辛伐他汀可刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3531

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 2963-2968.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3531

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辛伐他汀可刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化

郭志斌1，吴春芳1，刘子洪2，张钰英3，迟博婧3，王宝1，马超2，张国彬3，田发明3

1开滦总医院林西医院骨外科，河北省唐山市 063000；2开滦总医院骨外科，河北省唐山市 063000；3华北理工大学医学实验研究中心，河北省唐山市 063000

收稿日期:2020-05-11 修回日期:2020-05-16 接受日期:2020-09-10 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 田发明，教授，博士生导师，华北理工大学医学实验研究中心，河北省唐山市 063000
作者简介:郭志斌，男，1980年生，汉族，主治医师，主要从事老年骨代谢疾病的发病机制与诊治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81874029)，项目负责人：田发明；河北省医学科学研究重点课题(20190152)，项目负责人：郭志斌；河北省医学科学研究重点课题(20160722)，项目负责人：张国彬；河北省自然科学基金(H2013209255)，项目负责人：田发明

Simvastatin stimulates osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Guo Zhibin1, Wu Chunfang1, Liu Zihong2, Zhang Yuying3, Chi Bojing3, Wang Bao1, Ma Chao2, Zhang Guobin3, Tian Faming3

1Department of Orthopedic Surgery, Kailuan Linxi Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2Department of Orthopedic Surgery, Kailuan Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 3Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2020-05-11 Revised:2020-05-16 Accepted:2020-09-10 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Tian Faming, Professor, Doctoral supervisor, Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Guo Zhibin, Attending physician, Department of Orthopedic Surgery, Kailuan Linxi Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81874029 (to TFM); the Key Topics of Medical Science Research in Hebei Province, No. 20190152 (to GZB); the Key Topics of Medical Science Research in Hebei Province, No. 20160722 (to ZGB); the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. H2013209255 (to TFM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
p38 MAPK 信号传导通路：丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)是真核生物细胞内广泛存在的一类介导细胞反应的重要信号传导系统，信号通路包含ERK、p38、JNK 3种分型，与多种细胞的增殖、分化和迁移相关。p38 MAPK可由一些生长因子或细胞因子激活，并参与包括骨骼生长与重建的生理和病理进程。p38 MAPK可以通过调控C/EBPα、RUNX2和SOX9转录因子活性及下游目标基因的表达，从而影响包括成骨细胞在内的多种细胞增殖、分化和凋亡。
骨钙素：是一种由49个氨基酸组成的蛋白质，属于非胶原酸性糖蛋白，是第一个从酸性物质中提取出来的完整骨基质蛋白，有极高的特异性。骨钙素存在于富含骨基质蛋白的高度矿化组织中，主要由成骨细胞、成牙釉质细胞及一些增生的软骨细胞合成。骨钙素参与钙代谢的调节，在骨组织发育中发挥钙化作用，促进骨基质成熟。在临床上，骨钙素对绝经后骨质疏松患者骨形成治疗的疗效评价等方面有一定的价值。

背景：辛伐他汀可显著刺激骨髓间充质干细胞成骨分化，但机制不明。近年研究证实p38 MAPK信号通路参与调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程。
目的：观察p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路在辛伐他汀体外干预刺激骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。
方法：分离培养SD大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞，第2代骨髓间充质干细胞分为3组：对照组、辛伐他汀组(加入10-7 mol/L辛伐他汀)、阻断剂组(加入辛伐他汀30 min前给予10 µmol/L p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580)，均使用含有10 mmol/L β-甘油酸磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸的DMEM完全培养基进行成骨诱导分化。各组干预第6天进行碱性磷酸酶染色；第6天和第12天采用Western blot法检测p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的表达；第12天采用免疫荧光染色和实时荧光定量聚合酶链反应检测骨钙素、Ⅰ型胶原的表达；第21天茜素红染色观察钙结节形成情况。
结果与结论：①辛伐他汀组碱性磷酸酶表达和基质矿化能力显著高于对照组，阻断剂组显著低于辛伐他汀组(P < 0.05)；②辛伐他汀组磷酸化p38 MAPK与p38 MAPK比值高于对照组(P < 0.05)，阻断剂组低于辛伐他汀组(P < 0.05)；③辛伐他汀可以促进骨钙素和Ⅰ型胶原的表达，而阻断剂组显著低于辛伐他汀组(P < 0.05)；④结果表明，辛伐他汀可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这一作用可能与促进p38 MAPK磷酸化进而提高该通路活性有关。

https://orcid.org/0000-0003-2771-185X(田发明)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 辛伐他汀, p38, MAPK, 信号通路, 成骨分化, 成骨细胞

Abstract: BACKGROUND: Simvastatin can remarkably stimulate the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, but the mechanism is unknown. Recent studies have confirmed that p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is involved in regulating the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts.
OBJECTIVE: To observe the role of p38 MAPK signaling pathway in simvastatin stimulated osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from the femur and tibia of Sprague-Dawley rats were cultured in vitro, and the second generation of bone marrow mesenchymal stem cells was divided into three groups: control group, simvastatin group (10-7 mol/L simvastatin), and blocking agent group (10 µmol/L p38MAPK signaling pathway specific blocker SB203580 30 minutes before adding simvastatin). Osteogenic differentiation was induced in DMEM complete medium containing 10 mmol/L β-glycerophosphate and 50 mg/L ascorbic acid. Alkaline phosphatase staining was performed at 6 days after intervention in each group. The expressions of p38 MAPK and phosphorylated p38 MAPK were detected by western blot assay at 6 and 12 days. The expression of osteocalcin and collagen type I was detected by immunofluorescence and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction at 12 days. The formation of calcium nodules was observed by alizarin red staining at 21 days.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Alkaline phosphatase expression and matrix mineralization ability were significantly higher in the simvastatin group than those of control group, and significantly lower in the blocker group than those in the simvastatin group (P < 0.05). (2) The ratio of p38 MAPK in simvastatin group was significantly higher than that in control group (P < 0.05), and that in blocker group was significantly lower than that in simvastatin group (P < 0.05). (3) Simvastatin could promote the expression levels of osteocalcin and collagen type I, while above expression levels in the blocker group were significantly lower than those in the simvastatin group (P < 0.05). (4) It is concluded that simvastatin could promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts, which may be related to stimulate the phosphorylation of p38 MAPK, thereby enhancing the activity of this pathway.

Key words: stem cell, bone marrow mesenchymal stem cells, simvastatin, P38, MAPK, signaling pathway, osteogenic differentiation, osteoblasts

中图分类号:

郭志斌, 吴春芳, 刘子洪, 张钰英, 迟博婧, 王宝, 马超, 张国彬, 田发明. 辛伐他汀可刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2963-2968.

Guo Zhibin, Wu Chunfang, Liu Zihong, Zhang Yuying, Chi Bojing, Wang Bao, Ma Chao, Zhang Guobin, Tian Faming. Simvastatin stimulates osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 2963-2968.

图/表（结果） 9

2.1 骨髓间充质干细胞培养结果原代细胞培养第3天可见触角伸出并伸展为短梭形，随时间逐渐生长至多角梭形并融合成片，见图1。传代之后与原代第7天形态基本一致，呈多角或梭形。

2.2 各组细胞增殖能力细胞接种后第1-4天呈现持续增殖趋势，第3天较第2天细胞增加比例最大，辛伐他汀组与阻断剂组表现出一定的增殖力降低的趋势，但是差异无显著性意义，见图2。

2.3 各组细胞碱性磷酸酶染色结果第2代细胞成骨诱导培养第6天，部分细胞胞质呈蓝染阳性表现，辛伐他汀组阳性染色细胞更多，着色较深，阻断剂组阳性染色细胞少于辛伐他汀组，见图3。辛伐他汀组碱性磷酸酶阳性细胞比例显著高于对照组(P < 0.01)，阻断剂组显著低于辛伐他汀组(P < 0.01)。

2.4 各组细胞磷酸化p38 MAPK和p38 MAPK表达细胞培养第6，12天，辛伐他汀组磷酸化p38 MAPK 与p38 MAPK比值高于对照组(P < 0.05)，阻断剂组低于辛伐他汀组(P < 0.05)，见图4。

2.5 免疫荧光细胞化学检测各组细胞骨钙素和Ⅰ型胶原表达各组细胞干预第12天，辛伐他汀组骨钙素和Ⅰ型胶原的表达较对照组增加，阻断剂组骨钙素和Ⅰ型胶原的表达低于辛伐他汀组(P < 0.05)，见图5-7。

2.6 Realtime PCR检测各组细胞骨钙素和Ⅰ型胶原的mRNA表达各组细胞干预12 d后，辛伐他汀干预可以刺激骨钙素和Ⅰ型胶原的mRNA表达，显著高于对照组，而这一作用可以被阻断剂组SB203580抑制，阻断剂组骨钙素和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平显著低于辛伐他汀组(P < 0.05)，见图8。

2.7 各组细胞茜素红染色结果辛伐他汀组红色聚集沉积数量和面积多于对照组(P < 0.01)，加入SB203580则部分抑制了这一作用(P < 0.001)，见图9。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学观察实验。
1.2 时间及地点 2017年1月至2018年6月在华北理工大学医学实验研究中心完成。
1.3 材料 4周龄雌性SPF级SD大鼠6只，体质量为80-90 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCKX(京)2009-0015。辛伐他汀(美国Merk公司)；p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580(NEB公司)；RIPA蛋白裂解液(中国Solarbio公司)；p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK抗体(美国Abcam公司)；骨钙素(中国台湾Arigo公司)；Ⅰ型胶原单克隆抗体(美国Abcam公司)；CCK-8试剂盒(上海翔圣生物科技有限公司) ；碱性磷酸酶染色试剂盒(珠海贝索公司)；茜素红染色试剂盒(上海杰美基因公司)；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；荧光二抗(美国KPL公司)；HRP标记山羊抗兔二抗(美国SAB公司)；引物合成由上海生工有限公司完成；免疫荧光显微镜(日本奥林巴斯)。
1.4 方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞培养与分组干预无菌条件下从大鼠双侧股骨和胫骨中提取骨髓间充质干细胞，剪掉股骨或胫骨两端，暴露骨髓腔，用10 mL注射器配1 mL针头冲洗骨髓腔至发白，收集冲洗液，离心重悬后接种于T25培养瓶中，瓶内为含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基，放入37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱，每两三天更换1次培养基，培养至细胞融合率达到90%以上进行消化，然后传代培养，细胞传至第2代时分为3组：对照组、辛伐他汀组(加入10-7 mol/L辛伐他汀)、阻断剂组(加入辛伐他汀30 min前给予含10 µmol/L p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580)，各组同时使用含有
10 mmol/L β-甘油酸磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸的DMEM完全培养基诱导成骨分化。

1.4.2 细胞增殖能力检测将成骨诱导的3组骨髓间充质干细胞分别接种于96孔培养板，细胞浓度为2×107 L-1，每组24孔，每孔100 μL细胞悬液，并设置空白对照组，只有同体积的培养基而无细胞。成骨诱导1-4 d时CCK-8法检测细胞增殖情况，1次/d，每组检测6孔，连续4 d，计算当天(第1天除外)所测吸光度值与前一天所测吸光度值的比值。
1.4.3 碱性磷酸酶染色将成骨诱导第4天的3组骨髓间充质干细胞接种于提前放入盖玻片的12 孔板，制作细胞爬片，细胞浓度为1.5×107 L-1，每组3个复孔，每孔1.5 mL。诱导第6天，细胞约铺满 12孔板细胞爬片60%时行碱性磷酸酶染色，根据碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行操作，阳性染色细胞着蓝色，每孔随机选择3个视野采图，计数单个视野阳性染色细胞数和总细胞数，计算两者比值，即阳性细胞比例。
1.4.4 Western blot检测磷酸化p38 MAPK和p38 MAPK表达各组细胞成骨诱导第6，12天，采用RIPA裂解提取细胞总蛋白，加入p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK抗体(1∶2 000)，
4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，
室温孵育1 h，采用电化学发光法对蛋白条带进行可视化，采用Image J软件进行图像分析。
1.4.5 免疫荧光细胞化学检测骨钙素和Ⅰ型胶原的表达各组细胞成骨诱导第12天，40 g/L多聚甲醛固定过夜，1×PBS洗涤3次，每次5 min，0.1% Triton X-100渗透20 min，加入Ⅰ型胶原(1∶500)、骨钙素(1∶100)一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，与DyLight488、DyLight594标记的二抗37 ℃避光孵育1 h，用1×PBS洗涤3次，每次5 min，
用DAPI染核后封固，荧光显微镜观察Ⅰ型胶原及骨钙素显色情况并拍照记录，每组选择5个高倍视野进行积分吸光度值统计，图像采用Image pro plus 6.0软件分析。
1.4.6 Realtime PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原的mRNA水平各组细胞成骨诱导第12天，Trizol 法提取细胞RNA，应用
PrimeScriptTM 试剂盒反转录成cDNA，SYBER® Premix Ex TaqTMⅡ进行实时荧光定量PCR反应。反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共计40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt计算各组骨钙素和Ⅰ型胶原相对表达量。引物序列如下：骨钙素：Forward：5'-CTC AAC AAT GGA CTT GGA GCC-3'，Reverse：5'-GGC AAC ACA TGC CCT AAA CG-3'；Ⅰ型胶原：Forward：5'-CAA GGA CTA TGA AGT TGA TGC-3'，
Reverse：5'-ACC AGT AGA GAA ATC GCA GT-3'；GADPH：
Forward：5'-AGT GCC AGC CTC GTC TCA TA-3'，Reverse：5'-ATG AAG GGG TCG TTG ATG GC-3’。
1.4.7 茜素红染色各组细胞成骨诱导第21天进行茜素红染色，具体步骤参照试剂盒说明书，方法如下：用PBS (pH=7.0)配制10%西吡氯铵，每孔加入1 mL置于摇床上室温振荡
20 min，每孔提取200 μL加入比色杯中，用紫外分光光度计测定其在570 nm的吸光度值。每组重复3个样本。
1.5 主要观察指标成骨诱导后不同时间点各组细胞增殖能力、碱性磷酸酶染色结果、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK的表达以及骨钙素、Ⅰ型胶原的表达、钙结节形成情况。
1.6 统计学分析建立EXCEL数据库录入实验数据，采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量数据用x±s表示，3组间初步采用单因素方差分析(Oneway-ANOVA)比较是否存在组间差异，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞[7]，在相应的诱导条件下，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多种细胞，对于骨组织而言，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化对于骨量变化具有非常重要的影响。有研究发现，随着年龄的增加，骨髓间充质干细胞数量减少、向成骨细胞分化能力下降及向脂肪细胞分化能力增强，导致骨量下降，是原发性骨质疏松症的病理机制之一[8]。因此，探索促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物是近年来研究的热点之一。辛伐他汀是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，临床广泛用于降低胆固醇水平。研究表明，辛伐他汀能通过促进成骨细胞分化并抑制破骨细胞形成来影响骨代谢[9]。
该研究通过对辛伐他汀干预早期碱性磷酸酶活性和分化晚期茜素红着色结节的观察，证实了辛伐他汀可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化，这也与先前的研究结果一致[10-12]。此外，辛伐他汀可以促进成骨关键基质蛋白骨钙素和Ⅰ型胶原的表达。
p38 MAPK可由一些生长因子或细胞因子激活，并参与包括骨骼生长与重建的生理和病理进程[13-14]。p38 MAPK可以通过调控C /EBPα、RUNX2和SOX9转录因子活性及下游目标基因的表达，从而影响包括成骨细胞在内的多种细胞增殖、分化和凋亡[15-16]。有研究发现，在prx-1+骨髓间充质干细胞中敲除p38αPrx1可以诱发小鼠发生骨质疏松性表型、生长板缺陷，并增加骨髓脂肪含量[17]，骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞的能力下降，分化为脂肪细胞的能力增强，并且破骨细胞形成能力和骨吸收增加。因此，p38 MAPK对于骨骼生长发育以及骨稳态的维持具有重要作用，但是辛伐他汀刺激骨髓间充质干细胞成骨分化的过程中扮演何种作用尚有待进一步研究。
目前在辛伐他汀刺激骨髓间充质干细胞成骨分化的研究中，使用的剂量在10-6 mol/L 到10-8 mol/L之间，在平衡成骨效应与细胞毒性后，目前应用最多的干预剂量为10-7 mol/L [6，10-12]，该研究结果提示，10-7 mol/L辛伐他汀可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中磷酸化p38 MAPK和p38 MAPK的表达，提示p38 MAPK可能参与了辛伐他汀对骨髓间充质干细胞成骨分化的调控。为进一步证实该假设，设置了阻断剂组，结果发现，p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580可以抑制辛伐他汀对骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。辛伐他汀与MAPK信号通路的关系较为复杂，辛伐他汀对p38 MAPK通路活性的影响在不同的细胞或病理进程中作用不尽相同。例如，在炎症条件下或肿瘤发生过程中，辛伐他汀可以抑制过度激活的MAPK信号通路[18-19]；辛伐他汀可通过抑制JNK、P38和ERK的磷酸化而降低MAPK信号通路活性，并由此抑制白细胞介素1β诱导的髓核细胞凋亡和基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、ADAMTS-4和ADAMTS-5等基质降解酶的表达和活性，进而阻止了Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的降解[18]；辛伐他汀可以缓解转化生长因子β1刺激DU145细胞的上皮-间质转化，而这一作用是通过抑制p38 MAPK实现的[19]；而在破骨细胞分化过程中，辛伐他汀可以通过激活MAPK信号通路抑制破骨细胞的分化[20]。有研究通过差异蛋白筛选与生物信息分析提示，在辛伐他汀刺激骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，MAPK是参与该过程的主要信号通路之一[21]。结合该研究结果，作者推测辛伐他汀可能通过激活MAPK信号通路，刺激成骨分化相关因子的转录和表达，进而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，该研究同时分析了骨髓间充质干细胞成骨分化标志在蛋白水平和mRNA 水平的表达，较之前研究结果更为完善。然而，该研究仅通过体外实验对辛伐他汀促进骨髓间充质干细胞成骨分化中MAPK的作用做了初步探讨，仍有以下问题有待深入：一方面，在此过程中涉及到的其他信号通路关键分子和相互之间的级联网络关系尚有待进一步研究；再者，需要体内实验进一步证实上述结果，并验证相关科学假设。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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