人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3532

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 2976-2981.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3532

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化

李聪聪1，2，姚楠1，2，3，黄丹娥1，2，3，宋敏1，2，彭莎1，2，3，李安安1，2，卢超2，刘文刚1，2

1广州中医药大学第五临床医学院，广东省广州市 510095；2广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)，广东省广州市 510095；3广东省中医药研究开发重点实验室，广东省广州市 510095

收稿日期:2020-07-04 修回日期:2020-07-06 接受日期:2020-08-29 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 刘文刚，博士，主任中医师，博士生导师，广州中医药大学第五临床医学院，广东省广州市 510095；广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)，广东省广州市 510095
作者简介:李聪聪，女，1995年生，河南省商丘市人，广州中医药大学在读硕士，主要从事骨关节退行性疾病研究。
基金资助:
广东省自然科学基金项目(2018A030313584)，项目负责人：姚楠；广东省中医药局科研项目(20183001)，项目负责人：刘文刚；广东省医学科学技术研究基金项目(A2020071)，项目负责人：卢超

Identification and chondrogenic differentiation of human infrapatellar fat pad derived stem cells

Li Congcong1, 2, Yao Nan1, 2, 3, Huang Dane1, 2, 3, Song Min1, 2, Peng Sha1, 2, 3, Li Anan1, 2, Lu Chao2, Liu Wengang1, 2

1The Fifth Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; 2Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital (Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China

Received:2020-07-04 Revised:2020-07-06 Accepted:2020-08-29 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Liu Wengang, MD, Chief TCM physician, Doctoral supervisor, The Fifth Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital (Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510095, Guangdong Province, China
About author:Li Congcong, Master candidate, The Fifth Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital (Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510095, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2018A030313584 (to YN); the Scientific Research Project of Guangdong Provincial Traditional Chinese Medicine Bureau, No. 20183001 (to LWG); the Medical Science and Technology Research Fund of Guangdong Province, No. A2020071 (to LC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
髌下脂肪垫干细胞：髌下脂肪垫干细胞具有向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞及内皮细胞等细胞定向分化的能力，且其增殖能力、分化能力强和免疫应答能力弱，是很有临床运用前景的种子细胞，必将在软骨组织工程等多个领域发挥重要作用。
软骨：软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞形式，关节软骨主要由软骨细胞(约占软骨组织的5%)和软骨细胞外基质(约占软骨组织的95%)组成，软骨细胞分泌的物质往往具有合成或分解软骨细胞外基质的功能。骨关节炎的主要病理改变是关节软骨的退变和损伤，由于缺乏神经分布和血管供应，软骨一旦损伤将很难自我修复。

背景：人髌下脂肪垫是在全膝关节置换手术中经常被切除的废弃物，如果充分加以利用可以作为间充质干细胞的主要来源用于软骨组织工程。
目的：探索人髌下脂肪垫干细胞体外分离、培养及鉴定方法，并在特定条件下诱导其成软骨分化，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。
方法：获取8例人工膝关节置换术患者废弃的髌下脂肪垫，综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原蛋白酶消化法及差速贴壁法分离培养人髌下脂肪垫干细胞，体外培养至第3代后进行细胞形态学观察、细胞生长曲线以及细胞表面抗原分析，然后进行成软骨诱导分化，通过免疫组化和甲苯胺蓝染色以及RT-qPCR方法对人髌下脂肪垫干细胞成软骨分化能力进行鉴定。
结果与结论：①分离纯化及培养出的人髌下脂肪垫干细胞呈梭形贴壁生长，第3代细胞生长曲线呈“S”形，CD44、CD105呈阳性表达，而CD45呈阴性表达；②成软骨诱导14 d后，诱导分化组免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性，并且ACAN、BMP-2、COL2A1和SOX-9的基因相对表达量明显高于空白对照组；③该研究证实了从髌下脂肪垫中可分离出具有分化潜能的间充质干细胞，其具有较强的体外增殖能力以及成软骨分化能力，有望成为软骨组织工程理想的种子细胞。
https://orcid.org/0000-0002-9678-1440(李聪聪)；https://orcid.org/0000-0002-8887-8429(刘文刚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 髌下脂肪垫干细胞, 骨关节炎, 鉴定, 成软骨分化, 种子细胞

Abstract: BACKGROUND: Human subpatellar fat pad is a kind of waste, which is often removed in total knee arthroplasty. If it is fully utilized, it can be used as a source of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore the methods of isolation, culture and identification of human infrapatellar fat pad derived stem cells in vitro, to induce chondrogenic differentiation under specific conditions, and to explore the feasibility of being used as seed cells for cartilage tissue engineering.
METHODS: The discarded infrapatellar fat pad from eight patients undergoing the total knee arthroplasty was obtained and human infrapatellar fat pad derived stem cells were isolated and cultured according to trypsin digestion, type I collagenase digestion and differential adherence methods. After being cultured to the third generation in vitro, cell morphology observation, cell growth curve and cell surface antigen analysis were performed. In addition, chondrogenic differentiation was induced, and human infrapatellar fat pad derived stem cells were identified by immunohistochemistry, toluidine blue staining and RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Isolated, purified and cultured human infrapatellar fat pad derived stem cells showed spindle-shaped adherent growth. The growth curve of the third generation of human infrapatellar fat pad derived stem cells was in the shape of “S”. Cells were positive for CD44 and CD105, while negative for CD45. (2) After 14 days of induction, immunohistochemical staining and toluidine blue staining were positive in the differentiation group, and the relative gene expression levels of ACAN, BMP-2, COL2A1 and SOX-9 were significantly higher than those in the blank control group. (3) This study confirmed that mesenchymal stem cells with differentiation potential could be isolated from infrapatellar fat pad, which had strong proliferation ability and chondrogenic differentiation ability in vitro, and were expected to become ideal seed cells for cartilage tissue engineering.

Key words: stem cells, infrapatellar fat pad derived stem cells, osteoarthritis, identification, chondrogenic differentiation, seed cells

中图分类号:

李聪聪, 姚楠, 黄丹娥, 宋敏, 彭莎, 李安安, 卢超, 刘文刚. 人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2976-2981.

Li Congcong, Yao Nan, Huang Dane, Song Min, Peng Sha, Li Anan, Lu Chao, Liu Wengang. Identification and chondrogenic differentiation of human infrapatellar fat pad derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 2976-2981.

图/表（结果） 5

2.1 IPFP-ASCs的形态将第3代IPFP-ASCs接种到培养板中，4 h后显微镜下可见少量细胞开始贴壁生长，形态以圆形或椭圆形为主；第2天已有较多细胞贴壁，并且呈长梭形或短梭形，见图1A；第3天细胞数量略有增加，形态仍为长梭形或短梭形；随后进入对数生长期，在第5天IPFP-ASCs形态主要呈长梭形，细胞形态与成纤维细胞相似，并且大小均一，见图1B；在第8天细胞基本铺满培养板底部，并且排列紧密，达到融合时呈螺旋状生长，见图1C。

2.2 IPFP-ASCs的增殖活力根据CCK-8法连续10 d的检测结果绘制生长曲线，第3代IPFP-ASCs生长曲线呈“S”形，细胞潜伏期约为3 d，第4天进入对数生长期，第8天达生长高峰，此后进入平台期，生长速度明显减慢，见图2。

2.3 IPFP-ASCs的表面抗原取第3代 IPFP-ASCs，通过流式细胞术鉴定细胞表面特异性标记物CD44、CD45和CD105，结果显示细胞群中CD44和CD105均为高表达，且阳性表达率均高于95%，而CD45呈阴性表达，且阴性表达率小于2%，见图3。

2.4 IPFP-ASCs成软骨诱导分化后相关染色鉴定结果在诱导分化14 d时，免疫组化染色显示诱导分化组细胞胞浆和细胞间质内出现棕黄色颗粒，表明诱导后细胞的Ⅱ型胶原免疫组化结果为阳性，见图4A；在诱导分化14 d时，甲苯胺蓝染色显示诱导分化组细胞呈现蓝紫色，表明诱导后细胞的甲苯胺蓝染色结果为阳性，见图4B。

2.5 IPFP-ASCs成软骨诱导分化后相关基因表达如图5所示，在诱导分化14 d时，与空白对照组相比，诱导分化组IPFP-ASCs的ACAN、BMP-2、COL2A1和SOX-9 mRNA表达明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2019年12月至2020年6月在广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)中药药理(毒理)研究室的分子生物学实验室和细胞培养室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、双抗、DPBS和ITS-G(100×)(美国Gibco公司)；胎牛血清(澳大利亚Bovogen公司)；Ⅰ型胶原酶、地塞米松、维生素C和脯氨酸(美国Sigma公司)；重组人转化生长因子β3(美国Peprotech
公司)；CD44-PE-Cyanine7、CD45-FITC抗体(美国Tonbo
Biosciences公司)；CD105-PE抗体(美国eBioscience公司)；4%组织细胞固定液、Trigol试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；PrimeScript RT Master Mix、TB Green® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)(大连宝生物工程有限公司)；Ⅱ型胶原抗体(美国Proteintech公司)；甲苯胺蓝染液(南京建成科技有限公司)；苏木精染液(上海碧云天生物技术有限公司)；兔Streptavidin-HRP试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；CCK-8试剂盒(上海东仁化学科技有限公司)；TritonX-100(美国Sigma公司)；相关基因引物(上海英潍捷基贸易有限公司)。
1.3.2 实验仪器 Cellometer Mini自动细胞计数仪(美国
Nexcelom公司)；FC500流式细胞仪(美国Beckman公司)；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；3K30冷冻高速离心机(德国Sigma公司)；Class II Type B2生物安全柜(新加坡Esco公司)；3111CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；DMI8倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；40 μm细胞过滤网(美国Biologix公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 IPFP-ASCs的获取在广东省第二中医院骨科行全膝关节置换术中切取的8例患者废弃的髌下脂肪垫用于分离培养IPFP-ASCs，患者年龄60-75岁，无糖尿病、肝炎、痛风性关节炎及代谢性疾病。该研究获得了广东省第二中医院伦理委员会批准以及患者知情同意。
无菌条件下获取患者废弃的髌下脂肪垫，将其移入无菌操作台，首先用无菌眼科剪剪掉肉眼可见的红色血管以及白色结缔组织，然后将剩余脂肪组织剪成1.0-2.0 mm3碎块，DPBS清洗2次，每次5 min；然后用0.25%胰蛋白酶在37 ℃
消化1 h；吸弃0.25%胰蛋白酶，加入用不含血清的高糖DMEM培养基配制的0.2%Ⅰ型胶原酶溶液，消化过夜，第2天转移至50 mL离心管内，小心吸取下层液体然后经过40 μm
细胞过滤网过滤，再转移至15 mL离心管，1 500 r/min离心，沉淀用2 mL基础培养基(高糖DMEM培养基+体积分数为10%胎牛血清+1%双抗的溶液)溶解并且转入细胞培养瓶中，放入37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，一两天后可见细胞贴壁生长，即为原代IPFP-ASCs。将得到的原代IPFP-ASCs培养24 h后进行半量换液，48 h后进行全量换液，之后每2 d换液1次，培养5-7 d后原代IPFP-ASCs可生长融合达到90%以上，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3比例传代接种到新的细胞培养瓶中持续体外培养。
1.4.2 IPFP-ASCs的形态观察取第2代长满培养瓶的
IPFP-ASCs，用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心10 min，
用基础培养基重悬并调整细胞浓度约为5×107 L-1，以每孔100 µL接种于10个96孔板中即为第3代IPFP-ASCs，将该细胞置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中连续培养10 d，在不同时间用光学显微镜观察并拍摄细胞形态和增殖状况。
1.4.3 CCK-8检测IPFP-ASCs的增殖活力取第2代长满培养瓶的IPFP-ASCs，用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心10 min，用基础培养基重悬并调整细胞浓度约为5×107 L-1，
以每孔100 µL接种于10个96孔板中即为第3代IPFP-ASCs，
将该细胞置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中连续培养10 d，从第2天起，每天取1个96孔板，每孔加入CCK-8溶液10 µL，相同条件下继续培养4 h，然后用多功能酶标仪检测450 nm条件下各孔的吸光度值，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制生长曲线。
1.4.4 流式细胞仪检测IPFP-ASCs的表面抗原取第3代长满培养瓶的IPFP-ASCs，用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心10 min后，尽量弃去上清液，500 μL DPBS溶解沉淀，再分别吸取100 μL到5个流式细胞仪专用管中，分别为阴性组、CD44组、CD45组、CD105组和CD44+CD45+CD105组，CD44、CD45、CD105组分别加入1 μL相应抗体，CD44+CD45+
CD105组加入3种抗体，每种抗体均为1 μL，阴性组不加任何抗体，充分混匀后室温避光静置25 min，然后每管加入
4 mL鞘液， 1 500 r/min离心5 min后小心轻轻倒掉上清液，用600 μL鞘液溶解混匀底部的沉淀，避免生成气泡，放入流式细胞仪进行检测。
1.4.5 IPFP-ASCs成软骨诱导分化将第3代IPFP-ASCs计数后以1×104个/孔铺在装有细胞爬片的6孔板中，分为2组：空白对照组继续用基础培养基培养，诱导分化组在此培养基中加入10 µg/L 转化生长因子β3、100 nmol/L地塞米松、1% ITS-G、50 mg/L 维生素C以及40 mg/L 脯氨酸，所有细胞均为每2 d换液1次，连续培养第14天收集细胞。
1.4.6 免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色在成软骨诱导第14天时，将两组细胞的细胞爬片取出后用4%组织细胞固定液将其固定15 min，DPBS洗涤3次，每次5 min；用0.1% TritonX-100浸润15 min，DPBS洗涤3次，每次5 min；用内源性过氧化物酶封闭液室温孵育10 min，DPBS充分淋洗；用羊血清工作液室温孵育10 min后甩干；加入稀释好的Ⅱ型胶原蛋白一抗抗体(1∶1 000)在37 ℃孵育2 h，DPBS充分淋洗；加入生物素标记羊抗兔二抗工作液，室温孵育10 min，
DPBS充分淋洗；加入HRP标记的链霉亲和素，室温孵育
10 min，DPBS充分淋洗；最后用DAB显色，显色后用苏木精复染1 min，通过水洗终止显色，将其用于免疫组织化学染色鉴定。另取细胞爬片，用4%组织细胞固定液将其固定15 min，DPBS洗涤3次，每次5 min，然后用甲苯胺蓝染液染色20 min，水洗后将其用于甲苯胺蓝染色鉴定。
1.4.7 总RNA提取及RT-qPCR检测采用Trigol试剂分别提取成软骨诱导第14天空白对照组和诱导分化组细胞的总RNA，然后采用反转录获得相应的cDNA，反转录反应体积为10 µL，包括总RNA 8 µL，5×PrimeScript RT Master Mix
2 µL，反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。PCR反应体积为25 µL：前、后引物和无菌水混合物11 μL，cDNA 1 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (2×) 12.5 µL，ROX
Reference Dye 0.5 µL，反应条件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、50 s，45个循环；72 ℃延伸5 min。用于PCR检测的相关基因引物信息如表1所示。

1.5 主要观察指标 IPFP-ASCs的形态、增殖活力、特异性表面标记物；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色对IPFP-ASCs成软骨分化能力进行鉴定；RT-qPCR检测成软骨诱导分化后相关基因的表达。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 22.0软件进行分析，最终结果以x±s表示。两组间的比较采用两独立样本t检验，
P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

髌下脂肪垫是充填于髌骨、股骨髁下部、胫骨髁前上缘及髌韧带之间，位于滑膜外关节内的一种以弹性纤维为网状支架的淡黄色脂肪组织[16]。DRAGOO等[7，17]研究发现IPFP-ASCs能够在体外分化成软骨和成骨表型，具有促进软骨和骨缺损修复的潜能，并且IPFP-ASCs体内外增殖能力和成软骨分化能力强[7-13]。该研究对膝关节置换手术所得的IPFP-ASCs进行了研究。
虽然对IPFP-ASCs的研究逐渐成熟，但目前尚无分离IPFP-ASCs的标准方法。髌下脂肪垫不同于皮下的液态脂肪组织，属于固态脂肪。在IPFP取材后，首先需要仔细去除其他组织，特别是血管和结缔组织，再将剩余脂肪组织充分剪碎，用DPBS反复浸泡和冲洗脂肪组织碎块。另外，该研究通过比较发现，在37 ℃下，0.25%胰蛋白酶的消化能力比0.2%Ⅰ型胶原酶的消化能力强，但胰蛋白酶作用时间过长会严重损伤细胞结构，进而导致其活性下降，无法正常贴壁；如果只用Ⅰ型胶原酶消化，耗时很长且细胞得率偏低，所以该研究综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶来对IPFP进行消化，先用胰蛋白酶消化1 h，然后再用Ⅰ型胶原酶消化过夜。值得一提的是，作者摸索的这种综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶处理的方法适用于实验室无相关恒温振荡仪器，只能静置消化的情况。采用该方法处理一两天后可见原代IPFP-ASCs开始贴壁生长，这时吸弃培养上清液，更换为新的基础培养基，通过差速贴壁方法可以极大程度地去除红细胞等不贴壁细胞；通过实验可看出，这种综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化法及差速贴壁法的分离培养方法极大提高了IPFP-ASC的分离提纯率。该研究中采用CCK-8法检测IPFP-ASCs的增殖活力，CCK-8法与传统的MTT法相比灵敏度更高、数据更可靠，且操作更简便，对细胞的毒性低。从IPFP-ASCs生长曲线图可以看出，第3代IPFP-ASCs具有较强的增殖能力，进入对数生长期后，细胞形态比较单一，均为长梭形。
目前流式细胞术检测细胞表面标记物是鉴定间充质干细胞的方法之一。根据国际上对间充质干细胞表型的要求[18]，
该研究选择了CD44、CD45和CD105来进行鉴定。虽然IPFP-ASCs有别于其他间充质干细胞，但它们的表面抗原具有相似性，其中CD105是间充质干细胞的统一标志物，而CD44是间充质干细胞的稳定标志物，二者都在间充质干细胞中高度表达[19]，CD45通常被用作造血干细胞的表面标记物，其阴性结果有助于排除这类干细胞[20]。该研究中，流式细胞仪对IPFP-ASCs的鉴定结果显示该细胞CD44、CD105的阳性表达率在95%以上，而CD45为阴性表达，其表达率在2%以下。尽管这些标记分子不是IPFP-ASCs所特有的，但此结果也在一定程度上表明分离、培养出的是IPFP-ASCs，为进一步的诱导分化实验奠定了基础。
体外实验研究表明脂肪来源间充质干细胞的增殖及成软骨分化受多种因素的影响，其中转化生长因子β3已被证明可以促进软骨修复和加速软骨分化[21-24]，常作为体外实验中IPFP-ASCs成软骨分化的诱导剂，该研究也将其作为主要诱导剂来诱导IPFP-ASCs成软骨分化。IPFP-ASCs经过诱导培养后，细胞形态逐渐由长梭形变为多角形，具备了类似软骨细胞样形态，随着成软骨诱导分化时间的延长，多角形细胞数量逐渐增多；诱导14 d后，Ⅱ型胶原免疫组化染色可见细胞胞浆和细胞间质出现棕黄色颗粒，说明该细胞表达了软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原；另外，甲苯胺蓝染色表明此细胞具有软骨细胞特异性的细胞外基质成分-糖胺聚糖。SOX-9是在软骨分化过程中必不可少的转录因子，它可以激活包括ACAN和COL2A1在内的软骨细胞外基质合成相关基因的表达。在软骨分化过程中，软骨细胞中SOX-9的表达呈现上升趋势。BMP-2属于转化生长因子超家族中的一员，已有研究表明单独的SOX-9并不能充分发挥成软骨效应，而SOX-9和BMP-2两者联合作用可促进间充质干细胞成软骨分化[25-26]。
该研究发现成软骨诱导后第14天时细胞内的BMP-2和SOX-9以及ACAN和COL2A1 mRNA表达均明显升高，表明该
IPFP-ASCs体现出了成软骨分化的性质，并且已具有了一定的软骨细胞特征。综合细胞染色以及RT-qPCR的结果，可以认为IPFP-ASCs已成功分化为软骨细胞。
总之，该研究从人髌下脂肪垫中分离并培养了间充质干细胞，通过形态观察、体外细胞增殖活力测定、流式细胞术鉴定、诱导分化后的细胞染色和相关基因表达检测，发现IPFP-ASCs具有较强的体外增殖能力以及成软骨分化能力，具备软骨组织工程种子细胞的基本条件。课题组未来可将其作为干细胞模型应用于各种体内外实验研究。此外，该研究采用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化法及差速贴壁法进行分离培养，极大提高了IPFP-ASCs的分离提纯率，是基础实验研究中值得推广的分离培养方法，为课题组进一步研究IPFP-ASCs提供实验基础。
间充质干细胞成软骨分化能力的提升一直是软骨组织工程的难点，因此需要深入探索定向分化成关节软骨的分子机制，为骨关节炎患者的软骨修复提供精准治疗靶点，同时还需要进一步研究其长期安全性、确切作用机制以及将实验结果转化为临床应用成果，这也正是未来深入研究的方向及目标。IPFP-ASCs作为一种很有临床运用前景的种子细胞，必将在软骨组织工程等多个领域发挥重要作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化

Identification and chondrogenic differentiation of human infrapatellar fat pad derived stem cells

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