鹿茸血清调控miR-141影响地塞米松对骨髓间充质干细胞的促增殖作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2079

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (19): 2991-2996.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2079

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鹿茸血清调控miR-141影响地塞米松对骨髓间充质干细胞的促增殖作用

孟晨阳，薛飞，贾燕飞，佟雁翔，张立峰，于成涌，张哲汉，王文选，郝廷，冯卫

内蒙古医科大学第二附属医院骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

收稿日期:2019-11-12 修回日期:2019-11-16 接受日期:2020-01-02 出版日期:2020-07-08 发布日期:2020-04-07
通讯作者: 冯卫，博士，教授，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030 郝廷，博士，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:孟晨阳，男，1991年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，蒙古族，2018 年内蒙古医科大学毕业，硕士，主要从事激素诱导的骨相关疾病发病机制研究。并列第一作者：薛飞，男，1983年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，2016年内蒙古医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事激素诱导的骨相关疾病发病机制研究。
基金资助:
内蒙古自治区卫生和计划生育委员会科研计划项目(201703122)

MicroRNA-141 is regulated by serum of velvet antler to promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in dexamethasone-induced cell model

Meng Chenyang, Xue Fei, Jia Yanfei, Tong Yanxiang, Zhang Lifeng, Yu Chengyong, Zhang Zhehan, Wang Wenxuan, Hao Ting, Feng Wei

Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2019-11-12 Revised:2019-11-16 Accepted:2020-01-02 Online:2020-07-08 Published:2020-04-07
Contact: Feng Wei, MD, Professor, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Hao Ting, MD, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Meng Chenyang, Master, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Xue Fei, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Meng Chenyang and Xue Fei contributed equally to this work.
Supported by:
the Scientific Research Project of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission, No. 201703122

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

激素性骨坏死：其发病机制包括骨细胞自噬、凋亡增加引起的骨量减少、脂代谢紊乱引起的骨滋养动脉微小栓塞以及骨髓脂肪细胞增大增多导致的静脉回流受限。近期研究表明，通过股骨注射自体间充质干细胞可以缓解激素性股骨头坏死的病程，对于激素性股骨头坏死具有积极的作用。

微小RNA-141：是一种非编码单链小RNA分子，通过作用目的基因的3'-UTR区域发挥作用，微小RNA-141可调控包括干细胞、肿瘤细胞的增殖与分化。

背景：骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化可延缓激素性股骨头坏死的进程，miR-141是促进细胞增殖的重要调控因子之一，鹿茸作为传统中药，在骨与组织修复及改善健康方面有显著的作用。

目的：探讨鹿茸血清是否具有调控miR-141的作用，从而影响骨髓间充质干细胞的增殖，进而延缓或逆转激素性骨坏死的病程。

方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，将第3代骨髓间充质干细胞行miRNA-141 mimic和miRNA-141 inhibitor转染，采用RT-PCR检测miR-141的mRNA表达，MTT比色法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力。将第3代骨髓间充质干细胞分为3组：正常组、地塞米松组、鹿茸血清组，正常组用α-MEM培养基培养，地塞米松组在α-MEM培养基中加入终浓度在1 μmol/L的地塞米松，鹿茸血清组在α-MEM培养基中加入终浓度在1 μmol/L的地塞米松和体积分数为15%的鹿茸血清，干预24 h后采用RT-PCR检测miR-141的mRNA表达，干预24，48，72 h采用MTT比色法检测细胞增殖能力。

结果与结论：①转染miR-141 mimic质粒后骨髓间充质干细胞中miR-141 mRNA表达升高，细胞增殖能力下降；转染miR-141 inhibitor质粒后骨髓间充质干细胞中miR-141 mRNA表达降低，细胞增殖能力升高；②地塞米松组miR-141的mRNA表达较正常组显著增加(P < 0.01)，鹿茸血清组miR-141的mRNA表达较地塞米松组显著下调(P < 0.01)；③地塞米松组骨髓间充质干细胞吸光度值低于正常组(P < 0.01)，鹿茸血清组吸光度值均高于地塞米松组(P < 0.01)；④由此可见，鹿茸血清可以抑制地塞米松引起的miR-141高表达，从而促进骨髓间充质干细胞增殖。

ORCID: 0000-0001-7913-2011(冯卫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词:

骨组织工程, 激素性骨坏死, 地塞米松, 微小RNA-141, 骨髓间充质干细胞, 鹿茸

Abstract:

BACKGROUND: The proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can delay the procession of steroid-induced femoral head necrosis. Besides, microRNA-141 (miR-141) is one of the important regulatory factors to promote cell proliferation. In addition, velvet antler is a traditional Chinese medicine which has significant roles in repairing bone and tissue and improving health.

OBJECTIVE: To investigate whether velvet antler serum can regulate the expression of miR-141 to promote the proliferation of BMSCs, and further delay or reverse the progression of steroid-induced femoral head necrosis.

METHODS: BMSCs were isolated and cultured from Sprague-Dawley rats. The passage 3 BMSCs were transfected with miR-141 mimic or miR-141 inhibitors, and then real-time PCR and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay were performed for detecting miR-141 expression and cell proliferation, respectively. The passage 3 BMSCs were divided into three groups: control group (α-MEM), dexamethasone group (α-MEM+1 μmol/L dexamethasone), and velvet antler serum group (α-MEM+1 μmol/L dexamethasone+15% velvet antler serum). Expression of miR-141 mRNA was detected by real-time PCR at 24 hours after intervention. The proliferation ability of BMSCs was evaluated by MTT assay at 24, 48, and 72 hours after intervention.

RESULTS AND CONCLUSION: After transfection with miR-141 mimic, the expression of miR-141 mRNA was upregulated, while the cell proliferation was reduced. After transfection with miR-141 inhibitor, the expression of miR-141 mRNA was downregulated, while the cell proliferation was increased. The expression of miR-141 mRNA was significantly higher in the dexamethasone group than the control group (P < 0.01), while the treatment with velvet antler serum could significantly downregulate the expression of miR-141 mRNA (P < 0.01). The absorbance of BMSCs in the dexamethasone group was significantly lower than that in the control group (P < 0.01), and the absorbance value in the velvet antler serum group was significantly higher than that in the dexamethasone group (P < 0.01). In conclusion, the serum containing velvet antler can downregulate the expression of miR-141 which is upregulated by dexamethasone and then do help to promote the proliferation of BMSCs.

Key words: bone tissue engineering, steroid-induced osteonecrosis, dexamethasone, microRNA-141, bone marrow mesenchymal stem cell, velvet antler

中图分类号:

孟晨阳, 薛飞, 贾燕飞, 佟雁翔, 张立峰, 于成涌, 张哲汉, 王文选, 郝廷, 冯卫. 鹿茸血清调控miR-141影响地塞米松对骨髓间充质干细胞的促增殖作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(19): 2991-2996.

Meng Chenyang, Xue Fei, Jia Yanfei, Tong Yanxiang, Zhang Lifeng, Yu Chengyong, Zhang Zhehan, Wang Wenxuan, Hao Ting, Feng Wei . MicroRNA-141 is regulated by serum of velvet antler to promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in dexamethasone-induced cell model [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(19): 2991-2996.

图/表（结果） 6

2.1 流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞抗原特性第3代骨髓间充质干细胞光镜下形态呈梭形、纺锤形，见图2；经流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，CD29与CD90表达阳性，分别为98.6%、90.2%，CD45与CD34表达阴性，见图3。

2.2 激素引起骨髓间充质干细胞中miR-141的表达上调 miR-141在正常组、地塞米松组、鹿茸血清组的mRNA表达值分别为1.000±0.027，4.117±0.042，2.764±0.168，各组间差异有显著性意义(P < 0.01)，见图4。miR-141的mRNA表达在地塞米松组显著增加，鹿茸血清组miR-141的mRNA表达较地塞米松组显著下调。

2.3 激素抑制骨髓间充质干细胞增殖随着时间的增加，正常组吸光度值逐渐增大(P < 0.01)；在干预24，48，72 h时，地塞米松组吸光度值(0.474±0.046，0.376±0.070，0.030±0.026)低于正常组(0.735±0.035，0.978±0.065，1.317±0.085)，差异有显著性意义(P < 0.01)，提示激素抑制骨髓间充质干细胞的增殖；在干预24，48，72 h时，鹿茸血清组吸光度值(0.664±0.047，0.812±0.013，0.727±0.031)均高于地塞米松组，差异有显著性意义(P < 0.01)，提示鹿茸血清可以有效缓解由激素引起的抑制效应，见图5。

2.4 miRNA-141 mimic和miRNA-141 inhibitor的质粒转染情况转染miR-141 mimic质粒后，miR-141 mimic组(11.918±0.313)的mRNA表达较空白组(1.000±0.043，P < 0.01)明显增高，见图6A。转染miR-141 inhibitor质粒后，miR-141 inhibitor组(0.296±0.023)的mRNA表达较空白组(1.000±0.037，P < 0.01)明显下降，见图6B。通过以上结果表明细胞转染成功。

2.5 转染miR-141 mimics及miR-141 inhibitor质粒后骨髓间充质干细胞增殖情况细胞转染miR-141 mimics质粒后骨髓间充质干细胞吸光度值(0.618±0.092)低于空白组(1.004±0.082，P < 0.01)，见图7A。细胞转染miR-141 inhibitor质粒后骨髓间充质干细胞吸光度值(0.960±0.095)高于空白组(0.742±0.091，P < 0.01)，见图7B。

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引言

许多自身免疫疾病及恶性血液病需要长期大量使用糖皮质激素，从而会增加骨坏死的风险，尤以股骨头坏死为甚^[1]。激素性骨坏死的发病机制仍不明确，其可能的机制包括骨细胞自噬、凋亡增加引起的骨量减少，脂代谢紊乱引起的骨滋养动脉微小栓塞，以及骨髓脂肪细胞增大增多导致的静脉回流受限^[2-3]。骨髓间充质干细胞可分化成骨细胞、骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞^[4]。近期研究表明，通过股骨注射自体间充质干细胞可以缓解激素性股骨头坏死的病程，对于激素性股骨头坏死具有积极的作用^[5]。另有研究证实激素会抑制骨髓间充质干细胞成骨分化与增殖^[6]，然而其作用机制仍需要进一步研究，因此研究促进骨髓间充质干细胞增殖的因子一直是治疗激素性骨坏死的研究热点。

MicroRNA(miRNA)是一种非编码单链小RNA分子，通过作用目的基因的3'-UTR区域发挥作用，并参与到骨髓间充质干细胞分化、增殖调控^[7-9]。微小RNA-141(miR-141)可抑制包括骨肉瘤细胞、直结肠癌SW480细胞等多种细胞的增殖^[10-11]，此外研究发现其与组织修复与成骨分化有联系^[12-13]。miR-141在激素性骨坏死中的表达以及miR-141与骨髓间充质干细胞在激素性骨坏死中的关联鲜有报道。鹿茸作为传统的中药，在骨与组织修复及改善健康方面有显著的作用。研究表明，鹿茸多肽可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与活力，并提高抗氧化与抗炎活性^[14]。结合鹿茸对骨髓间充质干细胞的作用，推测鹿茸对激素性骨坏死同样存在积极的治疗作用。该研究在体外应用地塞米松处理骨髓间充质干细胞并加以鹿茸血清干预，探讨鹿茸血清是否具有调控miR-141的作用，从而影响骨髓间充质干细胞的增殖，进而发挥延缓或逆转激素诱导的骨组织改变的作用。

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2018年1月至2019年1月在内蒙古医科大学第二附属医院医学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄SD雄性大鼠15只，体质量 (69±10) g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK(苏)2017-0001。

1.3.2 实验试剂与仪器鹿茸粉(北京同仁堂(亳州)饮片有限责任公司，批准文号：皖20160274)；α-MEM培养基、OPTI-MEM培养基、胎牛血清、青链霉素、胰酶(Hyclone)；PBS(南京生兴)；miRNA-141 mimic和miRNA-141 inhibitor (上海吉玛制药)；Nano drop 2000(Thermo Fisher)；T₄连接酶(Takara)；限制性内切酶KpnⅠ、限制性内切酶 HindⅢ(Takara)；Lipofectamine3000(Invitrogen)； FITC-CD29、FITC-CD45、FITC-CD90(eBioscience)； SYBR^® Premix Ex Taq、PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser、RNAiso Plus(Takara)；miRNA反转录及PCR引物(广州锐博生物)；血球计数板(上海求精生化)；MTT(Beyotime)；酶标仪(Thermo Fisher)；荧光倒置显微镜(Nikon)；流式细胞仪(BD FACS)；PCR仪、荧光定量PCR(Applied Biosystems)。

1.4 方法

1.4.1 鹿茸血清制备取10只4周龄SD雄性大鼠随机分为2组：正常组、鹿茸组，每组5只。鹿茸组按照成人剂量10倍灌胃[0.25 g/(mL·d)]，1次/d，连续8 d，对照组灌胃等量生理盐水灌胃。末次给药1 h后腹动脉采血分离血清，-20 ℃保存备用，见图1。

1.4.2 骨髓间充质干细胞分离培养采用颈椎脱位法处死3只SD大鼠。在无菌条件下，切除双侧股骨和胫骨，清除附着肌肉；用10 mL注射器将股骨和胫骨骨髓冲出，重复几次，直到股骨和胫骨变得苍白；收集细胞悬液，去除杂质，离心(800 r/min离心5 min)；加α-MEM培养基混匀，放置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱孵育；细胞生长到80%-90%后吸出培养基，冲洗，加胰酶充分消化，离心(1 000 r/min离心5 min)，去上清后加3 mL α-MEM培养基重悬细胞，1∶3传代培养。

1.4.3 流式鉴定骨髓间充质干细胞收集第3代骨髓间充质干细胞，PBS冲洗，用PBS-2%BSA溶液将细胞沉淀重悬，调整细胞浓度为2×10¹⁰ L^-1。取100 μL细胞悬液，按照抗体说明书推荐浓度加入一抗，冰上避光孵育20-40 min，PBS清洗3次，每次1 000 r/min离心5 min(4 ℃)，用500 μL PBS将细胞沉淀重悬，立刻上流式细胞仪检测。

1.4.4 细胞分组将第3代骨髓间充质干细胞接种于24孔板，每孔1×10⁶细胞，完全吹散细胞，充分混匀，使细胞均匀分布。接种后首先用α-MEM完全培养基培养，37 ℃下培养12 h后换液，设置3组，每组5个复孔，正常组继续用α-MEM完全培养基培养，地塞米松组在α-MEM完全培养基中加入终浓度1 μmol/L的地塞米松，鹿茸血清组在α-MEM完全培养基中加入终浓度1 μmol/L的地塞米松和体积分数15%鹿茸血清，干预24 h后采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-141的mRNA表达，干预24，48，72 h采用MTT比色法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力。

1.4.5 实时聚合酶链反应检测骨髓间充质干细胞中miR-141的mRNA表达根据说明书使用TRIzol试剂盒提取3组骨髓间充质干细胞RNA，用反转录试剂盒将RNA转录为cDNA，与引物溶液、SYBR green混合。将配置好的反应体系放入PCR仪，按照说明设定反应程序，读取循环阈值(Ct)，以正常组为对照，ΔΔCT=(CT_miR-141-CT_U6)_实验组- (CT_miR-141-CT_U6)_对照组，然后计算出RQ值=2^-^ΔΔCT，结果以RQ值±标准差表示。

1.4.6 MTT比色法检测骨髓间充质干细胞增殖能力干预24，48，72 h，各孔加入10 μL MTT培养3 h，去除α-MEM完全培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜，摇晃均匀，采用酶联免疫检测仪在570 nm波长测定吸光度。

1.4.7 细胞转染转染前1 d，将第3代骨髓间充质干细胞接种到6孔板，每孔1×10⁶细胞，完全吹散细胞，充分混匀，使细胞均匀分布。转染前将细胞分为3组：空白组、miR-141 mimic组、miR-141 inhibitor组，按照说明书操作步骤，去除细胞培养基，PBS洗1次，加入500 µL OPTI-MEM培养基，放入培养箱中备用。转染液的配制，A管：6 µL相应miRNA+119 µL OPTI-MEM培养基，混匀静置5 min；B管：3 µL Lipofectamine3000+122 µL OPTI-MEM培养基，混匀静置5 min，将A、B两管中的溶液混合成为一管，混匀静置20 min。取出培养箱中的6孔板，将配制的转染液逐滴加入6孔板中，轻轻晃动混匀。空白组只加入Lipofectamine3000。转染 72 h后更换新鲜培养基。培养结束时，去除培养基，加入PBS洗一两次，加入Trizol提取RNA进行荧光定量PCR实验检测miR-141的mRNA表达。

1.5 主要观察指标 ①各组骨髓间充质干细胞中miR-141 mRNA的表达；②各组骨髓间充质干细胞的增殖能力。

1.6 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，两组样本均数比较采用t 检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用Tukey检验。采用SPSS 23.0进行统计学分析。

讨论

激素性骨坏死病理表现为骨小梁的疏松与塌陷，其发病机制考虑与成骨能力的下降和成脂能力增强有关^[15]，骨髓间充质干细胞作为具有多向分化能力的细胞，参与到脂质代谢与成骨分化进程当中^[16]。间充质干细胞的生物表型可由包括miRNAs、激素以及生长因子调控，miR-141被证实可以通过靶向作用YES相关蛋白(YAP)抑制牙根尖干细胞的增殖与成骨分化^[17]。这与作者的研究结论相似，证实了miR-141可以抑制骨髓间充质干细胞的增殖，而抑制miR-141表达可以促进骨髓间充质干细胞的增殖。另有研究表明通过抑制miR-141可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化^[18]，而通过靶向作用维生素C转运蛋白2(SVCT2)，miR-141可以抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化^[13]。因此，抑制miR-141可以成为防治激素性骨坏死的新思路。此外，该研究证实了糖皮质激素抑制骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，从而导致骨密度的降低及骨易碎性增加。综合实验结果，作者认为糖皮质激素引起miR-141表达增高，从而降低骨髓间充质干细胞的增殖活性并且减弱其成骨分化能力，进一步引起激素性骨坏死相应的病理改变。

鹿茸作为中国的传统中药，可促进成骨与骨折愈合，研究表明鹿茸能够增加大鼠骨折端的骨痂厚度，并能增加包括骨形成蛋白2在内的相关成骨基因的表达^[19]，另外鹿茸多肽可逆转骨髓间充质干细胞在体外培养中的异行性的产生^[20]。有研究证实，鹿茸多肽可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与活力，并提高抗氧化与抗炎活性^[14]。激素性骨坏死的发病机制与氧化损伤引起的细胞凋亡、血管炎性损伤相关^[21]，这为鹿茸治疗激素性骨坏死提供了依据。该研究发现，体外培养的骨髓间充质干细胞经过鹿茸血清与激素的共同作用，可以有效缓解由激素引起的对骨髓间充质干细胞增殖活性的抑制作用，增强激素作用下骨髓间充质干细胞的增殖活性。研究证实，GSK126可逆转H3K27me3的表达，从而促进骨髓间充质干细胞的增殖，进而抑制激素性骨坏死的发生^[22]。然而，鹿茸通过促进骨髓间充质干细胞增殖活性从而延缓激素性骨坏死的具体机制仍需要探究，通过该实验研究表明，激素能够引起miR-141表达增加，而鹿茸血清能够有效抑制由激素引起的miR-141高表达，结合上文提及的miR-141的高表达会抑制骨髓间充质干细胞增殖活性，作者认为鹿茸血清可以通过抑制miR-141的表达，发挥促进骨髓间充质干细胞增殖活性的作用，进而减弱激素对骨髓间充质干细胞抑制成骨的作用。

课题组前期实验证实地塞米松终浓度为1 μmol/L可引起成骨细胞的凋亡与自噬现象的显著增加，因此将地塞米松浓度定为1 μmol/L^[23]。通过提取鹿茸血清，干预地塞米松作用的骨髓间充质干细胞，发现鹿茸血清可以下调由激素引起的miR-141高表达。该实验证实激素性骨坏死与miR-141的关联性，进一步通过转染miR-141抑制剂质粒，发现抑制miR-141可以促进骨髓间充质干细胞的增殖，从而表明鹿茸血清可以通过下调miR-141的表达，从而促进骨髓间充质干细胞增殖，进一步延缓激素性骨坏死病程，为激素性骨坏死的发病机制与防治提供新的思路。

该研究存在一定的局限性，首先缺少体内模型进行验证，其次miR-141介导的骨髓间充质干细胞成骨分化仍需要后续实验研究，最后miR-141调控的靶向作用增殖基因仍需要进一步探索。

鹿茸血清调控miR-141影响地塞米松对骨髓间充质干细胞的促增殖作用

MicroRNA-141 is regulated by serum of velvet antler to promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in dexamethasone-induced cell model

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