人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3526

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 2969-2975.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3526

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人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤

张剑慧1，马贺然1，谭毅1，王芝辉1，2

1山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司，山东省济南市 250000；2山东第一医科大学科创中心，山东省济南市 250000

收稿日期:2020-04-23 修回日期:2020-04-29 接受日期:2020-06-29 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 王芝辉，博士，正高级工程师，山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司，山东省济南市 250000；山东第一医科大学科创中心，山东省济南市 250000
作者简介:张剑慧，1987年生，2014年北京师范大学毕业，硕士，主要从事干细胞研究。
基金资助:
山东省泰山产业领军人才项目(鲁政办字[2017]199号)，项目负责人：王芝辉

Knee injury repair using human adipose-derived mesenchymal stem cells-based scaffold-free three-dimensional gel-like construct in pigs

Zhang Jianhui1, Ma Heran1, Tan Yi1, Wang Zhihui1, 2

1Qilu Cell Therapy Technology Co., Ltd., Jinan 250000, Shandong Province, China; 2University Creative Research Initiatives Center of Shandong First Medical University, Jinan 250000, Shandong Province, China

Received:2020-04-23 Revised:2020-04-29 Accepted:2020-06-29 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Wang Zhihui, PhD, Senior engineering, Qilu Cell Therapy Technology Co., Ltd., Jinan 250000, Shandong, China; University Creative Research Initiatives Center of Shandong First Medical University, Jinan 250000, Shandong Province, China
About author:Zhang Jianhui, Master, Qilu Cell Therapy Technology Co., Ltd., Jinan 250000, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Taishan Industry Leading Talent Project, No. [2017]199 (to WZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶：脂肪间充质干细胞大密度接种于培养皿中，添加含有抗坏血酸-2-磷酸酯的MSCBM培养基，干细胞会分泌大量胶原使细胞胶联成一体，形成细胞膜片状结构，只需要轻微剪切力可将细胞膜片从培养皿底部吹起。在不需要外源支架的条件下形成含有干细胞成分的凝胶状结构。
干细胞凝胶移植治疗猪软骨损伤：猪的膝关节在解剖学上与人有很多相似之处，猪的膝软骨厚度足够允许进行关节软骨损伤造模，而不伤及软骨下骨组织。造模之后立即进行干细胞凝胶植入，凝胶自动黏附在关节软骨上，从而实现了无缝合移植。

背景：与传统的治疗方法相比，间充质干细胞可以从根本上修复受损的软骨组织，在软骨损伤修复中显现出优势。目前尚无关于脂肪间充质干细胞来源无支架三维凝胶对于软骨修复能力的相关研究报道。
目的：探究人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶治疗猪软骨损伤的可行性。
方法：取第3-5代人脂肪间充质干细胞，以4×105/cm2的密度接种于培养皿中，添加含5%血清替代物UltroGRO、0.2 mmol/L 抗坏血酸-2-磷酸酯的MSCBM培养基静置培养14 d，轻轻吹起细胞及细胞基质即为脂肪间充质干细胞三维凝胶，然后分别进行成骨、成脂、成软骨诱导鉴定凝胶中脂肪间充质干细胞的干性。取10只4月龄雌性巴马小型猪，在猪双膝股骨内侧髁的软骨上各制造一处直径5 mm，深2 mm的软骨损伤，右侧膝关节软骨损伤处移植脂肪干细胞凝胶，使凝胶完全填充满缺损处，作为治疗组；左侧不治疗，作为自身对照组。治疗后4，6，8个月取出软骨及骨组织，进行苏木精-伊红染色、番红固绿染色。
结果与结论：人脂肪间充干细胞无支架三维凝胶仍具备间充质干细胞的干性，具有分化成脂、成骨、成软骨的能力。软骨组织切片染色可见对照组损伤明显，细胞凝胶治疗组损伤底层可见成群分布的成熟软骨细胞，向上逐渐过渡为幼稚的软骨细胞，表浅部位仍可见残存的肉芽组织，经过6-8个月治疗，有效率为62.5%(5/8)。结果显示脂肪间充质干细胞三维凝胶能促进猪膝关节软骨损伤修复。

https://orcid.org/0000-0003-4275-7127(王芝辉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪间充质干细胞, 干细胞凝胶, 移植, 膝, 软骨损伤, 巴马小型猪

Abstract: BACKGROUND: Compared with the traditional treatment methods, mesenchymal stem cells can fundamentally repair the damaged cartilage tissue, showing advantages in the repair of chondral defect. At present, there is no relevant research report on the ability of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs)-based scaffold-free three-dimensional gel-like construct (ADMSCs-3D-GC) repairing chondral defect.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of treating porcine chondral defect with ADMSCs-3D-GC.
METHODS: Passage 3-5 of ADMSCs were cultured in the petri dish at a concentration of 4×105/cm2, with the MSCBM medium containing 5% serum substitute UltroGRO and 0.2 mmol/L ascorbic acid-2-phosphate. After stationary culture for 14 days, gently blow up the cells and cell matrix to form a three-dimensional adipose-derived mesenchymal stem cell gel. Osteogenesis, lipogenesis, and chondrogenesis were performed to identify the dryness of adipose mesenchymal stem cells in the gel. A cartilage lesion of 5 mm in diameter and 2 mm in depth was observed on the cartilage of the medial condyle of the femur in each knee of ten 4-month-old female Bama miniature pigs. The ADMSCs-3D-GC transplantation was performed at the damaged site of cartilage of the right knee joint to completely fill the defect and serve as the treatment group. The left side was not treated and served as the control group. After treatment for 4, 6 and 8 months, the cartilage and bone tissues were sampled and stained with hematoxyline and eosin, and Safranine O-Fast Green staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The ADMSCs-3D-GC had dryness of mesenchymal stem cells, and could promote osteogenesis, lipogenesis and chondrogenesis. Cartilage tissue staining showed that the control group was significantly damaged. In the cell gel treatment group, a group of mature chondrocytes could be seen at the bottom of injury, and gradually transformed into immature chondrocytes, and residual granulation tissues were still visible at the superficial level. The effective rate was 62.5% (5/8) after 6-8 months of treatment. The results showed that ADMSCs-3D-GC could promote the repair of cartilage damage in pig knee joints.

Key words: stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells-based scaffold-free three-dimensional gel-like construct, transplantation, knee, cartilage injury, Bama miniature pig

中图分类号:

张剑慧, 马贺然, 谭毅, 王芝辉. 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2969-2975.

Zhang Jianhui, Ma Heran, Tan Yi, Wang Zhihui. Knee injury repair using human adipose-derived mesenchymal stem cells-based scaffold-free three-dimensional gel-like construct in pigs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 2969-2975.

图/表（结果） 6

2.1 人脂肪间充质干细胞纯度高，能分化为骨、软骨和脂肪经体外培养，人脂肪间充质干细胞呈长梭状、贴壁生长，见图1A。流式细胞术鉴定细胞表型，结果显示CD29、CD44、CD90、CD105阳性细胞比例分别为(99.2±0.51)%，(98.9±0.69)%，(99.6±0.21)%，(98.3±0.23)%；CD31、CD34、CD45均为阴性，证明细胞纯度较高，图1B为第5代人脂肪间充质干细胞8个批次样本的表型统计分析图。人脂肪间充质干细胞成脂诱导10 d后，显微镜下可见细胞内脂肪滴成簇状分布，经油红O染色可见脂肪滴被染成红色，见图1C；成骨诱导10 d后，茜素红染色可见大量红色着色区，为钙沉淀，见图1D；成软骨诱导14 d后，软骨球中心部细胞排布致密，阿利新蓝染色呈亮蓝色，外周细胞排布相对松散，着色相对较浅，见图1E。

2.2 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶保持干性和分化能力人脂肪间充质干细胞高密度铺板于 6 cm培养皿(21 cm2)，
经凝胶诱导7-14 d，细胞分泌胶原，细胞之间胶联，只需轻微的剪切力便可将贴壁凝胶从培养皿揭起，在培养基中呈细胞膜片状态，将其从培养基中取出，此组织工程结构呈水样凝胶状态，透明，见图2A。
将获得的人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶分别进行成脂、成骨、成软骨分化诱导，切片进行染色鉴定，结果见图2B。成脂诱导分化后，细胞中的油滴被油红O染成亮红色；成骨诱导后产生的钙沉积被茜素红染成红色；成软骨诱导分化后被阿利新蓝染成亮蓝色。结果说明人脂肪间充质干细胞凝胶仍具有分化能力，保持干性。

2.3 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶能促进猪膝关节软骨修复在10只模型猪两膝造模，右膝进行凝胶治疗，左膝为对照侧，不进行治疗。在治疗过程中发现，人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶能够粘合在猪软骨缺损部位，并且不需要额外修剪即可充满损伤部位。9只实验猪在手术后1-5 d出现双侧膝关节肿胀，6-12 d轻微肿胀，13 d以后恢复正常。1只猪膝关节有感染，经抗生素治疗后恢复正常。9只猪在手术后24 h开始尝试站立，48 h正常站立并恢复正常行走。
10只实验猪中，治疗4个月解剖2只，均没有明显修复；6个月解剖5只其中有3只有效；8个月解剖3只有2只有效。经过6-8个月治疗，治疗有效率为62.5%(5/8)。
在治疗后4，6，8个月解剖动物观察软骨修复情况。结果显示，治疗4个月，凝胶填充在软骨损伤部位，但未分化为软骨组织；未经治疗的对照侧有出血点，解剖的2只猪均没有明显的治疗效果。剩余猪继续治疗，6个月解剖5只，8个月解剖3只，未经治疗的对照侧有部分软骨修复，治疗组关节损伤处较对照侧修复更完善，缺损处伤口更浅，有一定的修复效果，修复程度是缺损深度的50%。根据ICRS评分系统评价软骨修复情况，从软骨修复程度、整合度、外观及整体评价4个方面进行评分及统计，结果发现：软骨修复程度(P=0.009，n=8)、整合度(P=0.002，n=8)、外观(P=0.000 5，n=8)及整体修复情况(P=0.000 3，n=8)有显著差异，见图3，说明人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶对软骨损伤有一定的修复作用。

以1只动物为例显示软骨修复情况，见图4，并对修复的软骨组织进行组织病理切片、苏木精-伊红染色。如图可见，表层位置：两组表面都有一层很薄的纤维肉芽组织，平行交错排列胶原纤维束呈嗜酸性，被染成红色，见图4C；中层位
置：细胞凝胶治疗组由纤维肉芽组织逐渐变为透明软骨，从外至内细胞由少变多，由小变大，说明软骨细胞由幼稚转变为成熟，属于外加生长或软骨膜下生长，见图4D。对照组少量纤维束，多为类骨质，其间仍可见残存肉芽组织中的大量血管。最深层位置：对照组含有大量纤维的类骨质，未见软骨囊，未见透明软骨；细胞凝胶治疗组软骨囊呈强嗜碱性，深蓝色软骨囊里面有软骨细胞，这里的软骨细胞分裂增殖属于间质生长，见图4E。番红固绿染色显示新增组织为软骨组织，蛋白聚糖被番红O染为红色，见图5。结果显示，对照组损伤明显，细胞凝胶治疗组损伤底层可见成群分布的成熟软骨细胞，向上逐渐过渡为幼稚的软骨细胞，表浅部位仍可见残存的肉芽组织。

2.4 经修复的软骨组织为猪源组织为研究人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶是通过分化或者旁分泌作用在软骨修复中发挥的作用，作者对软骨组织来源进行物种鉴定，该样本用15个物种的特异性引物进行PCR扩增后阳性对照及样本电泳分析，如图6所示，阳性对照组为15个物种产生特异性扩增，样本1为对照组软骨组织、样本2为治疗组软骨组织，均与猪特异性引物产生特异性扩增，没有发现种属间交叉污染的现象。结果显示软骨组织均为猪源组织，未发现人源基因，实验结果说明脂肪间充质干细胞在关节腔内并没有分化为软骨组织，凝胶中的人脂肪间充质干细胞可能是通过旁分泌发挥软骨修复作用。

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引言

与创伤、病理改变及年龄等因素相关的关节软骨病变，不能自行修复，甚至会导致进行性负重关节软骨破坏和骨性关节炎[1]。传统治疗方法，包括口服抗炎药物、镇痛药和注射软骨保护剂只能减轻炎症反应、缓解患者痛苦、延缓软骨损伤，不能从根本上修复软骨组织[2]；关节置换术具有消除疼痛、矫正畸形、改善功能等优势，但是手术并发症多、成本高、风险大[3]。
随着干细胞技术的发展，间充质干细胞在修复受损软骨方面的优势逐渐显现[4-5]，间充质干细胞根据来源可以分为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等，其中在卫健委备案的临床研究及新药申报中脐带间充质干细胞治疗骨关节炎研究受到广泛应用。脂肪间充质干细胞较自体骨髓间充质干细胞及异体脐带间充质干细胞具有以下优势：首先，脂肪组织获取简单，痛苦小，皮下脂肪是人体多余的组织，来源丰富且对人体的有益作用不大，获取脂肪对人体造成的损伤远远小于获取自体骨髓；其次，使用自体脂肪间充质干细胞较外源性脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞避免了免疫排异反应[6]。
脂肪间充质干细胞已广泛应用到临床研究中[7-9]，其治疗关节损伤方面的研究显示，脂肪间充质干细胞可能通过调节关节腔内免疫环境、表达相关蛋白酶、合成新的软骨，来缓解或抑制病情进展[10-13]。软骨损伤较重的情况下，关节腔注射间充质干细胞的治疗效果不理想，现有技术往往选择自体软骨或人造软骨移植进行缺损软骨组织的补充和修复，而在软骨移植过程中需要将其缝合到原有软骨上，对软骨造成二次损伤[14-15]。为解决上述问题，间充质干细胞无支架三维凝胶可以在不需要缝合的情况下粘合到软骨损伤部位，减少了二次损伤，满足了对缺损部位的填充作用。
该研究探讨人脂肪间充质干细胞在体外诱导形成无支架三维凝胶的能力，并在体外验证其软骨分化能力，制作软骨损伤动物模型体内验证其软骨修复能力，为人脂肪来源间充质干细胞无支架三维凝胶(human adipose-derived
mesenchymal stem cells-based scaffold-free 3-dimensional gel-like construct，hADMSCs-3D-GC)的临床应用提供重要的临床前数据支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞、动物水平的体外、体内实验性研究。
1.2 时间及地点细胞水平实验于2017年5月至2018年3月在山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司中心实验室完成；动物水平有效性实验于2018年5至11月在山东省医科院药物研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 10只4月龄普通级雌性巴马小型猪，体质量5.7-8.0 kg，由山东省医学科学院药物研究所提供。
1.3.2 实验材料及仪器 CO2培养箱(Thermo，美国)；生物安全柜(苏净，中国)，倒置显微镜(Olympus，日本)；MSCBM培养基(达优，中国)；血清替代物UltroGRO-advanced
(Helios，美国)；Ⅰ型胶原酶(Sigma，美国)；TrypLE Express
Enzyme(Gibco，美国)；鼠抗人单克隆抗体PE-CD44、
PE-CD45、PE-CD29、PE-CD31、PE-CD34、PE-CD90、PE-CD105 (BD，美国)，普通手术器械。
1.4 实验方法
1.4.1 人脂肪间充质干细胞分离培养人脂肪组织来自于山东大学齐鲁医院，获得山东大学齐鲁医院医学伦理委员会批准，伦理编号为2018-023号。将100 mL抽脂获得的人脂肪组织用适量生理盐水反复冲洗直到液体不带有红细胞为止，向含有脂肪组织的离心管中以体积比1∶1的比例加入0.1%的Ⅰ型胶原酶/PBS消化液；将离心管密封置于37 ℃恒温摇床中，以90 r/min振荡消化30-60 min，直至无大的脂肪颗粒，收集细胞沉淀，100 μm滤网过滤去除筋膜，收集细胞，用间充质干细胞培养基调整细胞浓度为3×109 L-1，接种于培养瓶中，于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱，最初三四天保持静置培养，第4天后观察细胞贴壁情况对细胞进行换液，以后每周2次换液，待细胞生长至约80%汇合时，用胰酶替代物TrypLE消化后进行细胞传代培养。间充质干细胞基础培养基为含5%血清替代物UltroGRO的MSCBM培养基。
1.4.2 流式细胞术鉴定人脂肪间充质干细胞表型取第5代人脂肪间充质干细胞，用胰酶替代物TrypLE消化，将2×105个细胞悬浮在100 μL PBS中，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：PE-CD44、PE-CD45、PE-CD29、PE-CD31、PE-CD34、PE-CD90、
PE-CD105，避光孵育20 min，PBS清洗1次，去上清，用200 μL PBS重悬，使用Guava easyCyte(MERCK Millipore)流式细胞仪检测。
1.4.3 三系分化
(1)成骨诱导：用基础培养基调整人脂肪间充质干细胞密度，按4×103/cm2铺24孔板，第2天全量换诱导培养液，1周换2次诱导培养液，成骨诱导培养基为含有5%ultroGRO、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸的MSCBM培养基；成骨诱导10 d用1%茜素红染色鉴定。
(2)成脂诱导：用基础培养基调整人脂肪间充质干细胞密度，按4×103/cm2 铺24孔板，第2天全量换诱导培养液，1周换2次诱导培养液，成脂诱导培养基为含有5% ultroGRO、
10 g/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松、100 μmol/L吲哚美辛、500 μmol/L IBMX的MSCBM培养基；成脂诱导10 d用油红O染色鉴定。
(3)成软骨诱导：微滴法接种，用基础培养基调整人脂肪间充质干细胞浓度为1×1010 L-1，取20 μL细胞悬液滴到24孔板中间，培养箱静止一两个小时，细胞贴壁后缓慢加诱导培养基0.5 mL，3 d换液1次，成软骨诱导培养基为含有
110 mg/L丙酮酸钠、10 μg/L转化生长因子β3、0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸盐、40 mg/L L-脯氨酸、1%ITS+Premix 100*的MSCBM培养基；成软骨诱导14 d
进行阿利新蓝染色鉴定。
1.4.4 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶制备取生长状态良好的第3-5代人脂肪间充质干细胞，以4×105/cm2的密度接种于6 cm培养皿中，添加含5%血清替代物UltroGRO、
0.2 mmol/L抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbate 2-phosphate，
Asc-2P)的MSCBM培养基静置培养24 h，细胞汇合后，继续培养7-14 d，用移液器轻轻吹起细胞及细胞基质，悬浮的细胞层留在培养基中形成干细胞三维凝胶结构。获得的人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶在40 g/L多聚甲醛中固定，进行冰冻切片，分别对成脂切片进行油红O染色、成骨切片进行茜素红染色、成软骨切片进行阿利新蓝染色鉴定三维凝胶中的细胞分化情况。

1.4.5 动物实验动物实验在山东省医学科学院药物研究所开展，主要实验内容如下：巴马小型猪称质量后，用3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉，侧卧固定在手术台上。通过髌骨内侧入路，切开皮肤、皮下组织后，暴露膝关节，使膝关节置于最大屈曲位，找出股骨内侧髁，使用专业手术器械在猪双膝股骨内侧髁的软骨上各制造一处直径5 mm，深2 mm的关节软骨损伤，不伤及软骨下骨组织，右侧膝关节软骨损伤移植人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶，使凝胶完全填充缺损处，作为治疗组；左侧不治疗，作为自身对照组。然后复位髌骨，缝合关节囊、皮下组织、皮肤，完成手术。术后猪两条腿用石膏固定制动一两天，之后正常活动、豢养。软骨修复时间为4-8个月。
软骨修复期间，每天观察膝关节是否有关节部位肿胀现象以及运动能力恢复情况，并记录实验动物尝试站立至恢复正常站立时间，尝试行走至恢复正常行走体态的时间。治疗后4，6，8个月每个时间点分别处死2，5，3头猪，观察软骨损伤部位修复情况，并拍照记录。获取软骨及骨组织进行石蜡切片，苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色鉴定。根据ICRS软骨修复评分系统观察判断人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶对软骨修复的有效性，ICRS评分系统从软骨修复程度、整合度、外观3个方面进行评分，每项最高分4分，整体评价为以上3个指标的和，总分12分，评分越高整体修复程度越好。
1.4.6 软骨组织物种鉴定治疗后6，8个月，收集对照组及凝胶治疗组软骨组织，放入-20 ℃冰箱中冷冻保存。软骨组织送去上海肖鹏公司进行物种鉴定，物种鉴定方法：取适量检材用QIAamp DNA mini kit(250)试剂盒(QIANGEN，货号：51306)提取 DNA，用Promega PCR Nucleotide Mix试剂盒(PROMEGA，货号：C1141)将样本分别与15个物种(人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、猕猴、猪、牛、狗、猫、马、兔、鸡、果蝇、斑马鱼、非洲绿猴)的特异性引物进行扩增，扩增完成后用琼脂糖凝胶电泳进行检测并拍照。
1.5 主要观察指标 ①人脂肪间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶成脂、成骨、成软骨分化能力；②大体观察并拍照记录软骨损伤部位的修复情况；③对软骨及骨组织采样进行石蜡切片，苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色观察软骨修复情况。
1.6 统计学分析数据以x±s表示，数据分析用GraphPad Prism 5统计软件进行Student’s t-test，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

该实验中，用纯度高、干性好的人脂肪间充质干细胞作为无支架三维凝胶的细胞材料，获得的凝胶保持了间充质干细胞良好的干性，可以在体外诱导分化为脂肪、骨、软骨组织。同时，选择猪作为模型动物，制造猪膝关节损伤模型，利用人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶进行软骨组织修复治疗，结果显示：人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶对猪膝软骨损伤有一定的修复作用。
关节腔注射脂肪间充质干细胞在治疗关节炎中获得显著疗效，一方面可能是因为旁分泌作用调节软骨细胞蛋白表达，另一方面可能是间充质干细胞的免疫调节作用减轻关节腔炎性环境。当关节软骨基质代谢失衡时引起关节病变，软骨基质被炎症反应侵蚀，造成Ⅱ型胶原蛋白裸露，激活软骨细胞中的DDR2受体，从而上调基质金属蛋白酶13的表达，基质金属蛋白酶13是破坏软骨基质的主要酶类，软骨细胞被降解破坏，加速骨关节炎的进展[16]。脂肪间充质干细胞与软骨细胞共培养使DDR-2表达下降，从而降低下游基质金属蛋白酶13表达，减少对Ⅱ型胶原的降解、保护软骨基质、阻止骨关节炎的进展[17]。研究发现，脂肪间充质干细胞关节腔注射能明显缓解患者疼痛，促进关节功能恢复，通过关节内视镜检查发现关节表面磨损处重生出透明的关节软骨，可能是注射进入关节腔的脂肪间充质干细胞分化为活性软骨细胞，起到了修复关节软骨、润滑关节的作用[18-20]。脂肪间充质干细胞治疗关节炎具有很好疗效可能与其免疫调控能力有关，脂肪间充质干细胞能够减少抗原特异性T淋巴细胞的表达，增加免疫调节细胞Treg细胞与白细胞介素10分泌细胞的表达，白细胞介素10具有抗炎症反应的作用[21-22]。
对于关节炎病程较重、软骨损伤严重的患者，需要进行软骨移植术进行治疗。对工程软骨中使用的骨架材料往往是合成的高分子材料或者生物材料，而其在人体内长期存在，对机体是否有不良反应还不明朗。除此之外，关节软骨细胞由于其独特的矩阵结构，使软骨具有抗黏附的特性，此特性也成为临床自体软骨移植治疗软骨损伤的一个难点[23]。为了克服这一难点，临床上通过用酶处理软骨基质表面增加其粘着性[24]，或者通过缝合将移植组织强制固定[25-26]，或者用可溶性针将其固定[27]，然而，这些方式都会对软骨造成二次损伤，并有动物实验证明这些缝合处的软骨并不会自动愈合，并且会引起周围基质组织的退行降解[25]。因此，移植组织对软骨的黏附能力成为治疗软骨损伤的一个重要部分。
该研究中无支架脂肪间充质干细胞凝胶材料具有两大优势[28]。首先，不添加外源支架，极大降低了本体组织对外源材料的排异，减少了外源支架对现有软骨组织的磨损。更加重要的是，该研究中的凝胶材料有一定的组织黏附能力，且其水凝胶状态能够适应不同缺损状态的软骨损伤，这一特性使修复凝胶材料黏附到不同损伤状态的软骨上，避免了软骨移植到填充缺损部位时进行的缝合，减少了因治疗造成的软骨组织的二次损伤，这种黏附能力使凝胶可以适应不同形状及深度的组织缺损。
有研究利用来源于猪滑膜的间充质干细胞制备出了无外源骨架结构的间充质干细胞凝胶[29]，能够修复猪软骨组织损伤，损伤软骨长出软骨样组织，且富含Ⅱ型胶原蛋白，番红O染色呈阳性。体外培养无支架三维凝胶在治疗创伤性关节炎时无需进行缝合，避免对软骨组织的二次创伤，在治疗关节炎方面具有一定的优势。虽然，来自关节滑膜的间充质干细胞在动物实验中取得了很好的效果，但是滑膜间充质干细胞含量有限，培养到临床级的数量难度较大。
脐带、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞应用广泛，并各具优劣势。脐带间充质干细胞三维凝胶向软骨分化的能力较低，在体外通过多种细胞因子组合诱导以及与软骨细胞共培养情况下，均不能够合成软骨标记物Ⅱ型胶原蛋白或者糖胺聚糖[30]。骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞三维凝胶未见报道，两者都属于自体细胞，但脂肪的取材更方便、痛苦小，且可多次取材，因此，该研究选择人脂肪间充质干细胞作为无支架三维凝胶的种子细胞来源更为可取。临床应用时，使用自体脂肪间充质干细胞作为源细胞，避免了异基因排异。
该实验选择猪作为软骨损伤动物模型，猪的膝关节在解剖学上跟人有很多相似之处，猪的膝软骨厚度足够允许进行关节软骨损伤造模，而不伤及软骨下骨组织。然而，该研究存在的问题是使用未成年的动物进行体内实验，幼龄猪可能本身存在一定的软骨再生能力，可能会对结果造成影响。另外，人脂肪间充质干细胞注射到猪关节腔内，可能存在免疫排异的问题，也可能是未观察到凝胶分化为软骨的原因。为避免上述2个问题，下一步将使用成年免疫缺陷动物进行实验验证脂肪间充质干细胞凝胶对软骨损伤的修复。
通过研究发现，人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶植入后，凝胶组织能够自动黏附在关节软骨上，实现无缝合移植，避免了对软骨组织的二次损伤。猪软骨损伤经过6个月的治疗，软骨组织得到一定程度的修复，说明人脂肪间充质干细胞在软骨修复中发挥了作用，通过物种鉴定未发现有人源基因存在于修复的软骨组织中，说明人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶可能通过人脂肪间充质干细胞的旁分泌作用参与到软骨再生或者通过免疫调节能力调节软骨腔内的微环境，改善炎症反应，促进软骨组织修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤

Knee injury repair using human adipose-derived mesenchymal stem cells-based scaffold-free three-dimensional gel-like construct in pigs

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