脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3512

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (13): 2011-2017.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3512

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脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠的机制

张晶莹1，孙晓林2，耿立霞1

1内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院重症医学科，内蒙古自治区包头市 014010；2包头医学院第一附属医院风湿免疫科(包头医学院风湿免疫研究所)，内蒙古自治区自体免疫学重点实验室，内蒙古自治区包头市 014010

收稿日期:2020-05-27 修回日期:2020-05-28 接受日期:2020-06-17 出版日期:2021-05-08 发布日期:2020-12-28
通讯作者: 耿立霞，主任医师，硕士生导师，内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院重症医学科，内蒙古自治区包头市 014010 孙晓林，博士，包头医学院第一附属医院风湿免疫科(包头医学院风湿免疫研究所)，内蒙古自治区自体免疫学重点实验室，内蒙古自治区包头市 014010
作者简介:张晶莹，女，1992年生，在读硕士，主要从事间充质干细胞治疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81860294)，项目负责人：孙晓林；内蒙古自然科学基金项目(2019MS08055)，项目负责人：孙晓林；内蒙古科技计划项目(201802089)，项目负责人：耿立霞

Therapeutic mechanism of adipose mesenchymal stem cells in mice with systemic sclerosis

Zhang Jingying1, Sun Xiaolin2, Geng Lixia1

1Department of Intensive Medicine, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science & Technology, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Key Autoimmunity Laboratory of Inner Mongolia, Institute of Rheumatology, Department of Rheumatology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2020-05-27 Revised:2020-05-28 Accepted:2020-06-17 Online:2021-05-08 Published:2020-12-28
Contact: Geng Lixia, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Intensive Medicine, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science & Technology, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China Sun Xiaolin, MD, Key Autoimmunity Laboratory of Inner Mongolia, Institute of Rheumatology, Department of Rheumatology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Zhang Jingying, Master candidate, Department of Intensive Medicine, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science & Technology, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860294 (to SXL); the Natural Science Foundation Project of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2019MS08055 (to SXL); the Science and Technology Planning Project of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 201802089 (to GLX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脂肪间充质干细胞：间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一群具有多向分化潜能、低免疫原性、可自我复制的多能干细胞，已有研究证实间充质干细胞可以促进皮肤创面的修复。脂肪间充质干细胞与其他干细胞相比，具有来源广泛、方便处理及免疫调节能力更强等优势。
系统性硬化症：是一种病理表现为慢性炎症浸润、组织及器官纤维增生的自身免疫性疾病，约2/3的系统性硬化症患者会累及肺部，主要表现为肺间质纤维化及肺动脉高压，其中肺动脉高压会导致患者通气功能和换气功能障碍，是系统性硬化症患者死亡的常见原因。

背景：虽然已有临床研究发现，自体脂肪间充质干细胞可以有效减轻辐射诱导的系统性硬化症患者面部的纤维化，但其作用机制尚未被深入分析。
目的：探讨脂肪间充质干细胞对博来霉素诱导的系统性硬化症模型小鼠的作用机制。
方法：取SPF级 6-8周龄C57BL/6J雌鼠40只随机分为正常对照组、脂肪间充质干细胞治疗组、博莱霉素组和PBS组，后3组每隔1 d皮下注射博莱霉素，持续28 d，建立系统性硬化症小鼠模型。造模成功后脂肪间充质干细胞组给予皮下注射脂肪间充质干细胞治疗，PBS组皮下注射PBS，均持续治疗14 d。通过ELISA法检测各组小鼠血清中白细胞介素17、转化生长因子β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平，苏木精-伊红染色和Masson染色观察系统性硬化症小鼠皮肤和肺组织病变，免疫荧光法检测小鼠皮肤和肺组织中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ及CD31的表达水平。
结果与结论：①与博莱霉素组相比，脂肪间充质干细胞治疗组白细胞介素17、转化生长因子β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达水平显著降低(P < 0.01)；②与正常对照组相比，博莱霉素组小鼠皮肤真皮层增厚，炎症细胞浸润，皮肤附属器减少；肺泡萎缩塌陷，有许多炎性细胞浸润，肺小动脉壁增厚、微血管基底膜增厚及类纤维蛋白坏死，经脂肪间充质干细胞治疗后炎性症状有所改善；③与正常对照组相比，博莱霉素组小鼠的皮肤和肺组织中胶原纤维大量聚集，经脂肪间充质干细胞治疗后胶原纤维减少；④经脂肪间充质干细胞治疗后，博莱霉素组小鼠皮肤和肺组织中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ表达水平降低，皮肤组织中CD31表达增多(P < 0.01)；⑤结果表明，脂肪间充质干细胞可调节博莱霉素小鼠的免疫反应，具有抗纤维化、缓解炎症和减轻血管病变的作用。

https://orcid.org/0000-0001-8169-0258(张晶莹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪间充质干细胞, 抗炎, 抗纤维化, 免疫反应, 系统性硬化症, 小鼠, 实验

Abstract: BACKGROUND: Although clinical studies have found that autologous adipose mesenchymal stem cells can effectively reduce facial fibrosis in patients with radiation-induced systemic sclerosis, but the mechanism of action has not been thoroughly analyzed.
OBJECTIVE: To study the mechanism of action of adipose mesenchymal stem cells on bleomycin-induced systemic sclerosis in mice.
METHODS: Forty SPF C57BL/6J female mice aged 6-8 weeks were randomly assigned to normal control group, adipose mesenchymal stem cells group, bleomycin group, and PBS group. Mice in the latter three groups were subjected to subcutaneous injection with bleomycin every other day for 28 days, and mouse models of systemic sclerosis were established. After successful model establishment, mice in the adipose mesenchymal stem cells group were subcutaneously injected with adipose mesenchymal stem cells; mice in the PBS group were subcutaneously injected with PBS; the treatments lasted for 14 days. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the levels of serum interleukin-17, transforming growth factor-β, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α. Hematoxylin-eosin staining and Masson staining were utilized to measure histopathological changes in the skin and lung of systemic sclerosis mice. Immunofluorescence method was applied to examine collagen I, III, and V and CD31 expression levels in the skin and lung.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the bleomycin group, the expression levels of interleukin-17, transforming growth factor-β, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α were significantly decreased in the adipose mesenchymal stem cells group (P < 0.01). (2) Compared with the normal control group, the skin dermis of mice was thickened; inflammatory cells infiltrated; skin appendages reduced; the alveoli were atrophic and collapsed; with a lot of inflammatory cell infiltration, pulmonary arteriole wall thickening, microvascular basement membrane thickening, and fibrinoid necrosis, and the inflammatory symptoms improved after treatment in the adipose mesenchymal stem cells group. (3) Compared with the normal control group, the skin and lung tissues of bleomycin group mice showed a large aggregation of collagen fibers, and the collagen fibers were reduced after adipose mesenchymal stem cells treatment. (4) After treatment with adipose mesenchymal stem cells, the expression levels of collagen I, III, and V were decreased in the skin and lung tissue of mice, but the expression of CD31 in the skin tissues was increased in the bleomycin group (P < 0.01). (5) The results suggested that adipose mesenchymal stem cells can regulate the immune response of bleomycin mice and reduce fibrosis, inflammation and vascular lesions.

Key words: stem cells, adipose mesenchymal stem cells, anti-inflammatory, anti-fibrotic, immunoreaction, systemic sclerosis, mice, experiment

中图分类号:

张晶莹, 孙晓林, 耿立霞. 脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2011-2017.

Zhang Jingying, Sun Xiaolin, Geng Lixia. Therapeutic mechanism of adipose mesenchymal stem cells in mice with systemic sclerosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(13): 2011-2017.

图/表（结果） 10

2.1 脂肪间充质干细胞的诱导分化能力成骨诱导分化后细胞逐渐由长梭形变为多角形，碱性磷酸酶染色后可见黑色或棕黑色颗粒，提示碱性磷酸酶活性较高，见图1A；茜素红染色后可见细胞内钙化结节呈橘红色，见图1B，证实脂肪间充质干细胞已成功向成骨方向诱导分化。成脂诱导分化后细胞形态逐渐由长梭形变短并膨胀、呈短梭形。细胞内可见大量被染成鲜红色的脂滴，见图1C，证实脂肪间充质干细胞已成功向成脂方向诱导分化。

2.2 脂肪间充质干细胞免疫表型通过流式细胞术检测脂肪间充质干细胞的表面标志物，其中CD34、CD45及CD11c低表达，CD105、CD90及CD44呈高表达，见图2。

2.3 系统性硬化症小鼠模型的建立及治疗正常对照组小鼠背部皮肤光滑，见图3A；博莱霉素组背部皮肤坚硬，有溃疡和皱褶，见图3B；脂肪间充质干细胞治疗组小鼠病变部位皮肤恢复平滑，见图3C；PBS对照组小鼠背部皮肤仍然坚硬并存在皱褶，见图3D。

2.4 各组血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、转化生长因子β水平博莱霉素组血清转化生长因子β、白细胞介素17、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平均明显高于正常对照组(均P < 0.01)，脂肪间充质干细胞治疗后血清转化生长因子β、白细胞介素17、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平较博莱霉素组均明显降低(均P < 0.01)，博莱霉素组及PBS对照组血清各因子水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5 组织病理学观察结果冰冻切片通过苏木精-伊红染色发现博莱霉素组小鼠皮肤真皮层增厚，炎症细胞浸润，皮肤附属器减少；经过脂肪间充质干细胞治疗后，小鼠皮肤真皮层变薄，皮肤附属器增多。博莱霉素组和PBS组小鼠肺泡萎缩、塌陷、囊性变化，并伴有炎性细胞浸润；经过脂肪间充质干细胞治疗后，炎性细胞浸润减少，肺泡数量增加。脂肪间充质干细胞治疗组与正常对照组之间无显著差异，博莱霉素组与PBS对照组之间无显著差异，见图5。

2.6 Masson染色结果正常对照组小鼠皮肤组织，胶原纤维很少；博莱霉素组皮肤中胶原纤维大量聚积，平行于表皮的胶原纤维束增加，并延伸至博莱霉素组的皮肤组织深处；脂肪间充质干细胞治疗组胶原纤维数量减少，PBS对照组胶原纤维仍然很多。博莱霉素组肺间质和肺泡广泛纤维化，脂肪间充质干细胞治疗组小鼠肺组织胶原纤维数量减少，见图6。

2.7 免疫荧光检测胶原蛋白的表达结果 CD31的表达主要定位于细胞膜，而胶原Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ的表达则主要位于皮肤和肺组织的细胞外基质中。正常对照组和脂肪间充质干细胞治疗组皮肤及肺组织中的胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ蛋白水平均显著低于博莱霉素组；脂肪间充质干细胞治疗组和正常对照组之间以及博莱霉素和PBS对照组之间皮肤和肺组织中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ蛋白水平差异均无显著性意义(P > 0.05)。正常对照组和脂肪间充质干细胞治疗组皮肤组织中CD31蛋白水平显著高于博莱霉素组和PBS对照组；脂肪间充质干细胞治疗组和正常对照组之间以及博莱霉素和PBS治疗组之间皮肤组织中CD31蛋白水平差异无显著性意义(P > 0.05)。肺组织中CD31蛋白的表达水平在正常对照组、脂肪间充质干细胞组、博莱霉素组及PBS组中均差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图7-10。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 2018年9月至2019年8月在包头医学院第一附属医院风湿免疫科(包头医学院风湿免疫研究所)，内蒙古自治区自体免疫学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠80只，体质量20 g左右，购于上海轩研生物科技有限公司。
1.3.2 实验试剂及仪器博来霉素(美国Thermo Fisher
Scientific公司)；DMEM/F12、胎牛血清、PBS、DPBS(美国Gibco公司)；碱性磷酸酶测定试剂盒(上海葛帆生物技术有限公司)；茜素红及油红O测定试剂盒(北京索拉尔生物科技有限公司)；鼠抗人CD105-FITC、CD90-FITC、CD44-PE、
CD34-PE、CD11c-PE、CD45-FITC单抗(美国BD公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(苏州酶免生物有限公司)；抗CD31(ab9498)、抗胶原蛋白Ⅰ(ab34710)、抗胶原蛋白Ⅲ(ab7778)和抗胶原蛋白Ⅴ(ab7046)、山羊抗兔IgG
(ab150083)(英国Abcam公司)；Hoechst 33258(美国Thermo Fisher Scientific公司)；细胞培养箱(日本SANYO公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离培养 40只雌性小鼠行颈椎脱位安乐死并在体积分数为75%乙醇中消毒30 min。取腹股沟的皮下脂肪组织，PBS洗涤3次，无菌组织剪将组织剪碎，置于Ⅰ型胶原酶中37 ℃消化30 min，70 μm过滤器纯化后将滤液以1 600 r/min离心5 min，将细胞沉淀重悬于含体积分数为10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养基中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱内培养，每三四天换液1次，当细胞长至90%融合时进行传代培养，取第3代脂肪间充质干细胞用于后续实验。

1.4.2 脂肪间充质干细胞诱导分化检测取60%-70%融合的第3代脂肪间充质干细胞，更换成骨诱导分化培养液及成脂诱导分化培养液，每3 d换液1次，培养21 d后移除培养基，PBS润洗2次后进行以下检测。①碱性磷酸酶染色：加入孵育液37 ℃孵育15 min，硫酸钴溶液处理一两分钟，流水冲洗后1 mL PBS覆盖细胞，显微镜下观察，碱性磷酸酶活性处呈黑色或棕黑色；②茜素红染色法：用茜素红S染色液滴染2 min，稍水洗后McGee-Russell 分化液迅速分化数秒，Mayer苏木精染色液浅染胞核2 min，PBS浸洗3次，1 mL PBS覆盖细胞，显微镜下观察可见细胞内出现红色的矿化结界；③油红O染色：加入ORO Fixative固定液固定，蒸馏水洗2次，60%异丙醇浸洗，加入配好的ORO Stain，弃去染色液，水洗3次，加入Mayer苏木精染色液染核2 min，加入ORO Buffer 1 min后弃去，1 mL PBS覆盖细胞并在显微镜下观察，诱导后的细胞胞浆中可见红色的油滴。

1.4.3 脂肪间充质干细胞免疫表型鉴定用胰蛋白酶消化收集第3代脂肪间充质干细胞，DPBS洗涤2次后分装到6个流式管中，分别加入大鼠抗小鼠单抗CD105-FITC、CD90-FITC、
CD44-PE、CD34-PE、CD11c-PE、CD45-FITC及同型对照各4 μL，
室温避光孵育30 min，洗涤并重悬于DPBS，流式细胞仪上机检测，与同型对照相近的低表达水平为阴性；与同型对照相比，较高范围的高表达水平为阳性。
1.4.4 系统性硬化症小鼠模型的建立及治疗选取6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠40只，将小鼠按随机数字表法分为正常对照组、博莱霉素组、脂肪间充质干细胞治疗组及PBS对照组，每组10只。造模：隔天小鼠皮下注射博来霉素(10 mg/kg)，
持续28 d诱导系统性硬化症模型。正常对照组不予任何处理；博莱霉素组在系统性硬化症模型诱导成功后，不予任何处理，可见注射区背部皮肤增厚、坚硬，有溃疡和皱褶；脂肪间充质干细胞治疗组在诱导系统性硬化症模型成功后，隔日在病变部位皮肤皮下注射脂肪间充质干细胞(2×105个细胞)进行治疗，持续14 d；PBS对照组在诱导系统性硬化症模型成功
后，隔日皮下注射PBS(2 mL/kg)，持续14 d。
1.4.5 ELISA检测小鼠血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、转化生长因子β水平最后1次注射脂肪间充质干细胞或PBS之后1周内，取各组小鼠心脏血，分离血清，实验设空白孔、标准孔及待测样品孔，每个样本设3个复孔，样品稀释度为5倍。将样品加于酶标板孔底部，37 ℃温育30 min，洗涤后加入酶标试剂，37 ℃温育30 min，洗涤后加入显色剂，37 ℃避光显色10 min，加终止液终止反应，分别检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、转化生长因子β水平。
1.4.6 组织病理形态分析最后1次注射脂肪间充质干细胞或PBS之后1周内，取各组小鼠背部注射部位皮肤及肺组织，立即在液氮中冷冻，转移至-80 ℃的冰箱中24 h，进行冰冻切片，切片厚约5 μm。切片蒸馏水洗5 min，苏木精染色
5 min，稍水洗，盐酸乙醇分化，水洗1 min，水洗返蓝
1 min，蒸馏水洗1 min，体积分数为50%乙醇5 min，体积分数为70%乙醇5 min，体积分数为85%乙醇5 min，体积分数为95%乙醇5 min，伊红染色1 min，体积分数为95%乙醇5 min，体积分数为95%乙醇5 min，无水乙醇5 min，无水乙醇5 min，二甲苯与无水乙醇1∶1溶液5 min，二甲苯5 min，二甲苯5 min，中性树胶封固，显微镜下观察皮肤和肺组织的组织病理学变化。
1.4.7 Masson染色冰箱取出冰冻切片，蒸馏水润湿玻片30-60 s，加入适量苏木精染液染色30-60 s，弃去，清洗液冲洗30 s，加适量磷钼酸分色液6-8 min，弃去，加适量苯胺蓝复染液5 min，弃去，无水乙醇冲洗干净，吹干后中性树胶封固，显微镜下观察。染色结果：胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，细胞核呈黑色。
1.4.8 免疫荧光检测胶原蛋白的表达对皮肤及肺组织切片进行免疫荧光检测，观察胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、CD31的细胞定位。将冰冻切片血清室温封闭20 min，4 ℃一抗CD31(1∶100稀释)、胶原蛋白Ⅰ(1∶500稀释)、胶原蛋白Ⅲ(1∶500稀释)和胶原蛋白Ⅴ(1∶200稀释)孵育过夜，二抗山羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)37 ℃孵育20 min，DAB 显色，苏木精复染，Hoechst 33258用于细胞核染色，显微镜下观察。依照 Xue等[9]方法，随机抽取5个区域测定染色强度并计分。不计染色面积所占比例时，将染色强度分为3分(强染色)、2分(中度染色)、1分(弱染色)和0分(无染色)。不计染色强度时，将染色面积比例分为3分(70%-100%阳性免疫反应性)、2分(10%-69%阳性免疫反应性)，1分(1%-9%阳性免疫反应性)和0分(<1%免疫反应性)。每个样本的加权评分通过染色强度评分乘以染色面积所占比例评分进行计算。
1.5 主要观察指标 ①各组小鼠血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、转化生长因子β水平；②各组小鼠皮肤及肺组织病理学改变；③各组小鼠皮肤及肺组织胶原纤维数量；④各组小鼠皮肤及肺组织中胶原蛋白及CD31的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用x±s表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t 法。使用GraphPad Prism 7.0绘制直方图，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

系统性硬化症是一种发病率和死亡率很高的自身免疫性疾病，特征性病变有血管病变和结缔组织纤维化，目前认为其发病机制与免疫异常、细胞外间质代谢异常和细胞因子异常有关。在系统性硬化症病程发展中，成纤维细胞的增殖会导致过量促纤维化的细胞外基质分子如Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型胶原蛋白沉积[10]。大部分系统性硬化症会累及肺部，出现肺间质纤维化及肺动脉高压，引起患者通气功能和换气功能障碍，是系统性硬化症患者死亡的主要原因。然而，临床尚无有效治疗系统性硬化症的方法[11]。由于系统性硬化症病程较长，患者依从性差，常出现自行退出、失访等现象，临床研究往往无法顺利进行。因此，选择合适的动物建立系统性硬化症模型对于研究其发病机制和寻求新的治疗方法至关重要。早在1999年，YAMAMOTO等[12]利用博来霉素建立了系统性硬化症模型小鼠，通过检测羟脯氨酸的表达水平证明了模型鼠的皮肤纤维化，其发现皮下注射博来霉素4-6周即可诱发炎症和纤维化。间充质干细胞临床治疗的安全性已被证明，已有一些间充质干细胞应用于系统性硬化症的临床试验。GRANEL等[13]通过皮下注射自体脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症，发现可以明显改善患者疼痛及抓握能力。CHRISTOPEIT等[14]
通过静脉注射骨髓间充质干细胞治疗系统性硬化症，发现患者疼痛性溃疡明显减少。MARIA等[15]对系统性硬化症模型小鼠皮下输注间充质干细胞，发现小鼠皮肤炎症得到改善。因此，该实验采用皮下注射脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠。脂肪间充质干细胞与其他来源的间充质干细胞相比，具有来源广泛、方便处理及免疫调节能力更强等优势。CHAI等[16]发现脂肪间充质干细胞通过p38/MAPK途径可抑制胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达。CASTIGLIONE
等[10]发现在慢性Peyronie(PD)疾病大鼠模型中，注射人脂肪间充质干细胞会降低胶原蛋白Ⅲ的表达。该研究发现，系统性硬化症模型鼠在脂肪间充质干细胞治疗后，皮肤及肺组织纤维化水平明显改善，提示脂肪间充质干细胞可能具有一定抗纤维化的作用。
慢性炎症、缺血、细菌感染等与系统性硬化症纤维化密切相关，这些刺激可以使肌纤维母细胞活化并产生大量细胞外基质，最终导致全身弥漫性纤维化。间充质干细胞可以通过免疫抑制作用，使肌纤维母细胞活化受到抑制，调节细胞外基质合成及降解平衡，改善系统性硬化症皮肤及肺组织纤维化。SONG等[17]利用RT-PCR检测出系统性硬化症患者皮肤中Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白高水平表达。JUHL等[18]发现早期系统性硬化症患者血清中Ⅲ型及Ⅴ型胶原蛋白的生物标志物表达上调。MOODLEY等[19]利用脐带间充质干细胞治疗由博来霉素诱导的肺损伤模型小鼠，发现炎性因子及胶原蛋白表达降低，并且具有降解胶原蛋白功能的基质金属蛋白酶表达增加。为了进一步研究系统性硬化症皮肤及肺组织纤维化组织病理学改变，该研究分别采用苏木精-伊红染色、Masson染色及免疫荧光染色检测了各组小鼠皮肤及肺组织病理学改变，结果发现博莱霉素组小鼠皮肤和肺组织的结构被破坏，伴有炎性细胞浸润和大量Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅴ型胶原蛋白聚积，这些结果与相关研究一致，而脂肪间充质干细胞治疗组小鼠皮肤及肺组织炎性细胞浸润减少，肺泡结构有所恢复，肺泡数量大量增加，Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅴ型胶原蛋白表达减少，并且脂肪间充质干细胞治疗组和正常对照组之间以及博莱霉素组和PBS对照组之间3种胶原蛋白表达差异无显著性意义，均表明脂肪间充质干细胞治疗组小鼠纤维化水平得到改善，提示脂肪间充质干细胞具有抗纤维化的作用。
到目前为止已发现多种细胞因子的异常表达都与系统性硬化症组织纤维化相关。DUFOUR等[4]发现系统性硬化症中白细胞介素17A、转化生长因子β和白细胞介素6的表达水平升高。KYLHAMMAR等[20]发现患有肺动脉高压并发症的系统性硬化症患者血浆中肿瘤坏死因子α表达水平增高。α-平滑肌肌动蛋白在所有成纤维细胞中表达，并在肺纤维化中高表达，而转化生长因子β可以激活α-平滑肌肌动蛋白。成纤维细胞向肌成纤维细胞转化是系统性硬化症纤维化的标志，所以转化生长因子β在系统性硬化症纤维化中起关键作用。白细胞介素17和转化生长因子β可增强系统性硬化症成纤维细胞中白细胞介素6的产生，而肿瘤坏死因子α对系统性硬化症炎性条件纤维化起到维持作用[21]。该研究采用ELISA方法检测各组血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、转化生长因子β水平，结果发现博莱霉素组白细胞介素17、转化生长因子β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平显著高于正常对照组，与相关研究一致，而脂肪间充质干细胞组各因子表达显著降低，提示脂肪间充质干细胞具有抗炎和抗纤维化作用。
CD31是内皮抗原的标记物，用于评估真皮浅层和深层的血管数量和口径。已有研究证实系统性硬化症中血管新生缺陷会导致血管病变[22]。GARCÍA-MARTÍN等[23]发现博来霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型中，血管周长和CD31+细胞都有所减少。该研究发现博莱霉素组小鼠皮肤组织中CD31的表达明显低于正常对照组，而脂肪间充质干细胞治疗组CD31表达显著增多，表明皮肤组织中有新的血管生成，但4个实验组小鼠肺组织中CD31的表达没有显著差异，提示脂肪间充质干细胞在缓解皮肤组织微血管损伤中可能起关键作用，在缓解肺组织微血管损伤中作用不明显。
综上所述，脂肪间充质干细胞可以降低Ⅰ型，Ⅲ型和Ⅴ型胶原的表达，在皮肤和肺组织中起着抗炎和抗纤维化的作用。脂肪间充质干细胞还可以下调系统性硬化症小鼠血清中白细胞介素17、转化生长因子β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达，调节免疫反应。此外，脂肪间充质干细胞具有提高皮肤中CD31+表达的能力，在系统性硬化症小鼠皮肤血管损伤中起一定治疗作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠的机制

Therapeutic mechanism of adipose mesenchymal stem cells in mice with systemic sclerosis

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