Cx43敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心脏神经嵴来源间充质细胞减少

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2992

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (13): 2018-2024.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2992

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Cx43敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心脏神经嵴来源间充质细胞减少

李行，景雅，李云华，李海荣，杨艳萍

山西医科大学组织胚胎学教研室，山西省太原市 030001

收稿日期:2019-12-23 修回日期:2019-12-28 接受日期:2020-02-26 出版日期:2021-05-08 发布日期:2020-12-28
通讯作者: 杨艳萍，博士，教授，山西医科大学组织胚胎学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:李行，女，1997年生，山西省长治市人，汉族，山西医科大学在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金(31200899)，项目负责人：杨艳萍

A downtrend of mesenchymal cells derived from the second heart field and cardiac neural crest in the outflow tract of Cx43 knockout embryonic mouse heart

Li Hang, Jing Ya, Li Yunhua, Li Hairong, Yang Yanping

Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2019-12-23 Revised:2019-12-28 Accepted:2020-02-26 Online:2021-05-08 Published:2020-12-28
Contact: Yang Yanping, MD, Professor, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Li Hang, Master candidate, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31200899 (to YYP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
第二生心区：由咽前间充质、心包腔背侧壁脏壁中胚层等构成。第二生心区的前体细胞可分化为心肌细胞，不断添加至心管的动脉端和静脉端，形成流出道、右心室和大部分心房。第二生心区发育异常导致心管缩短和动脉干畸形等。
心脏神经嵴：神经嵴是来自于所有轴向水平的神经管背侧的多能细胞群，而心脏神经嵴是指中耳基板到第3体节的神经嵴。心脏神经嵴细胞迁移至弓动脉壁周围与心脏流出道，参与弓动脉壁的发育和流出道的分隔。

背景：Cx43被认为在人类先天性心脏病中起着重要的作用，目前对于Cx43基因敲除后形成心脏畸形的相关机制尚不清楚。
目的：探讨敲除Cx43后心脏发育缺陷以及第二生心区和心脏神经嵴前体细胞的迁移分化是否异常。
方法：取胚龄10-13 d的Cx43基因敲除纯合(Cx43-/-)小鼠和Cx43野生型(Cx43+/+)小鼠胚胎石蜡包埋连续切片，进行免疫组织化学和免疫荧光显色以及心脏的三维重建。
结果与结论：① Cx43基因敲除后的小鼠在胚龄10-11 d，Isl1阳性第二生心区细胞仍由前肠腹侧经弓动脉延续至心包腔背侧壁，以及经鳃弓核心间充质、心包腔背侧壁延续至流出道远端；至胚龄13 d，升主动脉及肺动脉干形成后，其管壁以及心室左、右流出道壁均可见Isl1阳性细胞的分布，但Isl1阳性细胞数量明显减少(P < 0.01)；② Cx43基因敲除后小鼠在胚龄10-11 d，Ap2α阳性神经嵴细胞仍可见于弓动脉壁以及动脉囊背侧与腹侧壁，但神经嵴细胞数量少于野生型小鼠胚胎(P < 0.01)；③结果说明，Cx43基因敲除后第二生心区Isl1阳性细胞和Ap2α阳性神经嵴细胞的迁移路径和分布模式未发生异常，只是表现为这两种细胞迁移数量的减少，由此提示除心脏神经嵴来源细胞外，第二生心区前体细胞数量的减少可能也与Cx43基因缺失后流出道的畸形发生相关。
https://orcid.org/0000-0003-1815-4369(李行)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 基因, 胚胎, 神经嵴, 畸形, 实验, 鼠, 心脏

Abstract: BACKGROUND: Cx43 plays an important role in human congenital heart disease. However, there is still no consistent conclusion about the formation mechanism of cardiac malformation in Cx43 knockout mouse embryos.
OBJECTIVE: To investigate the cardiac development defects and the migration and differentiation of progenitor cells of the second heart field and cardiac neural crest in Cx43 knockout mouse embryo.
METHODS: Serial sections of Cx43 gene knockout homozygous (Cx43-/-) mouse and Cx43 wild-type (Cx43+/+) mouse embryos from embryonic day (ED) 10 to ED13 were made for immunohistochemical and immunofluorescent staining, and three-dimensional reconstruction of the heart.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In Cx43 gene knockout mouse embryos at ED10-ED11, Isl1 positive second heart field cells in the ventral mesenchyme of the foregut extended through the area between the bilateral arch arteries to the dorsal wall of pericardial cavity. Meanwhile, Isl1 positive cells in the core mesenchyme of the branchial arches were continuous with those in the dorsal wall of pericardial cavity and the distal wall of the outflow tract. At ED13, the distribution of Isl1 positive cells was observed in the wall of the ascending aorta and pulmonary trunk as well as the wall of the left and right outflow tracts of the septated ventricles. However, compared with wild-type mouse embryos, fewer Isl1 positive second heart field cells were found in Cx43 gene knockout mouse embryos (P < 0.01). (2) During ED10 to ED11, Ap2α positive neural crest cells were still found in the wall of the arch artery and the dorsal and ventral walls of the aortic sac in Cx43 gene knockout mouse embryos, but the number of neural crest cells was less than that of wild-type mouse embryos (P < 0.01). (3) These results indicate that the migration path and distribution pattern of Isl1 positive second heart field cells and Ap2α positive cardiac neural crest cells are similar between the Cx43 gene knockout and wild-type mouse embryos, but the number of two kinds of migrating cells is reduced after Cx43 gene knockout. This suggests that in addition to cardiac neural crest derived cells, the decrease of second heart field progenitor cells might be involved in the formation of outflow tract malformations in Cx43 knockout mouse embryos.

Key words: stem cell, gene, embryo, neural crest, malformation, experiment, mouse, heart

中图分类号:

李行, 景雅, 李云华, 李海荣, 杨艳萍. Cx43敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心脏神经嵴来源间充质细胞减少[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2018-2024.

Li Hang, Jing Ya, Li Yunhua, Li Hairong, Yang Yanping. A downtrend of mesenchymal cells derived from the second heart field and cardiac neural crest in the outflow tract of Cx43 knockout embryonic mouse heart[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(13): 2018-2024.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验选取胚龄10-13 d的 Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎共40只，Cx43+/+小鼠作为对照组共25只，舍去5只未达标准胚胎，其他胚龄10，11，11.5，13 d小鼠各5只全部纳入实验结果进行分析；Cx43-/-小鼠作为实验组共15只，胚龄10，11，13 d各5只。在整个实验过程中小鼠无脱失，全部纳入实验结果进行分析。
2.2 Cx43基因敲除小鼠Isl1阳性细胞的迁移和分布变化小鼠胚龄10 d，心管向右弯曲成襻，可分辨心室、心房和流出道。流出道壁由心肌、内皮及二者之间的心胶质构成。流出道远端与动脉囊相连，动脉囊背侧与前肠腹侧内胚层相邻，两侧与弓动脉相通。Cx43+/+小鼠胚胎前肠腹侧壁内胚层的正中部与两侧相比，表达较强的Isl1，且内胚层正中部的腹侧出现密集的间充质细胞，同样为Isl1强阳性，见图1A，B，连续切片观察这些Isl1阳性间充质细胞经弓动脉之间延伸至心包腔背侧壁，在前肠腹侧正中形成Isl1阳性细胞带，见图1C。鳃弓核心间充质Isl1阳性细胞聚集，并与心包腔背侧壁、流出道远端壁形成两侧的Isl1阳性细胞带，见图1A。相邻切片染色显示流出道远端壁的Isl1阳性区表达较强的α-SMA和较弱的MHC，见图1D，E，提示Isl1阳性细胞正在向心肌细胞分化。前肠腹侧、心包腔背侧壁及流出道远端壁部分Isl1阳性细胞同时表达Cx43，见图1F。

Cx43-/-小鼠未见Cx43表达，进一步确认基因敲除成功，见图2A。与野生型小鼠相比，Cx43基因敲除小鼠胚龄10 d，前肠腹侧内胚层的正中部仍表达Isl1，相邻间充质内也可见Isl1阳性细胞密集分布，见图2B，C；但鳃弓核心间充质的Isl1阳性表达少于野生型小鼠胚胎，见图1A，2D。相邻切片染色显示流出道远端仍表达较强的α-SMA和较弱的MHC，见图2E，F，说明Isl1阳性细胞仍可向心肌细胞分化。

小鼠胚龄11 d，前肠内胚层腹侧Isl1阳性间充质细胞显著增多，形成锥形结构，经两侧弓动脉之间延伸至流出道远端壁，见图3A，该部位为α-SMA和MHC阳性，见图3B，C，即心肌性流出道远端直接与心包腔背侧壁相连续，鳃弓核心间充质的Isl1阳性细胞明显减少，且失去了与心包腔背侧壁的连续性(数据未显示)，即与胚龄10 d不同，至胚龄11 d，第二生心区Isl1阳性细胞主要分布于前肠腹侧间充质与心包腔背侧壁。免疫荧光双染结果显示前肠腹侧Isl1和Cx43双阳性间充质细胞较胚龄10 d增多，见图3D。

Cx43-/-小鼠胚胎11 d，前肠腹侧内胚层正中部仍表达Isl1，由动脉端向静脉端移行，前肠内胚层腹侧的间充质、心包腔背侧壁，见图4A，均可见Isl1阳性细胞，但数量明显少于野生型小鼠胚胎，未能形成典型的锥形结构，见图3A，4A。相邻切片染色显示Isl1阳性的流出道远端可见α-SMA，MHC的表达，见图4B，C，提示流出道远端依然有心肌细胞分化，促使流出道继续增长。

至胚龄11.5 d，前肠腹侧Isl1阳性的锥形结构体积增大，见图5A，B。动脉囊进入心包腔，MHC染色阴性，见图5C，因此成为流出道的非心肌部。锥形结构的尖端Isl1阳性细胞向流出道非心肌部延伸，见图5B，该部位α-SMA阳性，见图5D，MHC阴性说明此处迁入的Isl1阳性细胞不再向心肌细胞分化。

胚龄13 d，心脏各部正在分隔，见图6A。流出道缩短，在Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎均可观察到流出道的非心肌部已分隔为升主动脉和肺动脉干。瓣膜以下的流出道心内膜垫正在融合形成流出道隔，将流出道分隔为左右两部分，即主动脉前庭和肺动脉圆锥。野生型小鼠胚胎升主动脉由肺动脉干右侧经腹侧斜上走行到达其左侧，形成成体心脏升主动脉、肺动脉干正常的解剖位置关系，见图6B-F。两动脉壁均分布有大量Isl1阳性细胞，与气管腹侧Isl1阳性细胞带相延续，见图6G，相邻切片显示α-SMA的强阳性表达，见图6F。瓣膜以下的心室流出道壁也可见Isl1阳性细胞分布，见图6G。而在Cx43-/-小鼠胚胎，连续切片与三维重建显示升主动脉由肺动脉干右侧首先直行离开心包腔，再横向左行形成主动脉弓，见图7A-F，而升主动脉在其直角转折处与肺动脉干直接相通，见图7B，升主动脉与肺动脉干管壁内Isl1阳性细胞数量明显少于野生型小鼠，气管腹侧间充质观察不到Isl1的表达，见图6G，7G，两动脉管壁近内皮侧为α-SMA强阳性，但α-SMA阳性区域少于野生型小鼠，见图6F，7F。在肺动脉圆锥、主动脉前庭Isl1阳性细胞分布与野生型小鼠无显著区别，见图6G，7G，该部位同时表达MHC，见图7H。与野生型小鼠胚胎相比，Cx43基因敲除小鼠胚胎右心室小梁密集，心室腔减小，见图6A，7I。

2.3 Cx43基因敲除小鼠神经嵴阳性细胞的迁移和分布小鼠胚龄10 d，野生型小鼠胚胎Ap2α阳性神经嵴细胞呈鞘状包裹弓动脉壁，一侧延伸至动脉囊腹侧及其与之相连的流出道远端的心胶质内，提示流出道心内膜垫开始形成。另一侧延伸至动脉囊背侧壁开始形成间充质隔，具体可见图8A，B。Cx43-/-小鼠动脉囊腹侧与背侧壁Ap2α阳性细胞明显少于野生型小鼠胚胎，流出道远端心胶质内未观察到Ap2α阳性细胞，见图8C。
胚龄11 d，Ap2α阳性神经嵴细胞继续沿弓动脉壁向流出道的心内膜垫迁移,弓动脉壁周围可见Cx43与Ap2α双阳性细胞，见图8D。Cx43-/-小鼠胚胎神经管两侧Ap2α阳性的间充质细胞迁移至弓动脉壁周围，呈散在分布。在动脉囊背侧、腹侧以及与之相连的流出道心内膜垫远端仅可观察到少量Ap2α阳性细胞，见图8E。至胚龄11.5 d，大量Ap2α阳性分布于弓动脉周围、前肠腹侧Isl1阳性的锥形结构的两侧，见图5B，8F。此期动脉囊成为流出道的非心肌部，该部分并无心内膜垫，因此弓动脉壁周围的Ap2α不再向此处迁移，见图8F。流出道心内膜垫内间充质细胞数量达高峰，这些细胞不表达Ap2α，而是α-SMA强阳性，见图5D，8F。

2.4 Cx43基因敲除小鼠第二生心区和心脏神经嵴细胞数量减少对胚龄10-13 d的Cx43-/-小鼠和Cx43+/+小鼠胚胎心脏动脉端的第二生心区和神经嵴细胞进行计数，对计数结果进行统计学分析，显示胚龄10，11，13 d的Cx43基因敲除小鼠进入胚胎心脏Isl1标记的第二生心区前体细胞数量少于野生型小鼠(P < 0.01)。胚龄10，11 d的Cx43基因敲除小鼠Ap2α标记的迁移的心脏神经嵴细胞数量少于野生型小鼠(P < 0.01)，见图9。

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引言

缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)广泛表达于心房和心室工作心肌、心室传导系统和心脏神经嵴细胞[1-5]，在心电传导、流出道正常发育和调节心脏神经嵴细胞的迁移行为中起着重要作用。Cx43基因敲除小鼠表现为心脏成襻延迟[3]、流出道梗阻及主动脉弓离断等[3，6]。已有研究证实敲除Cx43基因后p38 MAPK活性下调，FGF1表达增加，促进心肌细胞增生[7]，从而导致流出道梗阻。但有学者认为Cx43基因敲除小鼠死于右心室流出道梗阻也可由于心脏神经嵴细胞迁移异常所导致[6]。但特异性敲除神经嵴的Cx43基因，胚胎心脏并未发生形态异常[8]。因此，Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道畸形的发生机制有待进一步研究。
心脏神经嵴即耳板中部到第3体节水平的神经嵴，在参与心脏发育的过程中，需要Cx43缝隙连接的作用[9-10]。如上所述，特异性敲除神经嵴的Cx43基因，胚胎心脏并未发生形态异常，此结果提示可能是敲除Cx43后，其他因素影响了心脏神经嵴细胞的迁移从而导致流出道畸形的发生。另有研究揭示Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道畸形是由于流出道心肌分化异常所导致[11]。大量研究表明，流出道心肌来源于第二生心区，第二生心区的异常发育可引发流出道心肌分化异常[12-14]；另一方面，第二生心区可通过多种信号通路调节心脏神经嵴 [15-19]，例如抑制第二生心区中Notch信号，可导致心脏神经嵴细胞向流出道迁移发生异常[15]。由此实验推测，第二生心区的异常发育可能是Cx43基因敲除小鼠胚胎发生心脏流出道畸形的一个原因。但目前，Cx43基因敲除小鼠胚胎第二生心区是否异常尚未见报道。
实验用免疫组织化学染色、荧光双染及三维重建的方法观察Cx43基因敲除后流出道的畸形与Isl1阳性第二生心区前体细胞和Ap2α阳性神经嵴细胞的迁移路径、分布模式，以确认Cx43基因敲除小鼠胚胎第二生心区发育是否异常，为进一步探讨Cx43基因敲除导致流出道发育异常的发生机制提供形态学依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点于2018年4月至2019年12月在山西医科大学组织胚胎学实验室完成。
1.3 材料 Cx43转基因C57BL6小鼠共20只，体质量28-35 g。收集胚龄10-13 d Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎40只，每个胚龄胚胎收集5只，所使用小鼠均来自山西医科大学，动物许可证号：SCXK(晋)2015-0001。所有动物操作均符合山西医科大学伦理委员会对动物实验的要求和规定。
1.4 实验方法
1.4.1 石蜡切片制备 10-13 d小鼠胚胎用Leica切片机(RM2235，德国)制作7 μm 厚连续切片，连续切片每隔5片取1片做苏木精-伊红染色，观察形态学特征，其他用于免疫组织化学染色和荧光双染检测。
1.4.2 免疫组织化学染色选用SABC法染色[20]。切片脱蜡、水化后用体积分数3%过氧化氢和5%BSA封闭液(武汉博士德生物工程有限公司)各处理30 min，降低内源性过氧化物酶活性和非特异性背景颜色。预处理后切片用抗Isl1抗体(1∶700，Abclonal公司)，抗Ap2α单克隆抗体(1∶100，Genetex公司)，抗Cx43抗体(1∶700，Abcam公司)，抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(1∶1 000，武汉博士德生物工程有限公司)，抗心肌肌球蛋白重链单克隆抗体(MHC，1∶1 000，upstate公司)，4 ℃过夜孵育。即用型SABC-POD小鼠/兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG，SABC试剂各常温下孵育 30 min。DAB显色，常规脱水、透明及封固。全自动扫描显微镜及照相系统(BX53，日本奥林帕斯公司)下摄片，观察各细胞分布规律并对Isl1标记第二生心区细胞或Ap2α标记的心脏神经嵴细胞计数，每个胚龄胚胎选取3例，每例胚胎选取动脉端区域免疫组织化学染色后的切片，每3片选出1片，共选3片，于200倍镜下拍摄，再用Image J软件分别对每张图片中的Isl1阳性或Ap2α阳性细胞计数(胞核着棕黄色为阳性)；每列胚胎的3片计数结果取均值作为该胚胎的阳性细胞数。
1.4.3 免疫荧光双染检测切片脱蜡、水化，体积分数5%BSA封闭，特异标记兔抗Isl1抗体(1∶100，Abclonal公司)和鼠抗Cx43单克隆抗体 (1∶200，Santa cruz公司)混合，兔抗Ap2α单克隆抗体(1∶50，Cell Signal公司)和鼠抗Cx43单克隆抗体 (1∶200，Santa Cruz公司)混合，4 ℃孵育过夜后，双染二抗均为羊抗小鼠IgG-FITC(1∶150，武汉博士德生物工程有限公司)和羊抗兔IgG-Cy3(1∶100，武汉博士德生物工程有限公司) 混合液，电热恒温箱(ZXDP-B2120，上海智诚公司)37 ℃孵育30 min，4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI，碧云天生物技术研究所)室温下核复染10 min，甘油缓冲液封固，全自动扫描显微镜及照相系统照像，Image J软件将同一位置所摄两张双染抗体图片以及DIC图片进行合成[20]，镜下观察细胞分布规律。
1.4.4 三维重建选择胚龄13 d 的Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎免疫组织化学染色和苏木精-伊红染色后的连续切片图，收集所有图片后上传Amira 5.2.0软件处理生成三维立体结构后观察主肺动脉位置变化[21]。
1.5 主要观察指标胚龄10-13 d的转基因Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎心脏切片免疫组织化学染色形态。
1.6 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，数据用x±s表示，多组间数据差异比较单因素方差分析，P < 0.05为差异显著性意义。

讨论

3.1 Cx43基因敲除小鼠胚胎第二生心区与心脏内Isl1阳性细胞减少第二生心区参与流出道的发育且受多种信号通路的调节。既然Cx43基因小鼠胚胎心脏畸形限于右心室和流出道的交界处[3，11]，而右心室与流出道的发育与第二生心区密切相关[12-13，20]，因此探讨Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏畸形发生原因就需确认第二生心区是否异常。大量研究以及该课题组的实验结果均证实小鼠胚胎第二生心区分布于前肠腹侧间充质、鳃弓核心间充质以及心包腔背侧壁，所含前体细胞部分向心管动脉端迁移和分化，形成流出道及右心室的心肌细胞[12-13，20]，以及主动脉、肺动脉干根部管壁的平滑肌细
胞[22-23]。此过程受多种信号通路的调节，包括Nkx2.5，Shh，FGF和BMP等[24-26]。但Cx43是否也参与调节第二生心区尚未阐明。
LIM同源域转录因子Islet-1(Isl1)是第二生心区心肌前体细胞发育和迁移的可靠标记物[23]，Cx43基因敲除小鼠胚胎Isl1标记的第二生心区阳性细胞减少。实验通过观察Isl1在第二生心区和心脏内的表达变化规律，探讨Cx43基因缺失对小鼠胚胎第二生心区分布以及心脏发育的影响。为此首先需确认Isl1阳性细胞是否表达Cx43。免疫荧光双染结果证实前肠腹侧、心包腔背侧壁与流出道远端的部分Isl1阳性细胞同时表达Cx43，说明Cx43参与调控Isl1阳性第二生心区细胞的生长发育。继而观察Cx43基因缺失后小鼠胚胎第二生心区分布以及心脏发育的变化，结果显示Cx43基因敲除后的小鼠胚胎Isl1阳性第二生心区细胞仍然分布于前肠腹侧、心包腔背侧壁及鳃弓核心间充质，并延续至流出道以及主动脉、肺动脉干管壁。由此可见，Cx43缺失时Isl1阳性第二生心区细胞的迁移路径以及分布模式并未发生异常，但第二生心区以及动脉管壁的Isl1阳性细胞数量明显少于野生型小鼠，同时主、肺动脉管壁的α-SMA阳性平滑肌细胞的分化也减少。说明Cx43基因缺失后Isl1阳性第二生心区细胞向胚胎心脏的迁移减少，分布模式并无异常。而Cx43基因缺失导致进入胚胎心脏的第二生心区前体细胞数量减少的原因尚不确定，实验推测原因可能是由于这些前体细胞增殖减少。已知第二生心区前体细胞的增殖可通过Sonic hedgehog(Shh)，WNT，FGF和BMP等转录因子来调节[25，27]。但有关Cx43是否参与这些信号通路对Isl1阳性第二生心区前体细胞的调控尚未明确，作者将在后续工作中进一步研究。
3.2 Cx43基因敲除小鼠Ap2α阳性神经嵴细胞向流出道的迁移减少研究证实心脏神经嵴细胞具有特定的迁移模式和定位，可迁移到弓动脉壁，部分细胞沿着弓动脉壁经动脉囊迁移进入流出道的心胶质内，部分细胞在动脉囊背侧壁聚集，分别参与形成流出道心内膜垫和主肺动脉隔[14，17，28-29]。迁移的神经嵴细胞表达Cx43[30]。Ap2α是Helix-span-Helix转录因子家族的重要成员，可用于特异性标记迁移中的神经嵴细胞[24]。因此实验观察Ap2α阳性神经嵴细胞的迁移与分布模式，结果显示：Cx43基因敲除后小鼠胚胎仍可见于弓动脉壁以及动脉囊背侧与腹侧壁，但其数量少于野生型小鼠胚胎。说明Cx43基因敲除后Ap2α阳性神经嵴细胞的迁移路径和分布模式未发生异常，只是表现为迁移细胞数量的减少，与以往研究结果一致。有学者证实进入胚胎心脏流出道的神经嵴细胞数量的减少是由于敲除Cx43基因后，vinculin表达下调，心脏神经嵴细胞胞质内的部分张力丝不再能锚定到细胞连接，从而使细胞迁移能力下降[31]。实验还观察到Cx43基因敲除后主、肺动脉可由流出道分隔形成，流出道心内膜垫可形成并融合分隔动脉瓣膜以下的流出道。即流出道的分隔在Cx43基因敲除后仍可进行。由于心内膜垫内的间充质细胞部分来源于神经嵴，部分来源于心内膜[10]，实验推测Cx43基因缺失时，尽管心内膜垫内神经嵴来源细胞减少，但仍存在大量心内膜来源间充质细胞，这些细胞可促使心内膜垫体积不断增大并融合，从而保证流出道的分隔，但确切机制尚需进一步证实。
3.3 小结总之，以往研究多关注心室心肌缺乏Cx43基因后的异常增生、神经嵴来源细胞缺乏Cx43基因后的分布异常
等[7-8]，而实验结果表明Cx43基因缺失不仅导致神经嵴来源细胞减少，第二生心区的Isl1阳性细胞在胚胎心脏流出道的分布同样减少。研究证实第二生心区和心脏神经嵴这两种细胞群可互相调节 [16-19]，因此Cx43基因敲除小鼠流出道发育异常可能与两者之间的相互影响有关。实验结果为特异性敲除神经嵴的Cx43基因，胚胎心脏并未发生形态异常提供了可能的解释。然而该研究仅对Cx43基因敲除后的表型进行研究，但基因敲除后导致流出道的畸形的相关分子机制以及信号通路还需进一步探讨，如Cx43是否参与第二生心区前体细胞的调控，Cx43缺乏情况下第二生心区细胞和心脏神经嵴细胞是否存在信号关系共同作用于流出道导致其畸形，从而为Cx43缺乏引起的先天性心脏病提供更多依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Cx43敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心脏神经嵴来源间充质细胞减少

A downtrend of mesenchymal cells derived from the second heart field and cardiac neural crest in the outflow tract of Cx43 knockout embryonic mouse heart

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