活性可抑制DNA损伤和染色体突变，提高多能诱导干细胞生存率。Gu等[30]研究表明p53-p21通路与非肥胖型糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞凋亡相关，但本研究显示抑制p53活性对晚期人骨髓间充质干细胞凋亡无明显影响，提示晚期人骨髓间充质干细胞凋亡可能受多因素多信号通路调控，其原因有待进一步研究探讨。
研究结果表明p53信号通路激活可能是导致人骨髓间充质干细胞衰老的重要因素，应用p53抑制剂PFT-α能够增强晚期人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力，从而延缓人骨髓间充质干细胞衰老进程，对维持干细胞活力推动其临床应用具有重要意义，但其具体分子机制仍有待深入研究。

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