类风湿关节炎差异表达基因的免疫浸润机制及潜在中药治疗预测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3797

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (14): 2183-2191.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3797

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类风湿关节炎差异表达基因的免疫浸润机制及潜在中药治疗预测

沈浮1，邝高艳2，杨卓1，文猛1，朱恺民1，余桂枝1，徐无忌3，邓博2

1湖南中医药大学，湖南省长沙市 410208；2湖南中医药大学第一附属医院骨科，湖南省长沙市 410007；3湖南中医药大学第二附属医院脊柱科，湖南省长沙市 410005

收稿日期:2020-06-10 修回日期:2020-06-13 接受日期:2020-07-29 出版日期:2021-05-18 发布日期:2020-12-30
通讯作者: 徐无忌，博士，副主任医师，湖南中医药大学第二附属医院脊柱科，湖南省长沙市 410005 邓博，副教授，硕士生导师，湖南中医药大学第一附属医院骨科，湖南省长沙市 410007
作者简介:沈浮，男，1996年生，汉族，湖南省人，湖南中医药大学在读硕士，主要从事中医药防治脊柱脊髓疾患研究。
基金资助:
国家重点研发计划(2018YFC2002500)：项目参与人：邝高艳；湖南省自然科学基金项目(2019JJ50462)：项目负责人：邝高艳

Immune infiltration mechanism of differential expression genes in rheumatoid arthritis and potential therapeutic prediction of Chinese herbs

Shen Fu1, Kuang Gaoyan2, Yang Zhuo1, Wen Meng1, Zhu Kaimin1, Yu Guizhi1, Xu Wuji3, Deng Bo2

1Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan Province, China; 2Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; 3Department of Spine, Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410005, Hunan Province, China

Received:2020-06-10 Revised:2020-06-13 Accepted:2020-07-29 Online:2021-05-18 Published:2020-12-30
Contact: Xu Wuji, MD, Associate chief physician, Department of Spine, Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410005, Hunan Province, China Deng Bo, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China
About author:Shen Fu, Master candidate, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan Province, China
Supported by:
the National Key Research & Development Program of China, No. 2018YFC2002500 (to KGY [project participant]); the Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 2019JJ50462 (to KGY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
免疫浸润：是指人体免疫细胞异常出现在病变组织中的现象。
生物信息学：结合计算机和网络大发展研究生物系统中的信息现象及其相互作用和调控规律的学科。

背景：类风湿关节炎的发病机制目前尚不完全明确，免疫失衡是类风湿关节炎发病的重要环节，而免疫浸润在类风湿关节炎中的相关调控机制的研究较少。
目的：利用GEO基因芯片数据库，对类风湿关节炎基因探针芯片数据进行通路富集和免疫浸润分析，并对类风湿关节炎免疫调节相关生物学过程进行中药预测，为深入了解类风湿关节炎的免疫相关机制及中药干预免疫调节提供理论依据。
方法：检索类风湿关节炎滑膜组织相关基因探针的GEO基因芯片数据库，并以正常滑膜组织作为对照，利用STRING数据库对差异基因进行蛋白网络互作分析，并筛选出核心靶基因；运用R语言及相关安装包程序对类风湿关节炎差异基因进行基因本体论(GO)及基因通路富集分析(KEGG)；通过CIBERSORT反卷法对22类免疫细胞在类风湿关节炎组及对照组的含量及比例进行分析；利用COREMINE数据库对显著富集的免疫相关的生物学过程及核心靶基因进行预测。
结果与结论：①类风湿关节炎相关的蛋白网络互作核心靶基因涉及CDC20，GNB3，QSOX1和与趋化因子相关的12个基因；②基因本体论分析显示上调的基因与免疫炎症关系更为密切；③基因通路富集分析显示类风湿关节炎免疫调节与趋化因子信号通路、白细胞介素17相关通路以及核转录因子κB通路密切相关；④对免疫细胞的浸润矩阵分析结果表明，浆细胞、记忆B细胞和M0巨噬细胞在类风湿关节炎组的比例显著增高，而M2巨噬细胞及静息肥大细胞在类风湿关节炎滑膜组织显著减少；⑤在免疫细胞间相关性分析中类风湿关节炎的未活化的自然杀伤细胞与中性粒细胞呈强烈正相关，活化的CD4+记忆性T细胞与活化的自然杀伤细胞负相关性最强；⑥通过COREMINE预测发现，桑叶、鱼脑石和山药与类风湿关节炎相关免疫途径及核心靶基因的关系最为密切，其机制可能与作用于CCR5，CXCL10，CXCR3，CXCL13靶基因从而干预白细胞及T细胞迁移相关；⑦上述结果证实，M2巨噬细胞、静息肥大细胞与类风湿关节炎关系密切，类风湿关节炎相关的差异基因涉及中性粒细胞活化、白细胞趋化性及T细胞迁移相关免疫相关生物学过程，还与趋化因子信号通路、白细胞介素17相关通路及核转录因子κB通路相关，桑叶、鱼脑石和山药等中药可能作为其潜在的分子药物来源。

https://orcid.org/0000-0003-2776-8880 (沈浮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 类风湿关节炎, 免疫浸润, GEO基因芯片数据库, 生物信息学, CIBERSORT反卷法, 中药预测, 信号通路, 机制研究

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of rheumatoid arthritis is not completely clear. Immune imbalance is an important link in the pathogenesis of rheumatoid arthritis, and research on the related regulatory mechanism of immune infiltration in rheumatoid arthritis is less reported.
OBJECTIVE: to analyze the pathway enrichment and immune infiltration of rheumatoid arthritis gene probe chip data by using GEO gene chip database, and to predict the biological process of immune regulation in rheumatoid arthritis, thereby providing a theoretical basis for understanding the immune mechanism of rheumatoid arthritis and the intervention of traditional Chinese medicine in immune regulation.
METHODS: The GEO gene chip database was searched for synovial tissue-related gene probes of rheumatoid arthritis, and the normal synovial tissue was used as control. Protein-protein interaction network of different genes was analyzed using STRING database, to screen out core target genes. The gene ontology (GO) analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) gene pathway enrichment analysis of differential genes related to rheumatoid arthritis was performed using R language and related installation package program. The content and proportion of 22 kinds of immune cells in rheumatoid arthritis group and control group were analyzed by CIBERSORT deconvolution method. Significantly enriched immune-related biological processes and core target genes were predicted using the COREMINE database.
RESULTS AND CONCLUSION: Rheumatoid arthritis-associated protein networks interacted with core target genes involving CDC20, GNB3, QSOX1 and 12 genes associated with chemokines. GO enrichment analysis showed that up-regulated genes were more closely related to immune inflammation. KEGG enrichment analysis showed that immune regulation of rheumatoid arthritis was closely related to chemokine signaling pathway, interleukin-17 related pathway and nuclear factor-κB pathway. Analysis of the infiltration matrix of immune cells showed that the proportion of plasma cells, memory B cells and M0 macrophages in rheumatoid arthritis group increased significantly, while the number of M2 macrophages and resting mast cells was significantly reduced in the synovial tissues of rheumatoid arthritis. Correlation analysis between immune cells indicated that the unactivated natural killer cells of rheumatoid arthritis were positively correlated with neutrophils, and the activated CD4 memory T cells were strongly negatively correlated with activated natural killer cells. Through COREMINE prediction, mulberry leaf, fish brain stone and yam were found to be most closely related to the immune pathways and core target genes associated with rheumatoid arthritis. The mechanism may be related to interference with leukocyte and T cell migration by acting on the target genes, CCR5, CXCL10, CXCR3, and CXCL13. Overall, M2 macrophages and resting mast cells are closely related to rheumatoid arthritis. Rheumatoid arthritis-related differential genes are involved in immune-related biological processes, including neutrophil activation, leukocyte chemotaxis and T cell migration, as well as correlated with chemokine signaling pathways, interleukin-17-related pathway, and nuclear factor-κB-related pathway. Mulberry leaves, fish-brain stones, and yam may be the potential molecular drug sources.

Key words: rheumatoid arthritis, immune infiltration, GEO gene chip database, bioinformatics, CIBERSORT deconvolution, traditional Chinese medicine prediction, signaling pathway, mechanism research

中图分类号:

沈浮, 邝高艳, 杨卓, 文猛, 朱恺民, 余桂枝, 徐无忌, 邓博. 类风湿关节炎差异表达基因的免疫浸润机制及潜在中药治疗预测[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2183-2191.

Shen Fu, Kuang Gaoyan, Yang Zhuo, Wen Meng, Zhu Kaimin, Yu Guizhi, Xu Wuji, Deng Bo . Immune infiltration mechanism of differential expression genes in rheumatoid arthritis and potential therapeutic prediction of Chinese herbs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(14): 2183-2191.

图/表（结果） 9

2.1 类风湿关节炎差异表达基因获取结果通过检索GEO数据库，最终实验组将GSE47856芯片数据作为此研究对象，该芯片内包含7个健康人和16个类风湿关节炎患者的关节滑膜组织的基因表达情况，以两样本组间表达量的比值，取以2为底的对数(log2FC)，一般默认取log2FC绝对值大于1为差异基因的筛选标准，经筛选后获得类风湿关节炎组与对照组的差异基因432个，其中上调基因为237个，下调基因为195个，见图1。

2.2 核心靶基因获取利用STRING数据库对差异基因进行蛋白网络互作分析(PPI)，将分析结果的TSV文件导入Cytoscape软件中进行可视化展示，如图2所示，该网络中共有节点115个，边269条，经CentiScape插件计算得出平均度值为5.67，节点颜色越深代表该节点的度值越大，在PPI模型的重要程度越高，该网络中大于2倍平均度值的核心基因有12个，如表2所示：分别为：CDC20，GNB3，QSOX1，ADCY2，CCR5，CXCL10，CXCL13，CXCL16，CXCL3，CXCL6，CXCR3和CXCR4。

2.3 差异基因的GO及KEGG富集分析结果运用R语言程序中的“clusterProfiler”插件包分析类风湿关节炎差异基因进行生物学功能及通路富集分析，上调基因的GO分析中共获取生物过程(biological process，BP)75条，下调基因共富集214条BP。在KEGG富集分析中，上调基因共富集34条通路，下调基因共富集31条信号通路。该课题组在数据分析时发现，上调基因的GO及KEGG富集分析与免疫炎症关系较为密切，如图3A所示，上调基因的GO主要涉及neutrophil activation (中性粒细胞活化)、neutrophil mediated immunity(中性粒细胞介导的免疫)、neutrophil degranulation(中性粒细胞脱颗粒)、neutrophil activation involved in immune response(中性粒细胞活化参与免疫应答)、leukocyte migration(白细胞迁移)、leukocyte chemotaxis(白细胞趋化性)、lymphocyte migration(淋巴细胞迁移)及T cell migration(T淋巴细胞迁移)。如图3B所示，对上调基因按照差异显著性进行气泡图展示，具体通路及富集基因信息如表3所示，在KEGG富集分析中，上调基因主要涉及多种病毒感染通路、趋化因子信号通路、白细胞介素17相关通路以及核转录因子κB通路。

2.4 类风湿关节炎组与对照组的免疫细胞浸润分布在CIBERSORT反卷积法以P < 0.05对类风湿关节炎患者与正常人群的滑膜基因样本进行筛选，最终获取18个可信样本，如图4A所示，热图左侧4个样本为对照组，右侧14个样本为类风湿关节炎组，结果显示，类风湿关节炎组与对照组的M2巨噬细胞含量(macrophages，M2)均显著增加，未活化的静息肥大细胞(mast cell resting)在两组的数目均较少。如图4B所示，免疫细胞比例箱图中进一步展示了22种免疫细胞的浸润比例。

2.5 免疫细胞间相关性分析如图5所示，未活化的自然杀伤细胞(NK cells resting)与中性粒细胞(Neutrophils)呈强烈正相关性(r=0.99)，中性粒细胞(Neutrophils)与初始CD4+T细胞(T cells CD4 naive)呈强烈正相关性(r=0.84)，未活化的自然杀伤细胞(NK cells resting)与初始CD4+T细胞(T cells CD4 naive)呈强烈正相关性(r=0.80)，浆细胞(Plasma cells)与活化的CD4+记忆性T细胞(T cells CD4 memory activated)呈强烈正相关性(r=0.81)。并且，活化的CD4+记忆性T细胞(T cells CD4 memory activated)与活化的自然杀伤细胞(NK cells activated)呈强负相关性(r=-0.73)，M2巨噬细胞(macrophages M2)与未活化的自然杀伤细胞(NK cells resting)呈现较强的负相关性(r=-0.64)。

2.6 类风湿关节炎组与对照组的免疫浸润差异分析如图6所示，通过小提琴图对类风湿关节炎与正常患者的关节滑膜的组间免疫浸润细胞差异分析，以P < 0.05为显著差异性，得出在类风湿关节炎组中浆细胞(P=0.044)、记忆B细胞(P=0.041)、M0巨噬细胞(P=0.04)显著增高；此外，M2巨噬细胞(P=0.041)、静息肥大细胞(P=0.002)在类风湿关节炎滑膜组织显著减少。

2.7 免疫浸润相关生物途径的中药预测通过Coremine Medical预测具有潜在干预类风湿关节炎免疫浸润的中药，如表4所示，以P < 0.05作为筛选标准，预测得出39种中药与中性粒细胞活化、中性粒细胞脱颗粒、白细胞迁移、白细胞趋化性、淋巴细胞迁移、T细胞迁移相关等免疫生物过程及ADCY2，CCR5，CXCL10，CXCL13，CXCL16，CXCR3等核心靶基因相关，将结果导入Cytoscape软件中进行可视化展示，如图7A所示，该网络中共有节点53个，边51条，该网络中山药、鱼脑石、桑叶的度值较高，提示与类风湿关节炎相关免疫浸润的关系最密切，其干预类风湿关节炎免疫浸润的机制可能与通过作用于CCR5，CXCL10，CXCR3及CXCL13干预白细胞及T细胞迁移相关。对预测的中药进行归经分类，如图7B所示，与类风湿关节炎免疫浸润相关中药多归肝肾经，且与补虚、解表及利水渗湿相关，药物功效统计具体如图7C所示。

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引言

类风湿关节炎是一种以滑膜炎症和血管翳形成为主要病理改变，以多发性和对称性关节侵袭性炎症为主要临床表现的慢性全身性自身免疫性疾病，随着炎性细胞浸润增加和骨组织破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，从而加重社会及家庭负担[1-3]。然而，类风湿关节炎发病的确切机制尚不清楚，目前认为，免疫功能紊乱与类风湿关节炎的发病密切相关，其中免疫复合物介导的补体激活、破骨细胞激活以及细胞因子平衡失调在类风湿关节炎的病情进展中处于重要地位[4-5]。以T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞为代表的多种免疫细胞参与并介导了类风湿关节炎的自身免疫反应，其诱导的促炎细胞因子、趋化因子以及蛋白酶的分泌，扰乱免疫平衡进而加速软骨和骨侵蚀[6-8]。因此，从免疫细胞浸润的角度研究类风湿关节炎的发病机制是类风湿关节炎患者针对性临床决策治疗的先决条件，是目前类风湿关节炎研究的热点和发展趋势[9-10]，可为该病的临床诊疗提供新思路和新途径。
目前欧洲抗风湿病联盟(EULAR)推荐针对类风湿关节炎的免疫治疗药物，主要包括改善病情的抗风湿药、糖皮质激素以及生物制剂[11]，而对于晚期类风湿关节炎的关节软骨缺损，组织工程学方法的自体软骨移植修复是目前的研究热点[12]。甲氨蝶呤作为抗风湿药首选推荐药物，在单药治疗中缓解率普遍较低[13]，糖皮质激素及生物制剂能普遍缓解临床症状，但糖皮质激素的长期使用会带来骨质疏松、骨坏死等并发症，而生物制剂价格昂贵，且长期疗效仍具有争议[14]，自身免疫相关宿主反应更是组织工程材料关节植入需考虑的关键问题[15]。类风湿关节炎属于中医“痹症”范围，中医药治疗类风湿关节炎具有疗效显著和不良反应少等优势，近年来愈发受到重视[16]。同时，中药具有免疫调节的功效，又避免了西药的毒副反应，适宜长期服用[17-18]，中药干预类风湿关节炎的免疫调节涉及的靶点和途径，目前尚缺乏系统和全面的了解，因此，深入研究中药调节类风湿关节炎免疫平衡可能机制，预测挖掘干预类风湿关节炎免疫失衡的潜在中药，可为类风湿关节炎的中药免疫治疗提供一定的理论依据。并且深入了解类风湿关节炎关节内的免疫浸润环境，对于晚期类风湿关节炎患者关节组织工程材料的特性选择亦具有指导意义。
该课题组基于既往研究分析，类风湿关节炎免疫相关研究多集中在单个基因的差异分析上，对功能相关基因的整体分析研究较为少见，尤其对于类风湿关节炎的免疫浸润多局限于少数免疫细胞种类，未涉及多种免疫细胞间的动态调节及其相对含量差异的变化[19-20]。基因芯片作为一种新兴技术，具有高效、大规模采集疾病基因表达谱数据的优势，已被广泛应用于生物信息学的研究中[21-22]。实验利用生物信息学工具，对类风湿关节炎患者和正常人在基因芯片数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中的差异基因数据进行了综合分析，并运用CIBERSORT算法分析类风湿关节炎滑膜的免疫浸润情况，对与类风湿关节炎免疫相关的中药进行预测，为类风湿关节炎的免疫浸润机制和免疫调节相关中药的筛选提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

滑膜是类风湿关节炎主要受累的靶组织，实验中通过将类风湿关节炎患者与正常人群的滑膜差异基因进行PPI分析，共筛选得到与类风湿关节炎相关的12个核心靶基因，分别是CDC20，GNB3，QSOX1，ADCY2，CCR5，CXCL10，CXCL13，CXCL16，CXCL3，CXCL6，CXCR3和CXCR4，其中趋化因子及其受体相关基因在类风湿关节炎滑膜差异基因的PPI网络中占据多数。趋化因子是一类具有化学趋化作用的细胞因子，在类风湿关节炎中，其主要由滑膜的巨噬细胞产生，可对中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞产生趋化作用，并且与血管炎的发展密切相关，CXCL，CCR和CXCR作为趋化因子家族及受体重要组成部分，目前已经证实与类风湿关节炎的发病密切相关，CCR5在类风湿关节炎患者关节滑液中的T细胞上的表达及反映病情的血沉和C-反应蛋白指标程度呈正相关，CCR5沉默可通过抑制MAPK相关信号通路从而促进类风湿关节炎大鼠滑膜细胞凋亡并抑制炎症因子的释放[26-27]。CXCL10和CXCL13在类风湿关节炎小鼠模型中调节B细胞和T滤泡辅助细胞的迁移，CXCL16在体外研究中发现其与类风湿关节炎的血管炎症密切相关，CXCL10则最有可能成为反映类风湿关节炎病情严重程度或活动性的生物标志物[28-31]。CXCR3和CXCR4亦被证实在动物模型上呈现高度表达，CXCR3在浸润性T辅助细胞的表达尤为显著，CXCR4则主要调节类风湿关节炎患者滑膜中淋巴细胞的募集[32-33]。实验所筛选的PPI核心靶基因大多与目前的类风湿关节炎相关的实验研究相符合，进一步说明预测结果的可靠性，CDC20，GNB3，QSOX1和ADCY2等基因目前尚缺乏与类风湿关节炎相关文献报道，提示其可能成为未来诊断类风湿关节炎的潜在靶标及生物标志物。
实验利用GEO基因芯片对类风湿关节炎患者与正常人群的关节滑膜进行差异基因的GO及KEGG富集分析，提示上调基因的生物学过程与免疫调节的关系非常密切，主要涉及中性粒细胞活化及介导的免疫、中性粒细胞脱颗粒反应、中性粒细胞活化参与免疫应答、白细胞迁移及趋化性、淋巴细胞迁移等生物学过程，进一步说明类风湿关节炎是由多种炎症细胞及因子共同参与的免疫过程，存在错综复杂的转导过程。KEGG富集分析显示，差异基因的相关通路除了与病毒感染性免疫反应及趋化因子途径相关以外，白细胞介素17、核转录因子κB信号通路中的基因富集性较高，核转录因子κB为炎症相关的关键转录因子，而核转录因子κB通路在类风湿关节炎的发展中发挥重要作用，早期类风湿关节炎患者的滑膜组织核转录因子κB1在关节破坏过程中呈现高表达，IKK-B主导核转录因子κB通路的活化过程，核转录因子κB释放并进入细胞核，与不同基因启动区结合，导致下游炎症因子的表达[34-35]。白细胞介素17A可促进破骨细胞生成并加重骨质侵蚀，白细胞介素17与核转录因子κB通路也有密切的联系，其可加速IkB和p65的磷酸化并诱导p65和p50 mRNA的表达进而激活核转录因子κB的经典通路[36-37]。
为了进一步探讨免疫细胞在类风湿关节炎滑膜中的作用，实验利用CIBERSORT反卷积法对两组滑膜基因样本进行筛选，最终结果显示，与对照组相比，浆细胞、记忆B细胞及M0巨噬细胞在类风湿关节炎组的比例显著增高，而M2巨噬细胞、静息肥大细胞在类风湿关节炎滑膜组织显著减少，实验预测的部分结果得到了基础研究的证实，例如，肥大细胞的活化会加重类风湿关节炎疼痛刺激症状，其机制可能与肥大细胞释放大量肿瘤坏死因子α及白细胞介素6等细胞因子诱导炎性细胞渗入至滑膜通过类胰蛋白酶介导的蛋白酶激活受体2促进滑膜成纤维细胞增生，加速关节内的炎症反应及破坏相关[38-39]。产生促炎因子的M1巨噬细胞与产生抗炎因子的M2巨噬细胞比例失衡是促进类风湿关节炎进展的关键机制之一，M2巨噬细胞对于延缓类风湿关节炎的发展可能具有积极作用[40]。而M0巨噬细胞在类风湿关节炎发病机制中的作用，相关文献报道较少，可能对于类风湿关节炎发病相关免疫失衡具有潜在作用，目前普遍认为M0巨噬细胞具有在特定环境下分化为M1，M2巨噬细胞的潜质[41]，类风湿关节炎的炎性刺激下的滑膜环境可能是M0巨噬细胞特定分化为M1巨噬细胞的外在条件。有研究显示CD4+，CD8+T细胞在类风湿关节炎的滑膜组织中明显升高[42]，而实验结果显示的T细胞在两组的差异变化并不明显，不排除由于样本量过小，从而造成CIBERSORT算法在计算免疫细胞数量时出现偏倚。在免疫细胞间相关性分析中，作者对于22种免疫细胞两两之间的关系进行了相关性比较，结果显示未活化的NK细胞与中性粒细胞的正相关性最强，活化的CD4+记忆性T细胞与活化的NK细胞呈强负相关，侧面反映不同免疫细胞之间在类风湿关节炎的病程进展中存在协同或拮抗作用，而目前对于不同类型免疫细胞之间的相关性分析的基础研究尚缺乏大规模的验证，此预测具有一定程度的参考意义。
类风湿关节炎属中医学“痹症”范畴，中医学对其记载及治疗已有两千多年的历史，临床已取得良好的效果[43]。《素问•痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹也”，认为此病的基本病机是素体本虚，正气不足，外感风寒湿邪，痹阻脉络，流注关节，属本虚标实之证[44-45]。故此病以肝肾亏虚为本，多夹杂有风寒湿等表邪，与实验预测的药物归经多属肝肾且功效多为补益、祛湿解表的特征高度相符，进一步说明此次研究结果验证合乎类风湿关节炎的中医病机。且在此次预测筛选的药物中不乏出现蜈蚣和眼镜蛇等虫蛇类药材，此类峻猛强烈之药走中通达，搜风通络，善治痹证久治不愈，经脉拘急，甚则变形之顽痹[46]，符合类风湿关节炎反复发作、缠绵难愈的特点。实验从免疫浸润的角度将类风湿关节炎差异基因中与免疫相关的生物学过程及作用于核心PPI靶基因的中药进行反向预测，筛选后山药、鱼脑石及桑叶在通过免疫调节干预类风湿关节炎的过程中处于核心地位，现代研究显示山药多糖能促进淋巴细胞的增殖能力和抗体的产生，增加吞噬细胞的吞噬能力，对体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫都有增强作用[47]。桑叶不仅对炎症治疗具有明确的疗效，其提取物可显著降低和减弱了白细胞介素1β诱导的一氧化氮和前列腺素E2的产生，以及减少一氧化氮合酶和环氧化酶2的表达[48]。桑叶多糖亦可强化机体免疫活性，其可显著提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力从而调节免疫分子与免疫细胞[49]。鱼脑石含有大量的锌元素[50]，锌与人体免疫功能的调节密不可分，锌可影响DNA聚合酶的表达，来调节细胞的凋亡、白细胞介素等炎性递质的释放以及相关蛋白聚集于滑膜中，抑制锌的转运诱导从而加速类风湿关节炎炎症反应[51-52]。课题组基于COREMINE数据库，预测桑叶、鱼脑石和山药干预类风湿关节炎免疫浸润的机制可能与作用于CCR5，CXCL10，CXCR3，CXCL13靶基因从而白细胞及T细胞迁移相关，可为后续深入研究工作提供参考。
实验有一些局限性：首先，由于纳入的类风湿关节炎基因芯片来源于GEO数据库，该数据库收集的类风湿关节炎患者滑膜的基因芯片样本数量有限，可能会由于样本量过少造成数据分析的偏倚，可进一步联合其他数据库或增加GEO芯片数据进行分析，减少误差；其次，对于免疫细胞的预测基于过CIBERSORT反卷积法进行，虽然此类算法既往已在恶性肿瘤预后基因和白细胞亚群的应用中相当成熟，但仍需进一步实验验证。总之，实验利用生物信息学对类风湿关节炎滑膜基因芯片进行生物学过程及免疫浸润的分析，并对干预类风湿关节炎免疫平衡的中药进行预测，对后续相关科研工作具有一定参考意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

类风湿关节炎差异表达基因的免疫浸润机制及潜在中药治疗预测

Immune infiltration mechanism of differential expression genes in rheumatoid arthritis and potential therapeutic prediction of Chinese herbs

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