芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛作用机制的网络药理学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3219

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (20): 3194-3201.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3219

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芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛作用机制的网络药理学分析

钟远鸣1，何炳坤2，吴卓檀2，吴思贤2，万通2，钟锡锋2

1广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530001；2广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530001

收稿日期:2020-06-08 修回日期:2020-06-13 接受日期:2020-07-11 出版日期:2021-07-18 发布日期:2021-01-15
通讯作者: 钟远鸣，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530001
作者简介:钟远鸣，男，1963年生，壮族，广西壮族自治区南宁市人，主任医师，教授，博士生导师，主要从事脊柱脊髓疾病的诊治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81760874)，项目负责人：钟远鸣；中医学广西一流学科(桂教科研〔2018〕12号)，项目参与人：钟远鸣

An exploration on the mechanism of Shaoyao Gancao Decoction in treating early pain of lumbar disc herniation based on network pharmacology

Zhong Yuanming1, He Bingkun2, Wu Zhuotan2, Wu Sixian2, Wan Tong2, Zhong Xifeng2

1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Graduate School, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-06-08 Revised:2020-06-13 Accepted:2020-07-11 Online:2021-07-18 Published:2021-01-15
Contact: Zhong Yuanming, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhong Yuanming, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760874 (to ZYM); First-class Discipline of Traditional Chinese Medicine in Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. [2018]12 (to ZYM [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
网络药理学：基于药物与药物之间在结构、功效等方面的相似性，并考虑到机体内靶标分子、生物效应分子的多种相互作用关系，通过构建药物-疾病-靶标网络，来预测药物的功效以及特定功效对应的药物。
芍药甘草汤：来源于《伤寒论》，方中白芍酸甘，归肝脾两经，能养血柔肝止痛，甘草甘平，归心、肺、脾、胃经。药理学研究表明，该方具有抗炎镇痛、解除平滑肌痉挛作用，可用于治疗急性腰扭伤及腰椎间盘突出症等疾病。

背景：临床上芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛具有比较满意的疗效，但其作用机制尚不明确。网络药理学作为一门新兴学科，其系统性、整体性及强调对信号通路的多途径调节的特点与中医学理论体系的主要特点相吻合。
目的：运用网络药理学方法筛选芍药甘草汤主要活性成分，构建活性化合物-靶点网络，对其治疗腰椎间盘突出症早期疼痛的机制进行阐释。
方法：检索并筛选中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)获得芍药甘草汤的活性成分及其对应的靶标，并与人类孟德尔遗传数据库(OMIM)及人类基因数据库(GeneCards)获得的腰椎间盘突出症疾病靶标相映射得到交集靶标；利用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-疾病-靶标关系网络；通过STRING平台进行蛋白互作网络分析；利用R语言软件数据包进行基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。最后利用AutoDock Vina程序将获得的药物主要活性化合物与关键核心蛋白进行分子对接。
结果与结论：①芍药甘草汤中共筛选出了槲皮素、芒柄花素和山奈酚等87个活性成分及白细胞介素6、白细胞介素1β和基质金属蛋白酶9等47个治疗腰椎间盘突出症的潜在靶点；②GO功能富集分析表明，芍药甘草汤主要涉及膜筏、膜区及含胶原的细胞外基质等分子组成，影响细胞因子受体结合、内肽酶活性及受体配体活性等分子功能，参与对细菌来源分子的反应、对活性氧的反应及氧化应激反应等生物过程；③KEGG通路富集分析表明，芍药甘草汤主要通过肿瘤坏死因子信号通路、低氧诱导因子1信号通路及白细胞介素17信号通路等来发挥抗氧化、消炎及调节免疫反应的作用；④分子对接结果显示，芍药甘草汤核心化合物槲皮素、芒柄花素及山奈酚可与核心靶标紧密结合，为进一步发挥芍药甘草汤消炎镇痛作用提供必要条件；⑤上述数据证实，芍药甘草汤主要通过多成分-多靶点-多通路的特点来发挥抗氧化、消炎及调节免疫反应的作用，如槲皮素可作用于基质金属蛋白酶9靶点进而调控肿瘤坏死因子信号通路等，初步阐释了芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛的作用机制。
https://orcid.org/0000-0003-4441-4355 (钟远鸣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 腰椎, 中药, 腰椎间盘突出症, 疼痛, 机制, 网络药理学, 分子对接, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Clinically, Shaoyao Gancao Decoction has a satisfactory effect on the early pain of lumbar disc herniation, but its mechanism is not clear. As a new subject, network pharmacology has the characteristics of systematization, integrity and multi-channel regulation of signal pathway, which is consistent with the main characteristics of the theoretical system of traditional Chinese medicine.
OBJECTIVE: To screen out the main active components of Shaoyao Gancao Decoction by network pharmacology, construct the active compound-target network, and elucidate the mechanism by which Shaoyao Gancao Decoction treats the early pain of lumbar disc herniation.
METHODS: The active components of Shaoyao Gancao Decoction were retrieved by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database, and the target genes of active components were selected by AMDE parameters. The relevant target genes of lumbar disc herniation were retrieved from OMIM and Gene Cards database, and the target genes of active components were matched with Shaoyao Gancao Decoction to obtain the intersection targets. The drug-disease-target network map was constructed by using Cytoscape 3.7.2., and the protein-protein interaction network of intersection targets was obtained by STRING platform. Gene ontology (GO) functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed using R software. Finally, the main active compounds of the obtained drugs were molecularly docked with key core proteins in the protein-protein interaction network using AutoDock Vina.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 87 active ingredients such as quercetin, anthocyanin, kaempferol and 47 potential targets such as interleukin-6, interleukin-1β and matrix metalloproteinase 9 were contained in Shaoyao Gancao Decoction. The GO function enrichment analysis showed that Shaoyao Gancao Decoction was mainly involved in the molecular composition of membrane raft, membrane region and collagen containing extracellular matrix, affected the molecular functions of cytokine receptor binding, endopeptidase activity, receptor ligand activity, and participated in biological processes such as response to molecule of bacterial origin, response to reactive oxygen species and cellular respond to oxidative stress. The KEGG pathway enrichment analysis indicated that Shaoyao Gancao Decoction mainly played the role of anti-oxidation, anti-inflammation and regulated immune responses through tumor necrosis factor signaling pathway, hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway and interleukin-17 signaling pathway. Molecular docking results showed that uercetin, menthol and kaempferol, the core compounds of Shaoyao Gancao Decoction, could be closely combined with the core targets, providing the necessary conditions for further exerting the anti-inflammatory and analgesic effects of Shaoyao Gancao Decoction. Overall findings indicate that Shaoyao Gancao Decoction mainly plays the role of anti-oxidation and anti-inflammation as well as regulate immune response through the characteristics of multi-component, multi-target and multi-channel (for example, quercetin can act on the target of matrix metalloproteinase-9 and regulate the tumor necrosis factor signaling pathway), and preliminarily explains the mechanism of Shaoyao Gancao Decoction in the treatment of early pain of lumbar disc herniation.

Key words: lumbar vertebra, traditional Chinese medicine, lumbar disc herniation, pain, mechanism, network pharmacology, molecular docking, signaling pathways

中图分类号:

钟远鸣, 何炳坤, 吴卓檀, 吴思贤, 万通, 钟锡锋. 芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3194-3201.

Zhong Yuanming, He Bingkun, Wu Zhuotan, Wu Sixian, Wan Tong, Zhong Xifeng. An exploration on the mechanism of Shaoyao Gancao Decoction in treating early pain of lumbar disc herniation based on network pharmacology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(20): 3194-3201.

图/表（结果） 9

2.1 芍药甘草汤活性成分及作用靶点筛选结果根据筛选条件进行筛选后，发现芍药甘草汤共有105种活性成分，去除重复及无法在UniProt数据库找到相应靶标的18种活性成分，最后纳入87种有效活性成分，其中白芍4种，甘草84种，对应靶标蛋白共217种，山奈酚为二者共有成分。甘草的化学成分主要包括黄酮类、二氢茋类、多糖类、酚类、甾体类、挥发油类、苷类和有机酸类[21]。白芍的化学成分主要包括单萜及其苷类、萜类、黄酮类、鞣质类和多糖类[22]，其中，萜类、黄酮类、挥发油类、甾体类、苷类和有机酸类归属心经；黄酮类、有机酸类、挥发油类、萜类、苷类和多糖类归属于肝经，黄酮类、挥发油类、苷类、萜类、有机酸类、多糖类和甾体类归属于肺经[23]。部分关键活性成分见表2。

2.2 腰椎间盘突出症疾病靶标获取结果通过OMIM数据库及GeneCards 数据库共搜索到腰椎间盘突出症疾病靶标423个，将这些基因与芍药甘草汤有效成分作用的靶标进行逐一映射，共获得47个交集基因，利用R软件可视化得到药物-疾病靶标韦恩图，见图1。

2.3 药物-关键活性成分-靶标网络图构建结果将筛选出来的47种芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症的交集靶标与芍药甘草汤中药物的关键活性成分进行逐一映射，构建两者对应关系。根据对应关系及相关属性，利用Cytoscape 3.7.2软件建立“药物-关键活性成分-靶标”调控网络并进一步可视化，结果见图2。通过软件中附属“CentiScape”功能计算各节点对应的“Degree”值，数值越大，提示该节点发挥的作用越重要。在计算结果中，有效活性化合物排在前4名的分别是：槲皮素(MOL000098，quercetin)、山柰酚(MOL000422，kaempferol)、芒柄花素(MOL000392，formononetin)及7-甲氧基-2-甲基异黄酮(MOL003896，7-Methoxy-2-methyl isoflavone)，对应的“Degree”值由大到小分别是38，12，8，8，为该网络的主要化合物。靶标节点中，排在前5名的靶标分别是：环加氧酶2(PTGS2)，雌激素受体1(ESR1)，雄激素受体(AR)，诱导型一氧化氮合酶(NOS2)，丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)，对应的“Degree”值由大到小分别是83，78，66，65，47，为该网络的关键靶标。

2.4 药物-疾病靶标蛋白相互作用网络(PPI)的构建结果将芍药甘草汤及腰椎间盘突出症疾病交集靶标导入String线上分析平台中进行蛋白相互作用分析，保存为tsv文件，借助Cytoscape 3.7.2软件进行网络可视化构建，见图3，该网络中有47个节点通过661条边发生相互作用，蛋白互作富集(P < 0.001)，平均局部聚类系数为0.81，平均节点Degree值28.1。网络中节点颜色深浅及形状大小根据“Degree”值进行设定，节点颜色越深，形状越大则对应的靶标蛋白的“Degree”值越大。当某一靶标蛋白的“Degree”值超过该网络平均值时，提示该靶标蛋白为该PPI网络的核心蛋白。文章结果中，超过均值的靶标蛋白有29个，其中“Degree”值排名前5的有白细胞介素6，白细胞介素1β，基质金属蛋白酶9，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，这些靶标蛋白处于该网络的核心地位。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析结果通过R软件中的
bioconductor集合工具包对药物-疾病交集靶标蛋白进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，结果显示GO功能富集分析涉及27种分子组成，78项分子功能，1 329个生物过程，KEGG通路富集分析显示主要涉及130条信号通路。将排名前20的GO功能富集分析及KEGG通路进行可视化。
生物过程分析可得知，靶标主要涉及对细菌来源分子的反应、对脂多糖的反应、对活性氧的反应、氧化应激反应、对细菌来源分子的反应、对营养水平的反应等生物过程，见图4。分子组成分析可得知，这些靶标主要参与膜筏、膜微区、膜区、含胶原的细胞外基质、囊腔等分子组成。分子功能分析可得知，靶标主要影响细胞因子受体结合、内肽酶活性、受体配体活性及丝氨酸水解酶活性及细胞因子活性等分子功能。

KEGG通路富集分析结果显示，芍药甘草汤主要通过白细胞介素6，白细胞介素1β，基质金属蛋白酶9，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1和血管内皮生长因子A等靶标调控肿瘤坏死因子信号通路、低氧诱导因子1信号通路、白细胞介素17信号通路和松弛素信号通路等多条信号通路来改善腰椎间盘突出症早期疼痛症状的，见图5，6。

2.6 分子对接结果由结果2.3获得的结果可知槲皮素、山柰酚及芒柄花素为芍药甘草汤“Degree”值排名前3的关键有效化合物，将之作为此次分子对接的核心配体。由2.4获得的PPI网络可得知白细胞介素6、白细胞介素1β和基质金属蛋白酶9为网络中“Degree”值排名前3的关键靶标，将之作为此次分子对接的核心受体。核心配体与受体之间对接后的亲和力情况见表3。

由表3可知，槲皮素与白细胞介素6、白细胞介素1β及基质金属蛋白酶9对接后的结合能分别为-5.2，-5.7，
-11.1 kJ/mol，山奈酚与白细胞介素6、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶9对接后的结合能分别为-5.0，-5.4，
-10.3 kJ/mol，芒柄黄素与白细胞介素6、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶9对接后的结合能分别为-5.2，-5.4，
-10.7 kJ/mol。部分芍药甘草汤有效化合物与核心受体对接情况见图7。

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引言

腰椎间盘突出症是由诸多因素致使腰椎间盘正常结构被破坏、髓核组织突出并压迫脊髓及神经根所导致的一种症状性疾病[1]。流行病学调查显示，腰椎间盘突出症影响着全世界2%-3%的人口，在中国的发病率达到了7.62%，该病好发年龄在45-64岁，男性比例偏多，其中约有95%的突出节段位于L4/L5和L5/S1[2-4]。随着办公智能化发展，越来越多的青壮年需久坐工作，使得腰椎间盘长时间受压，从而导致腰椎间盘突出症的发病率显著增高，这严重降低了患者的生活和工作质量，给家庭和社会带来了巨大的负担[5-7]。目前腰椎间盘突出症的常规治疗包括对症止痛及手术治疗，然而长期使用非类固醇抗炎药易引起消化道溃疡，而外科手术则费用高且存在并发症风险，因此早期中医药介入治疗非常有必要[8-10]。
芍药甘草汤来源于《伤寒论》，方中白芍酸甘，归肝脾两经，能养血柔肝止痛，甘草甘平，归心、肺、脾、胃经，药理学研究表明，该方具有抗炎镇痛、解除平滑肌痉挛作用[11]，可用于治疗急性腰扭伤及腰椎间盘突出症等疾病。然目前仍无学者阐明其治疗早期腰椎间盘突出症的疼痛机制，究其原因可能是芍药甘草汤所含活性成分复杂，且作用途径广泛，想要系统对其治疗腰椎间盘突出症早期疼痛的作用机制进行阐述比较困难。网络药理学作为探索分析药物作用机制的新兴研究方法，它能将系统生物学与多向药理学相结合，构建药物-活性成分-疾病-靶点网络，从而系统阐释了药物在各个网络节点的作用机制[12]。文章基于网络药理学及分子对接技术，探讨芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛的作用机制，以期为临床治疗及进一步研究提供新想法及新途径。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 数据库及软件工具见表1。

1.2 芍药甘草汤有效活性成分及作用靶标筛选通过中药系统数据库及分析平台(TCMSP)搜索并筛选芍药甘草汤中所含中药白芍及甘草的有效成分，采用胃肠吸收、分布、代谢和排泄效应模型，以口服生物利用度(OB≥30%)及化合物类药性(DL≥0.18)等条件筛选出符合研究标准的活性成分[13-14]。
1.3 芍药甘草汤靶标预测及相应基因名(gene symbol)的添加利用TCMSP平台化合物靶标识别的功能，筛选出芍药甘草汤活性成分所对应的靶标，由于部分靶标名称冗长，不利于后期数据处理及分析，因此通过UniProt数据库及Strawberry Perl 软件为筛选出的靶标基因更换简化的symbol；由于部分靶标在数据库中找不到对应的基因名，因此实际获得的芍药甘草汤活性成分靶标基因名相对减少。
1.4 腰椎间盘突出症疾病靶标获取基于OMIM数据库及GeneCards数据库[15-16]，检索关键词“Lumbar disc herniation”，时间截止至2020年5月，筛选数据库中腰椎间盘突出症疾病相关靶标基因。
1.5 构建药物-疾病靶标韦恩图将1.4获得的腰椎间盘突出症疾病靶标与芍药甘草汤活性成分靶标取交集，得到药物-疾病靶标网络并通过R语言软件包VennDiagram，进一步可视化绘制出药物-疾病靶标的韦恩图。
1.6 构建药物-有效活性成分-靶标网络图及蛋白相互作用网络(PPI) 借助Cytoscape 3.7.2软件将前面得到的药物、有效成分及相交集靶标基因相互映射，并进一步可视化得到药物-活性成分-靶标网络图，其中各节点分别代表药物成分、疾病、交集靶基因，利用Cytoscape软件中附属“CentiScape”功能计算药物活性成分的“Degree”值，“Degree”值越高提示其在治疗上起作用的概率越大[17]。利用蛋白功能联系网络String线上分析平台，将药物-疾病交集靶标基因输入检索框，物种选择“Homo sapiens”，互作值默认为0.4，并去除边缘游离点[18]，保存tsv文件，借助Cytoscape 3.7.2软件进一步构建并可视化PPI网络，根据“degree”的均值进行核心蛋白筛选。
1.7 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析为进一步探索芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症的生物过程及其调控的信号通路情况，通过R软件中的bioconductor 集合工具包以p value Cutoff < 0.05，q value Cutoff < 0.05为限定条件对药物-疾病交集靶标蛋白进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析[19]，其中GO功能富集分析有分子组成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)和生物过程(Biological Process，BP)3个模块。通过image GP作图平台可视化地GO分析结果的气泡图。选取KEGG分析中前20条通路及调控这些通路的靶标，通过Cytoscape 3.7.2软件，绘制KEGG关系网络，并进一步可视化。
1.8 分子对接选取1.6获得的Degree值排名前三的药物活性成分作为核心配体，通过PubChem数据库获取其3D结构并导入ChemBio3D Ultra 14.0软件进行格式转换，保存为pdb文件。从PPI网络中，选取Degree值前3的靶标蛋白作为核心受体，并在RCSB蛋白质数据库中下载其相应三维结构，运用PyMOL 2.2.0软件对其进行编辑：去除晶体分子中的水分子及原有小分子配体后保存文件为pdb格式。将处理好的核心配体蛋白与核心受体蛋白导入至AutoDockTools 1.5.6软件，进行活性口袋分析、添加极性H并将文件分别保存为pdbqt格式，最后通过AutoDock Vina 1.1.2程序进行分子对接。
AutoDock Vina是由美国Trott及Olson教授团队开发的分子对接和虚拟筛选的新程序，与同为该团队开发的AutoDock 4软件相比，AutoDock Vina通过在多核计算机上使用多线程计算，运算速度提高了约2个数量级[20]，当受体与配体的结合能低于0 kcal/mol时，提示两者对接有良好的亲和力，最终结果通过Pymol绘图及分析。
1.9 主要观察指标 ①PPI网络关键靶标；②核心基因KEGG，GO富集结果；③分子对接结果。

讨论

腰椎间盘突出症早期疼痛是促使患者寻医问药的重要原因，此阶段西医药通常予以激素类药物或者非类固醇抗炎药进行对症止痛处理，在保守治疗期间患者可出现消化道不良反应，给患者带来二次伤害，因此寻求更加安全的保守治疗方案非常必要[24-25]。祖国医学对腰椎间盘突出症有较深的认识，它归属于“腰痹病”“痹证”的范畴[26]。芍药甘草汤作为历代医家推崇的缓急止痛良方，方中甘草具有补脾益气、缓急止痛之功；白芍可柔肝止痛，养血调经，二者配伍酸甘化阴，有柔筋止痛之效，可用于腰椎间盘突出症早期疼痛的治疗。相关临床研究也表明，芍药甘草汤在消除椎间盘突出压迫神经引起的水肿及疼痛症状方面可以取得满意的疗效[27]。目前大多医家只阐述芍药甘草汤的临床疗效，其治疗腰椎间盘突出症早期疼痛的镇痛机制鲜有报道。
文章利用网络药理学研究方法，突破了以往单一药物作用单靶点的思维模式，构建药物-疾病-靶标网络，对关键靶点GO功能及信号通路进行富集分析，系统探讨芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症的作用机制。研究表明，白芍主要活性成分为白芍总苷、山柰酚及β谷甾醇等，其中白芍总苷具有抗炎止痛、调节免疫等多种药理作用，利用其开发的药物(商品名：帕夫林)现已被广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎等疾病的治疗[28]；山柰酚为天然黄酮类化合物，它能抑制氧化应激反应并改善线粒体功能，对腰椎间盘突出症早期纤维环受损组织具有良好的修复作用[29]，并且可减轻腰椎间盘突出症早期疼痛症状。甘草主要活性化合物包括槲皮素、芒柄花素和甘草多糖等。槲皮素可通过自身结构中的酚羟基清除活性氧自由基，并能通过进一步鳌和Fe2+及抑制炎症因子的形成来发挥抗氧化及消炎作用[30-31]；芒柄花素存在自然界多种植物之中，具有良好的药理活性，研究表明芒柄花素可通过激活靠近病变组织的皮质神经元中的白细胞介素10表达来抑制神经炎性反应[32]，从而减轻突出椎间盘卡压脊神经引起的疼痛症状；甘草多糖可显著提高免疫功能，实验表明小鼠接受不同浓度甘草多糖注射液处理后、细胞免疫功能均得到不同程度的提高，对外来刺激及炎症反应具备更高的耐受能力[33]。因此，芍药甘草汤中活性成分的抗氧化、消炎镇痛及调节免疫的功能可能在改善腰椎间盘突出症早期疼痛症状方面发挥重要的作用。
文章PPI网络结果显示，芍药甘草汤有效活性成分关键作用靶标为白细胞介素6、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶9、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1和血管内皮生长因子A等。作为介导炎症反应的重要物质之一，白细胞介素6参与膝关节退行性骨关节炎、强直性脊柱炎、腰椎间盘突出症等骨科疾病的发生发展[34]。YANG等[35]发现神经损伤后3周内白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等炎症因子显著增高，后两者是神经炎症和应激反应的关键介质，动物实验进一步表明白细胞介素6可激活JAK2/STAT3信号通路诱导肿瘤坏死因子α的表达，并通过JAK2/STAT3和ERK通路诱导白细胞介素1β的产生，由此认为白细胞介素6参与了神经病理性疼痛的维持，并通过诱导肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的产生而起到易化作用；芍药甘草汤有效活性成分可能通过抑制这些炎症因子的生成从而减轻腰椎间盘突出症早期的疼痛症状。在生理情况下，基质金属蛋白酶可水解老化及受损的椎间盘组织，而在退变的椎间盘组织中，它的过度激活可使椎间盘组分大量降解，导致椎间盘退化，引起疼痛症状[36]。研究表明miR133a基因的下调会诱导基质金属蛋白酶9上升，它可异常分解Ⅱ型胶原蛋白进而促进椎间盘退变的发生[37]。血管内皮生长因子对椎间盘退变有着重要的影响和作用，退变椎间盘组织中存在大量血管内皮生长因子基因的表达，这可促进椎间盘中血管和淋巴管再生，而淋巴管和血管的重塑可促进椎间盘组织的修复与重建，有利于改善或延缓椎间盘退变的发展并减轻患者疼痛症状[38]。
GO功能富集分析及KEGG通路富集分析同样与抗氧化、炎症反应及免疫调节有关。KEGG通路富集分析主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、低氧诱导因子1信号通路及白细胞介素17信号通路等。这些通路在改善腰椎间盘突出症早期疼痛肿瘤坏死因子是强有力的促炎因子，在已退变的椎间盘组织中可见高表达，其机制可能是肿瘤坏死因子α上调了基质金属蛋白酶活性及基因表达，基质金属蛋白酶可促进椎间盘基质内主要成分蛋白多聚糖的降解，使椎间盘基质结构和完整性受到破坏，另外肿瘤坏死因子α可刺激炎性因子如白细胞介素1、白细胞介素6及前列腺素E2的产生，进而启动炎症反应引起疼痛症状并维持该反应对椎间盘的影响[39]。芍药甘草汤活性成分可能作用于肿瘤坏死因子信号通路，进而抑制炎性因子的产生发挥抗炎止痛作用。低氧诱导因子1α可以提高髓核细胞适应低氧环境的能力，通过调控其稳定表达可治疗椎间盘退变，作用机制可能与其参与了糖代谢能量过程及髓核细胞的自噬反应有关[40]。低氧诱导因子1α的下游基因磷酸甘油酸激酶1是糖酵解过程中的一种催化酶，它可催化ATP产生，而ATP是细胞能量的重要来源，低氧诱导因子1α基因表达降低会导致髓核细胞营养和能量供应不充分，最终导致细胞凋亡并引起椎间盘退变；细胞自噬是髓核细胞适应低氧环境时做出的一种生理反应，适度的自噬可减少能量的消耗，有利于髓核细胞适应低氧环境，反之则会导致细胞死亡。低氧环境可激活AMPK/mTOR通路，促进低氧诱导因子1α的表达，从而抑制椎间盘退变[41]，芍药甘草汤活性成分可能调控低氧诱导因子1信号通路，促进低氧诱导因子1α因子表达，从而给髓核细胞提供更多营养，避免髓核细胞过度自噬，减轻疼痛症状。白细胞介素17是与自身免疫性疾病相关的一种强力致炎因子，是腰椎间盘突出症早期疼痛症状。有研究表明白细胞介素17A可通过p38 /c-Fos 和JNK/c-Jun 途径诱导退变髓核组织产生前列腺素E2、肿瘤坏死因子α及白细胞介素6等炎症因子，从而发挥致炎作用[42]。甘草提取物-槲皮素可降低肿瘤坏死因子α诱导的产生的炎症因子如白细胞介素1β，6，8，从而发挥抗炎镇痛作用[43]。白芍总苷具有强力的镇痛及抗炎效果，有研究表明白芍总苷可通过抑制肿瘤坏死因子α及白细胞介素6，1的水平来抑制局部炎症反应，减轻疼痛症状[44]。此外，白芍总苷还参与多种自身免疫性疾病的治疗，其免疫调节机制可能通过多途径、多靶点来完成的[45]。
分子对接中，文章选取“Degree”值排名前3的槲皮素、山柰酚及芒柄花素与PPI蛋白互作网络中关节靶标白细胞介素6、白细胞介素1β和基质金属蛋白酶9进行对接。当核心受体与核心配体结合稳定时能量越低则两者的亲和力越高，并且发生相互作用的可能性就越大[46]。而芍药甘草汤中有效化合物与核心靶标结合时的结合能均小于0 kJ/mol，分子对接结果显示槲皮素、芒柄花素和山奈酚可与核心靶标紧密结合，为进一步发挥芍药甘草汤消炎镇痛作用提供必要条件。
综上所述，芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛的可能机制是通过调控白细胞介素6、基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1及血管内皮生长因子A等，进而抑制炎症因子的产生，减轻炎症反应及免疫反应来实现的，该治疗过程存在着多个药物有效化合物、治疗靶点及信号通路，体现出中药复方多成分-多靶点-多通路治疗疾病的特点，为临床保守治疗腰椎间盘突出症早期疼痛及进一步研究相关机制提供了参考。但文章也有局限性：受筛选条件限制，只选择了芍药甘草汤部分关键成分、治疗靶点及相关通路进行研究，未来仍需进行相关药理学试验验证并进一步补充说明。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛作用机制的网络药理学分析

An exploration on the mechanism of Shaoyao Gancao Decoction in treating early pain of lumbar disc herniation based on network pharmacology

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