浓缩生长因子负载脂肪干细胞预防SD大鼠双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3529

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 2982-2987.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3529

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浓缩生长因子负载脂肪干细胞预防SD大鼠双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死

张圣敏1，曹长红1，刘超2

1沧州医学高等专科学校口腔系，河北省沧州市 061001；2山东大学齐鲁医院口腔颌面外科，山东省济南市 250012

收稿日期:2020-05-28 修回日期:2020-05-29 接受日期:2020-07-06 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 刘超，山东大学齐鲁医院口腔颌面外科，山东省济南市 250012
作者简介:张圣敏，女，1985 年生，河北省沧州市人，汉族，2012年天津医科大学毕业，硕士，讲师，主治医师，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
沧州市科技计划项目(183302068)，项目负责人：张圣敏

Adipose-derived stem cells integrated with concentrated growth factors prevent bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws in SD rats

Zhang Shengmin1, Cao Changhong1, Liu Chao2

1Department of Stomatology, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, Hebei Province, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China

Received:2020-05-28 Revised:2020-05-29 Accepted:2020-07-06 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Liu Chao, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China
About author:Zhang Shengmin, Master, Lecturer, Attending physician, Department of Stomatology, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, Hebei Province, China
Supported by:
the Cangzhou Municipal Science and Technology Project, No. 183302068 (to ZSM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死：其特征是保持在8周以上且未表现出好转的骨坏死，目前或曾经有过双膦酸盐治疗史，但没有头颈部放疗史。
唑来膦酸：是一种具有较强抑制骨吸收和潜在促进骨形成作用的双膦酸盐类药物。临床主要用于恶性肿瘤引起的骨转移、骨质疏松症、高钙血症等治疗。
浓缩生长因子：是一种结构疏松、弹性好、可塑性强、富含多种生长因子的三维网络聚合物，为干细胞增殖和分化提供了可靠的微环境。

背景：双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死的病因可能涉及侵袭性牙科手术、感染、颌骨机械性损伤、免疫抑制剂和化疗药物等，但其潜在机制和治疗尚不清楚，预防是主要的临床命题。
目的：探讨浓缩生长因子负载脂肪干细胞对双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死的全面预防作用。
方法：40只SD大鼠随机分为4组：对照组、唑来膦酸组、浓缩生长因子组、脂肪干细胞联合浓缩生长因子组，每组10只。除对照组外，其他3组尾静脉注射唑来膦酸(80 μg/kg)，每周1次，连续给药12周建立双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死模型；对照组尾静脉注射生理盐水0.1 mL。以上4组均于第8周时拔除右侧下颌第一磨牙，浓缩生长因子组拔牙后于拔牙窝立即植入0.5 cm×0.5 cm浓缩生长因子；脂肪干细胞联合浓缩生长因子组拔牙后于拔牙窝立即植入0.5 cm×0.5 cm浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物，对照组和唑来膦酸组拔牙后不处理；拔牙后8周过量麻醉处死大鼠，分别通过拔牙创观察、Micro-CT、苏木精-伊红染色评估牙龈再生、拔牙创周围骨组织再生情况。
结果与结论：相对于其他3组，浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物明显促进了拔牙创周围软组织愈合和新骨形成，减少了死骨形成量，有效预防了双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死的发生。
https://orcid.org/0000-0003-4520-3031(张圣敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 双膦酸盐, 颌骨, 骨坏死, 浓缩生长因子, 骨再生, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Bisphosphonate-related osteonecrosis of jaw may involve invasive dental surgery, infection, jaw injury, immunosuppressive agents and chemotherapeutic drugs, and its potential mechanism and treatment are not clear. Prevention is the main clinical proposition.
OBJECTIVE: To explore the preventive effect of concentrated growth factors integrated with adipose-derived stem cells on bisphosphonate-related osteonecrosis of jaw.

METHODS: Forty Sprague-Dawley rats were randomly assigned to four groups: control group, zoledronic acid group, concentrated growth factor group, and adipose-derived stem cells combined with concentrated growth factor group (n=10 per group). Except the control group, rats in the other three groups were injected with zoledronic acid (80 μg/kg) through the tail vein once a week for 12 consecutive weeks to establish a bisphosphonate-related osteonecrosis of jaw model. Rats in the control group were injected with 0.1 mL of saline through the tail vein. The right mandibular first molar was extracted at the 8th week. In the concentrated growth factor group, 0.5 cm × 0.5 cm concentrated growth factors were implanted immediately after tooth extraction. In the adipose-derived stem cells combined with concentrated growth factor group, 0.5 cm × 0.5 cm concentrated growth factor/adipose-derived stem cell complex was implanted into the extraction socket immediately after tooth extraction. The control group and zoledronic acid group were not treated after tooth extraction. The rats were killed 8 weeks after extraction. The gingival regeneration and bone tissue regeneration around the extraction wound were detected by observation of tooth extraction wound, Micro-CT and hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with other three groups, concentrated growth factor/adipose-derived stem cell complex significantly promoted the healing of soft tissue and new bone formation around tooth extraction, reduced the dead bone formation, and effectively prevented the occurrence of bisphosphonate-related osteonecrosis of jaw.

Key words: stem cells, adipose derived stem cells, bisphosphonates, jaw bone, osteonecrosis, concentrated growth factor, bone regeneration, rats

中图分类号:

张圣敏, 曹长红, 刘超. 浓缩生长因子负载脂肪干细胞预防SD大鼠双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2982-2987.

Zhang Shengmin, Cao Changhong, Liu Chao. Adipose-derived stem cells integrated with concentrated growth factors prevent bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws in SD rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 2982-2987.

图/表（结果） 2

2.1 浓缩生长因子对大鼠脂肪干细胞增殖、成骨分化的影响见图1。对第3代大鼠脂肪干细胞增殖能力检测发现，与对照组比较，含15%浓缩生长因子的DMEM培养液培养的脂肪干细胞增殖能力显著增强，第1，3，5天增殖能力最强，第7天增殖能力有所下降；与对照组比较，成骨诱导第5，8天时，浓缩生长因子显著增强成骨基因RUNX2、OCN、OPN的表达(P < 0.05)，但第8天时RUNX2的表达水平显著下降，这与浓缩生长因子的降解性有很大关系。成骨诱导第7天时浓缩生长因子组碱性磷酸酶染色明显加深，成骨诱导第14天时浓缩生长因子组茜素红染色明显加深。

2.2 浓缩生长因子/脂肪干细胞局部移植促进牙龈伤口愈合并降低BRONJ样病变的发生拔牙后8周，与唑来膦酸组和浓缩生长因子组相比，脂肪干细胞联合浓缩生长因子组和对照组均显示出拔牙窝软组织覆盖率高，未见坏死骨暴露，见图2A；唑来膦酸组可见明显的死骨裸露，唑来膦酸组仅有1只大鼠拔牙创愈合较好；浓缩生长因子组部分拔牙窝愈合较好，也有部分出现拔牙窝愈合不良，大体可见少量死骨裸露。对照组、唑来膦酸组、浓缩生长因子组、脂肪干细胞联合浓缩生长因子组拔牙窝愈合率分别为100%，10%，50%，90%，见图2D。
2.3 浓缩生长因子/脂肪干细胞局部移植促进骨再生并降低BRONJ样病变的发生拔牙后8周组织学分析(苏木精-伊红染色)显示脂肪干细胞联合浓缩生长因子组和对照组空骨陷窝比例低，可见较多新生骨；浓缩生长因子组可见到明显的骨坏死和骨陷窝，唑来膦酸组可见明显的骨坏死、骨陷窝及胶原纤维断裂，见图2B；Micro-CT检查显示脂肪干细胞联合浓缩生长因子组拔牙窝大多被再生骨占据，拔牙创基本愈合，见图2C。

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引言

双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死(bisphosphonate-
related osteonecrosis of the jaws，BRONJ)的特征是保持在8周以上且未表现出好转的骨坏死，目前或曾经有过双膦酸盐治疗史，但没有头颈部放疗史[1]。双膦酸盐是一类人工合成的焦膦酸盐类似物，其作用在于抑制破骨细胞功能、抗骨质吸收，目前临床主要用于预防与治疗恶性肿瘤骨转移，防治肿瘤相关性骨丢失，抗肿瘤以及治疗骨质疏松症、Paget病等。BRONJ与大剂量双膦酸盐使用有关，属于药物相关的颌骨骨坏死的一种类型，其中唑来膦酸的发病率最高[2]。唑来膦酸是双膦酸盐的一种类型(商品名为择泰)。通过静脉注射双膦酸盐的患者，比口服双膦酸盐患者的骨坏死率更高。拔牙引起的颌骨和牙周组织损伤是诱发BRONJ发生的重要因素[3]。临床尚无标准化BRONJ治疗方案，原则为去除死骨及抗炎等对症治疗[4]，保守治疗预后较差[5]。因此，现阶段临床对于BRONJ多主张预防为主。为有效预防拔牙术后BRONJ的发生，临床多采用拔牙术后创口早期关闭[6-9]、高压氧治疗[10-11]、干细胞疗法[12-13]、生长因子等操作[14-15]，但临床数据较少，难以达成共识。
浓缩生长因子是2006年推出的第3代血小板浓缩物[16]，含有比第1代富血小板血浆和第2代富血小板纤维蛋白更高的生长因子，并具有更硬的纤维蛋白结构。浓缩生长因子是一种结构疏松、弹性好、可塑性强、富含多种生长因子的三维网络聚合物，为干细胞增殖和分化提供了可靠的微环境。脂肪干细胞是一种具有多种分化潜能和免疫调节能力的种子细胞。课题组前期研究证明，在聚乳酸表面形成纳米柱阵列能有效促进脂肪干细胞的成骨分化[17]。脂肪干细胞也可作为种子细胞用于预防和治疗BRONJ[18-19]，研究浓缩生长因子/脂肪干细胞组织工程复合物用于预防BRONJ的发生，有着极大的可行性。
该研究在拔除SD大鼠右侧下颌第一磨牙后于拔牙窝立即植入浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物，探讨浓缩生长因子负载脂肪干细胞对BRONJ的全面预防作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点基础实验与动物实验在沧州医学高等专科学校科技实训中心完成，苏木精-伊红染色在山东大学齐鲁医院完成，实验周期为2019年9月至2020年5月。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用8周龄雌性SD大鼠42只，体质量200-220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK-(京)2016-0006，SPF级。动物研究按照山东大学动物保护与伦理委员会的意见进行。所有动物标准条件下饲养，适应性饲养7 d后进行实验。
1.3.2 实验试剂唑来膦酸(上海陶塑生化科技有限公司)；10%水合氯醛(天津索罗门生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM、Ⅰ型胶原酶、胰酶(Gibco公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；茜素红染色试剂盒
(Solarbio公司)；β-甘油磷酸钠、维C磷酸酯、地塞米松(Sigma公司)；RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 浓缩生长因子培养液的制备从1只健康SD大鼠的心脏血液中提取浓缩生长因子。腹腔注射10%水合氯醛
(3 mL/kg)麻醉供体大鼠，通过心脏穿刺直接将血液提取到无抗凝血剂的无菌管中，并立即在特殊的离心设备(Medifuge离心机)中离心约13 min，去除上血清层和下红细胞层，保留中间浓缩生长因子，PBS冲洗，加入至5 mL注射器，按15%的比例推注到DMEM培养液中[20]，得到含浓缩生长因子的DMEM培养液。用含15%浓缩生长因子的DMEM培养液培养脂肪干细胞。

1.4.2 SD大鼠脂肪干细胞的提取选取1只SD大鼠，分离腹股沟处脂肪组织，置于含5%抗生素的PBS中，去除肉眼可见的结缔组织，然后放入10 cm培养皿中剪碎，将剪碎后的脂肪组织放入15 mL离心管中，加入0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃消化60 min，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，放入10 cm培养皿，在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养，72 h首次换液，之后每3 d换液1次，达80%融合时传代。

1.4.3 细胞增殖实验将第3代脂肪干细胞浓度调整为
2×107 L-1，按每孔100 μL 加入到96孔板中，用含15%浓缩生长因子的DMEM培养液培养，对照组不加入浓缩生长因子，每组设置3个复孔，每3 d换液1次。在培养第1，3，5，7天相同时间点在孔板中加入10 μL CCK-8溶液，培养箱孵育
2 h，采用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值。
1.4.4 成骨分化将第3代脂肪干细胞浓度调整为5×106 L-1，按每孔1 mL加入到24孔板中，用DMEM培养液孵育72 h，
加入含15%浓缩生长因子的DMEM成骨诱导培养液
(10 mmoL/L β-甘油磷酸钠、0.05 g/L维生素C、0.1 μmoL/L地塞米松)，对照组仅加入成骨诱导培养液。诱导后7 d进行碱性磷酸酶染色，诱导后14 d进行茜素红染色。
1.4.5 成骨基因表达将第3代脂肪干细胞浓度调整为
5×106 L-1，按每孔1 mL加入到24孔板中，用DMEM培养液孵育72 h后，加入含15%浓缩生长因子的DMEM成骨诱导培养液培养，对照组仅加入成骨诱导培养液。培养第5，8天，RNA提取试剂盒提取细胞mRNA，用cDNA第一链合成试剂盒将
2 µg总mRNA合成cDNA，然后用SYBR Green Realtime PCR
Master Mix进行RT-PCR定量分析。引物序列(5'-3')：
①RUNX-2：F，ATC ATT CAG TGA CAC CAC CA；R，GTA GGG GCT AAA GGC AAA AG；②OCN：F，CAG ACA AGT CCC ACA CAG CA；
R，CCA GCA GAG TGA GCA GAG AG；③OPN：F，TGG CCC TGA CTG CAT TCT GC；R，GCT GTG CCG TCC ATA CTT TCG；④β-actin：
F，CCT CTA TGA CAA CAC AGT；R，AGC CAC CAA TCC ACA CAG。每组设置3个复孔，每孔重复测量3次，取平均值进行分析。
1.4.6 浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物的制备制取浓缩生长因子，将其在培养皿中压成片状，手术刀切取浓缩生长因子为0.5 cm×0.5 cm；将第3代脂肪干细胞悬液按1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入DMEM培养液重悬细胞，浓度调整为5×108 L-1。将20 μL脂肪干细胞悬液滴加入浓缩生长因子中，制成浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物备用，大鼠拔牙后，立即植入浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物。
1.4.7 BRONJ的建模过程实验动物随机分为4组：对照组、唑来膦酸组、浓缩生长因子组、脂肪干细胞联合浓缩生长因子组，每组10只。除对照组外，其他3组尾静脉注射唑来膦酸(80 μg/kg)，每周1次，连续给药12周；对照组尾静脉注射生理盐水0.1 mL替代唑来膦酸，连续注射12周。以上4组均于第8周时拔除右侧下颌第一磨牙，浓缩生长因子组拔牙后于拔牙窝立即植入0.5 cm×0.5 cm浓缩生长因子；脂肪干细胞联合浓缩生长因子组拔牙后于拔牙窝立即植入0.5 cm×
0.5 cm浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物，对照组和唑来膦酸组拔牙后不处理；拔牙窝缝合，避免移植物脱落；拔牙后8周过量麻醉处死大鼠，进行后续检测。
1.4.8 苏木精-伊红染色取大鼠牙槽窝周围骨组织，脱钙后，石蜡包埋处理，切片厚度为30 μm，切片后用丙醇和乙醇混合液(1∶1)清洗，苏木精-伊红染色，显微镜下观察。
1.4.9 Micro CT观察取下颌骨在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，
用Micro-CT成像系统(Bruker SkyScan2211，比利时)扫描。将感兴趣区域定义为拔牙窝周围，然后通过MIMICS20.0
(Materialise，比利时)对图像三维重构并进行拔牙窝观察。
1.4.10 拔牙窝愈合情况将拔牙窝愈合定义为无肉眼可见的明显拔牙窝，黏膜完全覆盖，无肉眼可见的死骨裸露，苏木精-伊红染色显示有明显的新生骨形成，无明显炎症及骨陷窝，以上为拔牙窝愈合标准，并计算拔牙窝愈合率。
1.5 主要观察指标拔牙窝愈合情况，苏木精-伊红染色观察骨再生情况。
1.6 统计学分析利用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计学处理，数据以x±s表示，组内比较采用重复测量方差分析，两组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

BRONJ自2003年被首次报道以来，关于其临床治疗方案仍存在争议，更多主张预防为主。依据BRONJ颌骨坏死的临床诊断，服用双膦酸盐类药物且排除放射治疗的患者，在拔牙后8周创口不愈合可诊断为BRONJ[1]。该研究选择SD大鼠构建BRONJ模型，于拔牙后8周观察创口不愈合，有死骨形成，苏木精-伊红染色显示骨陷窝和死骨显著性增加。
根据近来研究报道，拔牙和外科手术的正确操作可以有效预防BRONJ，甚至在高危患者中也可发挥作用。不同的拔牙后处理可能成为BRONJ潜在的预防策略[21-22]。在一些临床研究中，使用自体生物材料作为生物支架进行BRONJ的预防，如使用富血小板血浆可有效缓解 BRONJ的发生[15]，ALONSO-RODRIGUEZ
等[18]应用可吸收止血明胶海绵负载脂肪干细胞填塞拔牙窝，同时颊黏膜骨膜瓣覆盖预防BRONJ；ZANG等 [19]利用脂肪干细胞结合羟基磷灰石填塞拔牙术后牙槽窝预防兔BRONJ。对有双膦酸盐治疗史的患者，在拔牙或其他牙槽手术后，采用必要措施预防BRONJ的发生尤其重要。
第3代血小板浓缩生长因子比第2代浓缩血小板和第1代浓缩血小板具有更高的生长因子浓度和更好的再生能力[23-24]。该研究比较了浓缩生长因子对脂肪干细胞的成骨作用。首先将脂肪干细胞用含浓缩生长因子的成骨诱导液培养，碱性磷酸酶染色、茜素红染色及成骨基因表达发现成骨潜能显著高于对照组，证实了浓缩生长因子对脂肪干细胞的成骨诱导作用。浓缩生长因子对比格犬脂肪干细胞[25]、比格犬牙周膜干细胞[26]、人牙乳头干细胞的成骨作用也被其他研究者所证实[27]。该实验在拔牙术后将浓缩生长因子/脂肪干细胞复合物即刻植入牙槽窝，苏木精-伊红染色及Micro CT均显示其可显著促进拔牙窝新骨形成，这些结果说明浓缩生长因子作为一种生物材料，可以承载脂肪干细胞并分泌生长因子，从而促进新骨形成并有效预防BRONJ。浓缩生长因子/
脂肪干细胞复合物促进成骨的机制可能与以下因素有关：浓缩生长因子具备三维聚合物的网络式纤维蛋白结构，可为生长因子诱导组织修复与再生提供可靠支架；浓缩生长因子富含多种生长因子[16]：血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子，其中转化生长因子β、血小板衍生生长因子、类胰岛素生长因子有着明显促进成骨的作用[28-31]，血管内皮生长因子、转化生长因子β均为已知的血管生成刺激因子[32-33]，而血管再生对骨再生具有重要的意义。富血小板纤维蛋白应用于治疗BRONJ也具有一定的效果[14]。然而，浓缩生长因子比富血小板纤维蛋白含有更多的血小板衍生生长因子[34]、血管内皮生长因子等生长因子[35]，含有更多的CD34阳性细胞[36]，且由于浓缩生长因子具有更坚硬的纤维蛋白结构[35]，因此可以认为浓缩生长因子是BRONJ的一种潜在治疗和预防方式。
在体内研究中发现，单独浓缩生长因子组不能显著发挥预防作用，其可能原因为：浓缩生长因子降解较快，所富含的生长因子会在短时间内释放，因此其对骨骼愈合的过程主要集中在刚开始治疗时，却难以维持长时间的有效作用[37]；同时由于BRONJ导致周围死骨形成，而双膦酸盐会抑制周围干细胞活性[38]，使干细胞难以在生长因子诱导下发挥作用，浓缩生长因子借助外来脂肪干细胞的多向分化潜能便可以发挥更持久的作用。
血管新生是创口愈合的首要要求。KUROSHIMA等[39]通过尾静脉注射外周血单个核细胞，增强拔牙窝结缔组织中的新血管形成，促进软组织愈合从而减少BRONJ样病变。血液的供应有利于成骨，已有研究表明，在骨缺损愈合过程中，血管生成发生在骨生成之前，并且血管生成和骨生成对骨再生具有相辅相成的作用[40]。血管内皮生长因子刺激血管生成，这是骨再生过程中的一个重要步骤，浓缩生长因子中包含大量的血管内皮生长因子，可能对浓缩生长因子预防BRONJ发生发挥了重要作用。但在该研究中，对于浓缩生长因子是否能直接刺激脂肪干细胞成血管分化的体外研究和体内研究并没有完全展开，会在以后的研究中进行充实。
结论：该研究发现拔牙同期在拔牙窝填塞浓缩生长因子/
脂肪干细胞复合物可通过促进骨组织修复有效减少BRONJ发病率，为BRONJ的预防提供了新思路。另外，浓缩生长因子可以选用自体来源，可自发降解且绝对安全。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

浓缩生长因子负载脂肪干细胞预防SD大鼠双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死

Adipose-derived stem cells integrated with concentrated growth factors prevent bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws in SD rats

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