2.1  人脂肪间充质干细胞鉴定及CD146阳性亚群分选结果  使用流式细胞仪分析第5代人脂肪间充质干细胞的细胞表型，见图1。结果显示细胞强烈表达人脂肪间充质干细胞相关标志物CD73、CD90；不表达造血干细胞相关标志物CD34、CD45、HLA-DR。培养的细胞中CD146细胞阳性率约15%。

采用免疫磁珠分选方法从人脂肪间充质干细胞中得到CD146阳性亚群细胞，应用倒置显微镜观察生长状况，见图2。人脂肪间充质干细胞和CD146阳性亚群细胞单层贴壁生长，形态不规则，细胞呈现长梭形。

2.2  CD146阳性亚群细胞特性及生物信息学分析  为了从整体分子水平比较CD146阳性亚群细胞与脂肪间充质干细胞功能的区别，采用基因芯片检测基因表达，通过筛选差异表达的基因进行生物信息学分析，见图3。结果显示部分基因在CD146阳性亚群细胞高表达，部分基因低表达。生物信息学分析结果显示差异基因在骨骼肌肉疾病富集，同时与炎症通路相关，证实CD146阳性亚群细胞具有不同分子功能。

2.3  CD146阳性亚群细胞成软骨分化能力  成球诱导 28 d，2种细胞均有良好的软骨球形态，见图4；阿利新蓝染色检测软骨组织中酸性黏多糖，可见2种细胞着色良好，糖胺多糖含量较高；苏木精-伊红染色结果显示2种细胞诱导成的软骨球基质丰富；Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示2种软骨球均强阳性表达Ⅱ型胶原，并且CD146阳性亚群细胞表达的Ⅱ型胶原要相对多于人脂肪间充质干细胞。综上所述，人脂肪间充质干细胞与CD146阳性亚群细胞均具有成软骨分化能力，且CD146阳性亚群细胞产生更多的Ⅱ型胶原，一定程度上证明CD146阳性亚群细胞成软骨分化能力要优于人脂肪间充质干细胞。

2.4  人脂肪间充质干细胞及CD146阳性亚群细胞冻存后生物学特性  通过对比可知，复苏后CD146阳性亚群细胞活性要高于人脂肪间充质干细胞，复苏后CD146阳性亚群细胞凋亡要远远低于人脂肪间充质干细胞，见图5。

软骨组织为高度特化的结缔组织，其特点是组织中缺乏血管、神经及淋巴管，细胞外基质呈致密的固态，软骨细胞被大量的细胞外基质(如胶原纤维、蛋白多糖等)包绕，导致了软骨组织损伤后有限的自我修复与再生能力^[1]。早期软骨损伤治疗主要是对症治疗，内科治疗包括非类固醇类消炎止痛药、关节腔内注射类固醇、透明质酸酶、口服软骨营养药，外科治疗包括软骨下钻孔或微骨折、自体骨软骨移植、异体软骨移植、骨膜和软骨膜移植术等^[2-7]，但均得不到良好的治疗效果。近年来软骨组织工程技术为关节软骨损伤再生修复带来了新的希望^[8-9]。

软骨组织工程包括3大要素：种子细胞、细胞因子和支架。间充质干细胞来源广泛，易体外培养，具有强大的增殖能力、调节免疫功能及多向分化潜能^[10]，大量研究应用其作为软骨组织工程中理想的种子细胞^[11-13]。然而，间充质干细胞并不是由单一种类细胞所组成的，而是一种具有异质性的细胞群体，不能通过单一的表面标记物进行识别和分离^[14]，其中不同的亚群细胞具有不同的自我更新及分化能力^[15]。间充质干细胞的这种细胞异质性影响其治疗结果。在发育与人体器官形成过程中，间充质干细胞起源于2种血管周围的细胞即周细胞和外膜细胞，CD146是周细胞主要分子标记之一^[16-17]。

CD146(也称为MUC18，MCAM，Mel-CAM或S-Endo1)是一种跨膜糖蛋白，同时属于免疫球蛋白超级家族的一  员^[18]。在人体组织中，CD146阳性细胞被认为是微血管的壁细胞^[19-20]。在胚胎阶段，CD146表达存在于神经嵴、脊索、中肾、外胚层、体节和初步形成的骨骼肌中^[21]。在人体骨髓中，CD146表达于膜网状细胞中，被定义为窦周细胞^[22]，这些细胞在移植后具有自我更新能力，失去CD146表达后则丧失了自我更新能力^[22-23]。HAGMANN等^[24]发现富集CD146阳性骨髓间充质干细胞后糖胺多糖/ DNA含量增加。WU等^[25]报道了来自人类脐带细胞的CD146阳性亚群可以治疗关节炎，并通过抑制白细胞介素6提供抗炎保护微环境。SU等^[26]发现CD146阳性软骨祖细胞具有更高水平的间充质干细胞特异性标志物表达，具有更好的软骨分化能力。因此，作者推测人脂肪间充质干细胞中CD146阳性亚群具有更好的促进软骨修复的潜力。

与骨髓间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞在体外培养可以稳定多次代数，且具有较高的增殖率和较低的衰老率。人脂肪间充质干细胞可通过腹部抽脂术获得，一次手术可以获得大量细胞，手术过程也更加安全、无痛、可靠^[27-29]。最近ZHOU等^[30]一项研究表明，在治疗骨关节炎方面，脂肪间充质干细胞具有稳定的生物学特性，来源更加可控，细胞更加适应关节腔微环境，并且在炎症调节方面更具优势。 

该研究旨在从人脂肪间充质干细胞中分离出CD146阳性亚群细胞作为软骨组织工程种子细胞。应用流式细胞仪分析人脂肪间充质干细胞表面分子标记表达及CD146阳性亚群比例，利用免疫磁珠分选技术富集CD146阳性亚群细胞，比较人脂肪间充质干细胞和CD146阳性亚群细胞的特性，包括形态学、基因表达及成软骨分化能力，并探究了其未来应用的储存方式。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年6月至2019年6月在解放军总医院骨科研究所完成。

1.3  材料

1.3.1  细胞  人脂肪间充质干细胞由浙江金时代生物技术有限公司提供。该细胞依据《中国药典》2015年版第三部、《中国生物制品规程》，检测合格。

1.3.2  实验试剂和仪器  DMEM/F12细胞培养基(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Corning公司)；磷酸盐缓冲液(中国Solarbio公司)；流式抗体PE-CD34、PE-CD73、FITC-CD45、FITC-HLA-DR、FITC-CD90、PE-CD146(美国BD公司)；Muse count & viability、Muse Annexin & Dead Cell试剂盒(德国MIILLIPORE公司)；OriCell成人脂肪间充质干细胞成软骨诱导试剂盒(中国Cyagen Biosciences公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  人脂肪干细胞流式鉴定  人脂肪间充质干细胞以适当密度种植于T75培养瓶中，每瓶约15 mL DMEM/F12培养基(含体积分数为10%胎牛血清)，放入37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中培养，每间隔两三天换1次液，密度达到80%覆盖瓶底后传代，PBS清洗后加入含0.25% EDTA的胰酶消化，待细胞缩小变圆后加入含胎牛血清的DMEM/F12培养基中止消化。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，300×g离心10 min后按照1∶2的比例重新种入培养瓶中。取第5代人脂肪间充质干细胞，经胰蛋白酶消化、血清中和、离心、PBS重悬后，以1×10⁹ L^-1细胞浓度置于流式管中，100 μL体系中分别加入10 μL PE-CD34、FITC-CD45、FITC-HLA-DR、PE-CD73、FITC-CD90、PE-CD105及PE-CD146抗体，避光孵育30 min，PBS洗涤2次，转移至流式分析管，上机检测，并应用Cell-Quest (MAC)进行数据采集及其分析。

1.4.2  CD146阳性亚群细胞免疫磁珠分选  取第5代人脂肪间充质干细胞，经胰蛋白酶消化、血清中和、离心、PBS重悬，转移10⁷个细胞至15 mL离心管中，300×g离心     10 min，移去上清，使用60 μL MACS Separation Buffer重悬10⁷个人脂肪间充质干细胞，加入20 μL FcR Blocking Reagent，再加入20 μL CD146 MicroBeads，完全混合后在冰箱2-8 ℃孵育15 min，加入1 mL Buffer重悬，300×g离心10 min，除去上清，再加入500 μL buffer重悬。将细胞分离柱置于无菌磁珠磁铁上，使用3 mL buffer清洗1次。加入细胞进行分选，待液体完全通过，加入buffer清洗细胞分离柱3次，每次3 mL。转移细胞分离柱至新的收集管上，加入5 mL buffer，立即推出所有液体，得到的液体离心所得细胞为CD146阳性亚群细胞。

1.4.3  CD146阳性亚群细胞基因芯片检测及生物信息学分析  使用Trizol试剂从人脂肪间充质干细胞和新分选的CD146阳性亚群细胞中提取总RNA，并用mirVana mRNA分离试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)纯化。使用RNA 6000 Nano Lab-on-a-Chip试剂盒和Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)测定RNA完整性，RNA完整性值>6的RNA提取物用于进一步分析。使用Agilent人mRNA阵列进行基因表达分析。借助Capitalbiotech分析阵列数据，通过使用GeneSpring软件V13(Agilent)进行数据汇总，归一化和质量控制。为了选择差异表达的基因，使用≥2和≤0.5倍变化的阈值和使用Benjamini-Hochberg方法校正的P 值，利用CLUSTER 3.0软件的数据调节功能，对数据进行log(2)-转换，用平均连锁的层次聚类进一步分析数据。应用Java Treeview(斯坦福大学医学院，斯坦福，加利福尼亚州，美国)进行树可视化。基因本体论(GO)途径富集分析由WEGO (http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)进行。

1.4.4  CD146阳性亚群细胞成软骨分化鉴定及组织学检测  成软骨诱导分化完全培养基按产品说明书临用前配制，分别消化等量人脂肪间充质干细胞与CD146阳性亚群细胞，转移至15 mL离心管中，3×10⁵/管，250×g离心5 min，吸弃上清后每管加入0.5 mL预混液重悬，150×g离心     5 min，预混液再次重悬，150×g离心5 min，弃上清后每管加入0.5 mL含转化生长因子β3的软骨诱导分化完全培养基，150×g离心5 min，拧松瓶盖，37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养。当细胞成球聚拢后(24-48 h)，轻轻弹离心管管底，使细胞球漂浮，每两三天换液，诱导培养至28 d。

将诱导成功的软骨球使用40 g/L多聚甲醛固定，置于包埋盒中，脱水机梯度脱水后包埋，切片，然后进行阿尔新蓝染色、苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色观察。

1.4.5  CD146阳性亚群细胞冻存前后活性率及凋亡检测  收集未分选人脂肪间充质干细胞和CD146阳性亚群细胞，使用冻存液(二甲基亚砜∶血清∶DMEM为1∶3∶6)液氮冻存4周后复苏。将复苏的细胞应用Muse count & viability试剂盒与Muse Annexin & Dead cell试剂盒检测细胞活性和凋亡情况。

1.5  主要观察指标  ①人脂肪间充质干细胞中CD146阳性亚群分选结果；②CD146阳性亚群细胞特性及生物信息学分析；③CD146阳性亚群成软骨分化能力。

关节软骨损伤发病率高，缺乏有效治疗策略，一直以来是困扰人类的世界性难题。在传统治疗手段不能完全达到正常软骨水平修复的情况下，组织工程再生技术的出现为这一世界性难题的攻克提供新的可能。目前应用的软骨组织工程种子细胞均有一定缺点：①自体软骨细胞：来源局限，取材损伤大，增殖能力弱，体外扩增培养过程中容易丧失软骨细胞表型^[31]；②同种异体软骨细胞：存在一定的免疫排斥风险，并且有传播疾病的风险^[32]；③胚胎干细胞：临床应用存在伦理问题^[33]；④骨髓干细胞：取材创伤大，获取量有限^[34]。选择一种最为有效的细胞治疗策略以及探讨干细胞在修复过程中的机制是当前国内外科研工作者研究的重点。组织工程选用的种子细胞应满足相关要求，例如来源广泛、取材方便；细胞活性和增殖能力强；能够与支架良好融合以及免疫原性较低等。脂肪间充质干细胞来源于脂肪组织，是继骨髓间充质干细胞之后在干细胞领域展开广泛研究的一类成体干细胞，其来源充足、提取容易、损伤低、产量高、分离简单、增殖力强、具有多向分化潜能，是软骨组织工程种子细胞的热门选择^[35]。以CD146为标记的血管前体细胞发育起源性高于人脂肪间充质干细胞，通常被认为是间充质干细胞的起源，并且同样具有良好的分化特性^[36]。ESTEVES等^[37]对马脂肪组织间充质干细胞CD146阳性亚群细胞和CD34阳性亚群细胞进行比较，证明了CD146阳性亚群细胞具有更强的诱导分化能力。CD34阳性亚群细胞也可能是很好的软骨组织工程种子细胞，将在未来的工作中进行研究。

人脂肪间充质干细胞传代10代以内基本表型稳定。该研究选取第5代脂肪间充质干细胞，其不表达造血干细胞相关标记物HLA-DR、CD34、CD45，高表达干细胞表面标记物CD73、CD90，说明用于分选的细胞具有良好的干细胞特性。流式分析结果显示CD146阳性细胞含量约为15%。采用免疫磁珠分选的方式从人脂肪间充质干细胞中分选CD146阳性亚群。免疫磁珠与流式细胞术均为最为常见的分选技术，其中流式细胞术分选具有纯度较高(90%以上)、多参数分选的特点，并能实现低表达细胞的分选与胞内荧光信号的分选。然而大量细胞分选时由于用时较长，其纯度亦不能保证。免疫磁珠分选技术能保证80%以上阳性率，在组织工程细胞分选应用中获得国际认可，同时具有对细胞危害小、操作简便、分选过程的敏感性和选择性好等优点^[38]，更利于后期实验，对于该实验的单参数分选更加适合。

基因芯片检测结果显示CD146阳性亚群细胞基因表达与分选前有明显差别，差异基因功能主要表现在骨骼肌肉系统疾病与炎症通路，证实CD146阳性细胞为功能差异亚群，基因表达的差异可能使其具有不同的修复能力。

基于干细胞的软骨组织工程再生技术中，直接分化为软骨细胞是其修复关节软骨缺损的重要机制^[39]。该实验将CD146阳性亚群细胞与人脂肪间充质干细胞体外微球化成软骨诱导培养28 d，检测诱导培养得到的类软骨微球组织学特征(阿利新蓝染色、苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色)。阿利新蓝染色可以反映糖胺多糖相对含量，糖胺多糖为正常软骨细胞外基质中组成成分，苏木精-伊红染色显示类软骨微球中细胞与细胞外基质情况，Ⅱ型胶原免疫组化染色特异性反映组织中Ⅱ型胶原的表达量及位置存在差异。该实验中2种细胞均能诱导成形态良好的软骨球，阿利新蓝及苏木精-伊红染色结果无明显差异，CD146阳性亚群细胞表达的Ⅱ型胶原免疫组化着色更深，证明人脂肪间充质干细胞与CD146阳性亚群细胞均有较好的成软骨分化能力，且后者产生更多的Ⅱ型胶原。

细胞冻存复苏后保持较高的增殖特性是其能在组织工程领域广泛应用的基本保证之一，冻存中细胞处于低代谢状态，于瑶等^[40]对冻存4周复苏后的人耳软骨细胞体外成软骨能力进行研究，证明细胞冻存复苏对人耳软骨细胞的细胞活力、增殖和体外/体内软骨再生能力无明显影响。薛鹏举等^[41]研究证明了冻存2周后复苏处理未能使髓核细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量减少，细胞增殖活力亦未降低。临床应用自体干细胞移植可以在吸脂术后1个月内进行移植手术，1个月内细胞状态良好，可以满足临床应用需要。因此该研究将免疫磁珠分选得到的CD146阳性亚群细胞扩增培养后液氮冻存4周，复苏后利用多功能细胞流式分析仪对2种细胞进行活力计数及凋亡检测。结果显示，CD146阳性亚群细胞早期凋亡、晚期凋亡及死亡细胞率均低于人脂肪间充质干细胞，证实了冻存后CD146阳性亚群细胞比人脂肪间充质干细胞存活状态好，未来会对该亚群细胞长期冻存稳定性展开研究。

综上所述，该研究分析了人脂肪间充质干细胞相关细胞表面分子及CD146阳性亚群比例，成功从人脂肪间充质干细胞中分选获得CD146阳性亚群细胞，该亚群细胞具有良好增殖特性，存活状态良好；基因芯片检测出CD146亚群细胞与人脂肪间充质干细胞存在表达差异，揭示作为种子细胞的潜在机制；CD146阳性亚群细胞与人脂肪间充质干细胞均有良好的成软骨分化能力，在经过冻存处理后，CD146亚群细胞具有更高的活性，更适于进一步研究。在今后研究中，将进一步验证CD146阳性细胞作为更优选择种子细胞的机制，如免疫原性、体内软骨缺损修复能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

CD146：也称为MUC18，MCAM，Mel-CAM或S-Endo1，是一种跨膜糖蛋白，同时属于免疫球蛋白超级家族的一员。在人体组织中，CD146阳性细胞被认为是微血管的壁细胞，其具有较强的增殖、迁移及自我更新能力。

组织工程种子细胞：组织工程包括3个关键要素——种子细胞、支架和活性因子，其中种子细胞应具有良好的细胞活性、增殖能力、分化及合成基质等生物功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

目前间充质干细胞由于具有良好的增殖、分化及系统调节能力，其作为组织工程种子细胞的研究应用广泛。然而间充质干细胞是由不同功能细胞亚群构成的异质性群体，其治疗效果受亚群分布的影响。因此，选取特异细胞功能的亚群作为组织工程种子细胞可能具有更好的效果。该研究从脂肪间充质干细胞中分选CD146阳性细胞亚群探讨其作为软骨组织工程种子细胞的能力，为未来基于干细胞亚群的软骨修复及应用打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程#br#