2  结果  Results

2.1  实验动物数量分析  实验结束时，正常对照组、模型对照组、脂肪间充质干细胞组、内皮祖细胞组、联合移植组、糖皮质激素组小鼠数量分别为24，15，17，15，19，16只。

2.2  内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

2.2.1  内皮祖细胞形态  48 h再次接种后初期，大部分贴壁细胞为圆形，随后逐渐出现散在纺锤体形、梭形或三角形细胞，并有数个小型细胞集落，逐渐扩大融合，细胞密集时呈菱形、多边形致密排列，见图1。

2.2.2  内皮祖细胞的免疫荧光鉴定  见图2。

2.3  细胞的荧光标记  荧光标记的细胞接种1 d后于倒置荧光显微镜下观察，细胞膜着绿色荧光，细胞核不着色。锥虫蓝实验检测任意5个视野下拒染细胞占总细胞比例即细胞存活率>90%，这说明PKH67成功标记了细胞。

2.4  细胞移植后在体内追踪结果  见图3。

2.5  各组小鼠结肠长度、体质量、组织病理学评分、炎症因子水平  小鼠给予葡聚糖硫酸钠造模后，出现腹泻、血便、体质量下降，活动减少，毛发失去光泽，解剖后可发现结肠明显缩短，肠道出血等类似溃疡性结肠炎表现，部分小鼠造模后期因体质量下降过多或出血过多导致死亡。造模各组小鼠分别有不同程度死亡率，正常对照组则无此类表现，大便、体质量、活动、营养等均表现如常。视造模组小鼠情况在适宜的人道终点予以提前处死，其他小鼠在第12天时解剖后进行相关检测。

2.5.1  各组小鼠结肠长度  正常对照组、联合移植组、脂肪间充质干细胞组、糖皮质激素组、内皮祖细胞组、模型对照组的结肠长度分别为(9.210±0.733)，(7.710±0.675)，(7.010±0.555)，(6.440±0.626)，(5.790±0.533)，(5.870± 0.524) cm，见图4。正常对照组高于其他5组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；联合移植组低于正常对照组，但高于其他4组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；脂肪间充质干细胞组低于正常对照组、联合移植组，但高于其他3组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；糖皮质激素组低于正常对照组、联合移植组、脂肪间充质干细胞组，但高于其他2组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；内皮祖细胞组略低于模型对照组，但差异无显著性意义(P=0.739 > 0.05)。

2.5.2  各组小鼠疾病活动指数  联合移植组疾病活动指数各项评分最低，与其他各组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；脂肪间充质干细胞组、糖皮质激素组疾病活动指数各项评分与其他各组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；内皮祖细胞组与模型对照组比较差异无显著性意义，均明显高于其他各组(P < 0.05)，见表1。

2.5.3  各组组织病理学评分  联合移植组、脂肪间充质干细胞组、糖皮质激素组黏膜各层炎症细胞浸润较少，较局限，腺体结构基本完整，隐窝脓肿，隐窝炎少见，结肠黏膜各层结构基本完整、连续；内皮祖细胞组与模型对照组则表现为上皮损伤，连续性中断，毛细血管扩张并伴出血，隐窝变形，隐窝缺失，肉芽组织大量增生，炎症细胞广泛浸润，见图5。

近年来溃疡性结肠炎的发病率呈快速上升趋势，传统治疗方法存在疗效欠佳、需长期用药、不良反应较多等问题。目前，葡聚糖硫酸钠诱导的实验性结肠炎模型能较好地模拟溃疡性结肠炎的临床症状，其作用于肠道可引起Th2型细胞介导的炎症反应，与溃疡性结肠炎的发病机制也较类似^[1-2]。

间充质干细胞具有多分化潜能、可自我更新、低免疫原性等优点，能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多种细胞，作为组织工程种子细胞，为多种疾病如肾损伤^[3-5]、脊髓损伤^[6]、心肌梗死^[7]、系统性红斑狼疮、股骨头坏死等疾病提供全新的治疗策略^[8]。研究结果表明，间充质干细胞移植治疗溃疡性结肠炎安全、有效^[9]，但是其确切的治疗机制并不十分清楚。

内皮祖细胞是一种多能干细胞，不仅能自然分化为成熟血管内皮细胞，在一定的诱导条件下还可向平滑肌细胞、心肌细胞等多种细胞分化。它不仅参与出生前胚胎时期的血管生成，而且在出生后对血管新生、修复损伤血管内皮及功能维持有重要作用^[10-12]。

研究认为溃疡性结肠炎患者可能存在血管内皮功能障碍，内皮祖细胞数目较正常成人明显减少，凋亡增加^[13-15]。目前已在动物模型中证实内皮祖细胞对心肌梗死、下肢缺血等疾病有治疗效果，但对溃疡性结肠炎的治疗效果尚不清楚。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods

1.1  设计  细胞学实验，随机分组对比观察动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2014年3月至2015年3月在北京大学人民医院中心实验室进行。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康6-8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠158只，体质量19-22 g，由华阜康动物有限公司提供，许可证号：SYXK(京)2011-0010，所有小鼠均在同一条件下饲养，恒温恒湿，自由饮食饮水。

1.3.2  实验主要材料及试剂  DiI-acLDL(美国Vector公司)；葡聚糖硫酸钠(美国MP公司)；FITC-UEA-Ⅰ(美国Sigma公司)；DMEM (美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；M199培养基(美国Hyclone公司)；肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；抗荧光淬灭封固剂(碧云天生物有限公司)；PKH67试剂盒(美国Sigma公司)；DAPI (美国Sigma公司)；红细胞裂解液(索莱宝生物科技有限公司)；地塞米松磷酸钠(山东新华制药股份有限公司)。

1.3.3  实验主要仪器  CO₂培养箱(Thermo公司)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司)；普通显微镜(OLYMPUS公司)；冰冻切片机(Leica CM1900)。

1.4  实验方法

1.4.1  内皮祖细胞的分离、培养  ①将14只C57BL/6J小鼠脱颈处死，置于体积分数为75%乙醇烧杯中浸泡10 min；②将小鼠置于超净台内高压灭菌的弯盘中，用眼科剪沿腹中线剪开，分离附着在股骨和胫骨表面上的毛发、肌肉及筋膜，用PBS冲洗干净；③剪去两端的干骺端，用1 mL注射器抽取DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，冲洗所得骨髓液收集至离心管；④以1 200 r/min离心7 min得细胞沉淀，按1∶10加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温放置5 min；⑤离心后(1 200 r/min，10 min)弃上清，留细胞沉淀，PBS清洗2遍；⑥细胞计数，以体积分数为10%胎牛血清、      2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青链霉素、M199培养基配制的完全培养基调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1；⑦将其接种于包被人纤维连接蛋白的培养皿中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养；⑧接种后不换液直至第48小时，无菌吸管收集培养皿中培养基，离心(1 200 r/min，10 min)得细胞沉淀，重新接种于新培养皿中，之后每两三天更换1次培养基。

1.4.2  内皮祖细胞的免疫荧光鉴定  ①细胞换液后在培养皿中加入含DiI-acLDL的M199完全培养基使其终质量浓度为2.4 mg/L，孵育4 h；②用PBS轻轻浸洗2次，20 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，PBS浸洗3次，每次3 min；③加入含FITC-UEA-Ⅰ的M199完全培养基使其终质量浓度为10 mg/L，37 ℃孵育1 h；④用PBS浸洗3次，每次3 min，留少量PBS于培养皿中；⑤于荧光显微镜下观察FITC-UEA-Ⅰ的绿色荧光和DiL-acLDL的红色荧光。

1.4.3  脂肪来源间充质干细胞的分离、培养及鉴定  采用胶原酶消化加组织块贴壁法分离培养获得小鼠脂肪来源间充质干细胞^[16]，显微镜下细胞呈梭形，快速增殖呈漩涡状排列；细胞高表达CD29、CD44、CD90，不表达CD45；成骨诱导后碱性磷酸酶染色显示有黑色颗粒生成，茜素红S染色呈红色结节；成脂诱导后油红O染色显示有大量脂滴；细胞生长曲线显示第3-5天为对数增长期，细胞生长活力良好。

1.4.4  脂肪间充质干细胞和内皮祖细胞的荧光标记及观察  ①将上述培养的脂肪间充质干细胞传代培养至第4代，内皮祖细胞传代培养至第2代，消化细胞，PBS洗涤2遍，取约2×10⁷细胞重悬于PBS(少于25 µL)中，加入1 mL Diluent C；②取4 µL PKH67加入已装有1 mL Diluent C的Ep管中，将Ep管中混悬液加入已装有细胞和Diluent C混悬液的离心管中，立即混合均匀3 min，加入等量胎牛血清终止反应，1 300 r/min离心10 min，弃上清；③细胞以完全培养液(DMEM培养基、体积分数为10%胎牛血清、     100 U/mL青链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)洗涤3次，最后用1 mL生理盐水重悬，行锥虫蓝染色，死细胞着蓝色，活细胞拒染，任取5个独立视野计算细胞存活率平均值；同时接种部分标记细胞到35 mm培养皿，于第2天荧光显微镜下观察细胞荧光强度。

1.4.5  实验动物分组  C57BL/6J小鼠随机分为6组，每组24只，实验独立重复3次。正常对照组、脂肪间充质干细胞组、内皮祖细胞组、联合移植组、糖皮质激素组、模型对照组。除正常对照组外，其他5组小鼠自由饮用添加3%葡聚糖硫酸钠(相对分子质量40 000)的水5 d，随后饮用正常水7 d以建立溃疡性结肠炎模型，正常对照组小鼠为正常饮水。

1.4.6  细胞移植  取第4代脂肪间充质干细胞及第2代内皮祖细胞经胰酶消化后进行细胞计数。脂肪间充质干细胞组与内皮祖细胞组细胞用PKH67标记，联合移植组以PKH67标记脂肪间充质干细胞，标记方法如前。造模第7，10天时，脂肪间充质干细胞组、内皮祖细胞组小鼠经尾静脉注射0.2 mL脂肪间充质干细胞悬液(细胞数约2×10⁶)、0.2 mL内皮祖细胞悬液(细胞数约2×10⁶)；联合移植组经尾静脉注入0.2 mL脂肪间充质干细胞和内皮祖细胞混悬液(细胞数各约1×10⁶)；糖皮质激素组经尾静脉注射糖皮质激素(地塞米松磷酸钠)0.2 mL；模型对照组经尾静脉注入等量PBS；正常对照组不进行注射。

1.5  主要观察指标 

1.5.1  血清肿瘤坏死因子α水平  造模第12天时，各组小鼠眼睑采血后置于EDTA抗凝管，不断转动抗凝管15 min，在室温条件静置1 h，然后以3 000 r/min离心15-25 min，吸取上层淡黄色血清于新的Ep管，再次离心确定无红细胞沉淀即可。采用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子α水平，每个样品设置2个复孔。

1.5.2  荧光标记的细胞追踪观察  采血后处死小鼠，分离从肛门到回盲部组织，立即于冰上取材，OCT包埋，恒温冰冻切片机内制作肠组织冰冻切片(肠纵切面)，室温干燥后DAPI复染，滴加抗荧光淬灭剂封固后荧光显微镜下观察。

1.5.3  各组小鼠结肠长度、大体形态和组织学评分  采血后处死小鼠，将整个结肠自盲肠到肛门段取出，生理盐水冲洗，无张力状态下拉展平铺，测量各组小鼠结肠长度，体积分数为10%中性甲醛固定，乙醇中保存，脱水包埋，石蜡块行4 µm连续切片，烘烤，脱蜡，苏木精-伊红染色，由2名病理医生盲评给出组织学评估分数。依据如下标   准^[17]：①上皮损伤程度：正常形态为0分，杯状细胞缺失为1分，大面积杯状细胞缺失为2分，隐窝缺失为3分，隐窝大面积缺失为4分；②炎症细胞浸润程度：无炎症细胞浸润为0分，仅隐窝周围有炎症细胞浸润为1分，炎症细胞浸润到黏膜肌层为2分，炎症细胞广泛浸润，黏膜层水肿增厚为3分，炎症细胞浸润黏膜下层为4分。2项评分相加的总分即组织病理学评分。

1.5.4  各组小鼠疾病活动指数评分  每日观察各组小鼠症状、体质量等，计算造模第12天疾病活动指数：根据体质量下降百分比(< 1%为0分，1%-5%为1分，< 5%至≤10%为2分，< 10%至≤20%为3分，> 20%为4分)、粪便硬度(正常为0分，松散的大便为2分，腹泻为4分)、大便出血情况(正常0分，轻度出血/隐血阳性为2分，显性出血为4分)进行综合评分。

1.6  统计学分析  采用统计软件SPSS 17.0分析各组数据差异，P < 0.05为差异有显著性意义。结肠长度、血清肿瘤坏死因子α水平数据以均数±标准差表示，疾病活动指数各项评分、组织病理学评分以均数±标准误表示。各组数据之间比较采用单因素方差分析。

间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪组织和骨骼肌中。在体外，间充质干细胞可在不同诱导条件下向多系细胞分化而不受取材组织限制，在体内则依据其所移植部位组织器官来源不同而分化为相应的实质和间质细胞^[18]。很多动物实验已证明间充质干细胞移植入体内后可发挥抗炎、调节免疫、旁分泌作用^[19-25]、归巢并分化为某些类型的细胞如间质细胞、内皮细胞、血管周细胞等。间充质干细胞已被证实可修复皮肤创面^[26-28]、心肌梗死^[6]、血液系统恶性肿瘤、构建组织工程化骨^[29]、修复骨缺损^[30-31]。研究发现，间充质干细胞移植到实验鼠溃疡性结肠炎模型后可分化为内皮细胞，并认为其可通过分化内皮细胞促进肠道血液灌注和损伤愈合，缓解病情^[32]。

内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，研究显示，其在一定的诱导条件下还可向平滑肌细胞、心肌细胞等多种细胞的分化。它在血管新生、修复损伤血管内皮及功能维持中有重要作用^[33]，亦可作为组织工程种子细胞，用于心脑血管疾病、外周血管疾病、创伤愈合等方面^[10]。内皮祖细胞经典的分离和鉴定方法是从动物骨髓或外周血中分离出贴壁单个核细胞，并使用内皮细胞诱导培养基扩增，如能同时摄取acLDL和结合UEA-1则为内皮祖细胞。该实验将接种48 h后悬浮的细胞重新接种，使用M199培养基培养，较传统的直接接种法得到了均质性更高的内皮祖细胞。

内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞可以不经过诱导而自行转化为内皮细胞。溃疡性结肠炎患者的内皮祖细胞数目下降、功能受损，移植高活性的内皮祖细胞可以对其进行细胞补偿，这也是移植内皮祖细胞的初衷，然而作者的实验结果显示内皮祖细胞在移植后并未起到治疗小鼠溃疡性结肠炎的效果，这提示内皮细胞通过促进肠道血液灌注治疗溃疡性结肠炎的效果可能比较微弱，间充质干细胞的治疗效果可能更依赖其他机制，如调节免疫细胞功能、旁分泌细胞因子抑制免疫炎症反应、分化为其他类型的细胞来实现；其次，亦有部分研究发现间充质干细胞移植到溃疡性结肠炎模型后并未分化为内皮细胞^[34]，所以作者推测即使间充质干细胞在移植后一部分分化为内皮细胞，也可能与最终的治疗效果并无直接关联。

研究发现间充质干细胞移植后主要滞留于肺和其他非靶器官中，因此如何有效地提高间充质干细胞移植的效率，使在靶器官病变部位的间充质干细胞数目和功能最优化，值得关注和研究。近年来，研究发现内皮祖细胞除了可以分化为内皮细胞直接促血管生成，还可以通过旁分泌信号途径促进位于肺、肝和神经损伤组织部位的干细胞原位增殖。温丽^[35]体外研究证明内皮祖细胞可促进间充质干细胞增殖，提高其成骨、成脂分化潜能，有效维护间充质干细胞的细胞干性。LIN等^[36]将内皮祖细胞与间充质干细胞联合移植后，内皮祖细胞会在血液循环重建之前通过旁分泌方式营养支持间充质干细胞，有效抑制间充质干细胞过早凋亡，促进原位增殖，并保持间充质干细胞的干细胞特性。

间充质干细胞和内皮祖细胞通过不同的途径促进血管化和组织修复，都被用作组织工程的种子细胞。以往大多数研究都使用未经处理的单细胞移植，但是受制于细胞归巢、凋亡、增殖、无效滞留、分化能力等方面因素，治疗效果显著降低。为提高移植效率，越来越多学者采用对细胞进行预处理、基因修饰、联合生物活性因子或联合不同类型细胞共移植等以期获得更好治疗效果。近年来，多项研究发现间充质干细胞和内皮祖细胞联合移植与单独移植相比，可显著促进某些心血管疾病、脑血管疾病和骨再生、皮肤创伤修复过程中的组织再生、血管生成，从而改善心脏病患者的心脏功能、脑血管疾病患者的脑功能，以及增加受损骨组织的骨体积等^[37-39]，并推测其机制为内皮祖细胞有效促进受损组织血管新生，而间充质干细胞促进内皮祖细胞增殖，并提供稳定的微环境，促进组织修复中所需的其他细胞归巢。

该实验结果也显示脂肪间充质干细胞联合内皮祖细胞移植治疗溃疡性结肠炎的疗效优于单独治疗，虽然内皮祖细胞直接移植效果微弱，但联合移植时其可能一方面通过分化为内皮细胞促血管新生，改善病变部位血供，促进脂肪间充质干细胞增殖，另一方面通过旁分泌细胞因子营养支持脂肪间充质干细胞，并提高其增殖、分化能力，而脂肪间充质干细胞又可促进内皮祖细胞增殖，提高移植效率，形成良性循环，最终促进组织修复愈合，达到治疗效果。当内皮祖细胞单独移植到小鼠溃疡性结肠炎模型时，因病变肠道本身干细胞数目减少而作用有限，这可能也是内皮祖细胞移植效果不佳的原因之一。

该实验中按1∶1的比例进行脂肪间充质干细胞与内皮祖细胞联合移植时，其治疗效果优于单纯利用脂肪间充质干细胞移植(相当于2∶0的细胞比例)或内皮祖细胞移植(相当于0∶2细胞比例)，为达到最佳的治疗效果，探索最适宜的细胞比例以及移植细胞数量仍有待后续进一步实验研究。近年来进行的大多数临床试验只纳入了脂肪间充质干细胞1种细胞，由于使用2种或2种以上细胞会增加临床Ⅰ期试验的复杂性，但是人体是一个复杂的机体，要达到良好的治疗效果，往往需要不仅1种细胞，这可能也是一些单种细胞移植临床试验效果并不理想的原因。

近年来，越来越多的基础实验研究人员将间充质干细胞与内皮祖细胞联合应用于治疗心肌梗死、生物支架、组织工程骨等疾病中，在治疗性血管生成及疾病缓解方面均取得了比单独应用更好的效果，联合应用的前景广阔，或许未来可以为间充质干细胞在溃疡性结肠炎的治疗中提供一种新的优化策略。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

间充质干细胞：是一种具有多分化潜能、可自我更新、低免疫原性的多能干细胞，可从脂肪、骨髓、脐带、胎盘等多种组织中分离。在体外培养时，间充质干细胞可在不同诱导条件下向多系细胞分化，移植到体内后可分化为相应器官、组织的实质和间质细胞。

内皮祖细胞：ASAHARA等于1997年首次发现外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，将其命名为血管内皮祖细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。在一定的诱导条件下还可向平滑肌细胞、心肌细胞等多种细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

间充质干细胞和内皮祖细胞同属于组织工程种子细胞，尤其是间充质干细胞，近些年越来越多的研究证实其可在多项疾病领域发挥重要作用，因此备受广大学者关注。该研究再次证实了间充质干细胞具有缓解小鼠溃疡性结肠炎的效果，并创新性的联合内皮祖细胞共同移植，发现二者联合移植具有更好的治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程