2.1  脂肪干细胞的形态及鉴定结果  体外培养至第 3代的脂肪干细胞呈现出典型的梭形结构。经流式细胞分析鉴定后发现间充质细胞表面标志物CD105表达阳性，而造血细胞表面标志物CD34和CD45表达阴性，说明培养至第3代的脂肪干细胞具有干细胞特性，是一群均一的未分化干细胞，见图1。加入成骨诱导液培养2周后，显微镜下可见细胞表面有小片状钙结节形成，茜素红染色阳性，说明脂肪干细胞有向骨细胞分化的能力。加入成脂诱导液培养2周后，细胞间质中出现折光性好的脂滴，油红O染色显示脂质变红，表明脂肪干细胞有向脂肪细胞分化的能力，见图2。

2.2  Western blot检测低氧培养条件下PI3K/Akt通路的激活  低氧培养24 h时，Western blot检测发现p-Akt的表达明显高于常氧组，加入LY294002后，p-Akt的表达受到明显抑制，说明LY294002可以有效抑制PI3K/Akt通路的激活，见图3。

2.3  CCK-8检测细胞增殖  在培养第1天时3组之间差异无显著性意义，第2天时低氧组的细胞增殖率明显高于常氧组、低氧+LY294002组(P < 0.05)，常氧组、低氧+LY294002组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，而培养第3天时，3组之间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，说明加入LY294002后抑制了低氧诱导的脂肪干细胞增殖，见图4。

2.4  qRT-PCR检测内皮细胞特异性标志物的表达  经过低氧培养后细胞vWF、flt-1及flk-1的表达明显高于常氧组(P < 0.05)，低氧+LY294002组vWF、flt-1及flk-1的表达则明显低于低氧组(P < 0.05)，且与常氧组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.5  抗CD31免疫荧光染色结果  免疫荧光染色CD31抗原，显微镜下观察可见CD31抗原表达于细胞膜表面，低氧组CD31阳性细胞表达率远远高于常氧组(P < 0.05)，低氧+ LY294002组CD31阳性细胞表达率低于低氧组(P < 0.05)，但仍高于常氧组(P < 0.05)，见图6。

脂肪干细胞是从脂肪组织中分离提取得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，已被证明移植后可以通过分化为内皮细胞及分泌多种细胞因子促进缺血组织的血管新生，从而达到治疗疾病的目的，如心肌缺血、脑卒中、糖尿病引起的慢性创面等^[1-3]。由此可见，植入体内的脂肪干细胞活性及功能直接决定了其治疗效果。缺血组织中氧体积分数明显低于正常组织，必然会直接影响植入体内的脂肪干细胞的生物学行为。大量研究证明体外低氧培养可以促进脂肪干细胞增殖及向内皮细胞分化^[4-5]，且在相同低氧培养条件下，脂肪干细胞呈现出比骨髓间充质干细胞更强的增殖能力，相同诱导条件下更多更快地分化为内皮细胞，说明脂肪干细胞具有应用于血管化治疗的巨大优势^[6]。但是，目前尚不明确低氧通过何种作用机制调节移植后的脂肪干细胞生物学行为。PI3K/Akt是一个保守的信号转导酶家族，广泛参与细胞增殖、分化、旁分泌功能和血管生成等多种过程^[7-9]。该研究拟观察低氧培养环境对脂肪干细胞增殖及向内皮细胞分化的影响，并探讨PI3K/Akt通路在此过程中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年7月至2019年2月在上海健康医学院中心实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  3周龄雄性Wistar大鼠6只，SPF级，体质量45-55 g，由上海实验动物研究中心提供，动物使用许可证号：沪ICP备09084966号。实验过程中对动物处置符合动物学伦理学标准。

1.3.2  实验试剂和仪器  胎牛血清(Gibco公司)；DMEM及0.25%胰酶(美国Invitrogen公司)；EDTA、青霉素、链霉素、成骨及成脂诱导试剂盒(上海代轩生物公司)；TRIZOL、反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；抗CD34、抗CD45及抗CD105流式抗体(美国BD公司)；抗CD31及抗p-Akt抗体(美国Abcam公司)；CCK-8试剂、PI3K/Akt通路抑制剂LY294002(美国Sigma-Aldrich公司)；光学显微镜、流式细胞仪、全自动酶标仪(BIO-RAD550)及Real-time PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  脂肪干细胞的培养  无菌条件下取3周龄雄性Wistar大鼠腹股沟脂肪组织，PBS洗涤3遍，剪成颗粒状，加入2%Ⅳ型胶原酶于摇床上消化30 min，离心(1 500 r/min，3 min)后弃去上层油脂及上清液，加入适量低糖DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素)重悬细胞后接种于培养皿中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂、体积分数为20%O₂培养箱中培养，48 h后首次换液，以后每3 d换液1次并在倒置显微镜下观察细胞生长状态。待细胞融合至90%时，使用2%胰酶消化细胞行传代培养，实验中使用第3代脂肪干细胞进行下一步实验。

1.4.2  脂肪干细胞的表面标志物鉴定  第3代脂肪干细胞长满至90%时，吸去培养基，清洗、消化后收集细胞，转入15 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS重悬细胞沉淀，计数后分装入1.5 mL EP管中，分别使用抗CD34、CD45及CD105的流式抗体孵育细胞，未加入抗体的细胞作为空白对照，避光冰浴孵育30 min；加入 500 μL PBS洗掉未结合抗体，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS充分重悬细胞，制备成单细胞悬液上机行流式检测。

1.4.3  脂肪干细胞的成骨、成脂诱导分化  根据成骨、成脂分化诱导试剂盒说明书介绍的方法，消化收集第3代脂肪干细胞接种于6孔板中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、体积分数为20%O₂培养箱中培养，24 h后换液，分别加入成骨诱导液和成脂诱导液进行诱导分化培养，每3 d换液1次，2周后去除培养基，PBS漂洗后分别进行茜素红染色和油红O染色，在倒置相差显微镜下观察染色结果并拍照。

1.4.4  实验细胞分组  将第3代脂肪干细胞分为常氧组、低氧组、低氧+LY294002组。收集第3代脂肪干细胞，计数接种后放于37 ℃、体积分数为5%CO₂、体积分数为20%O₂培养箱中培养24 h，然后低氧组转移至37 ℃、体积分数为5%CO₂、体积分数为2%O₂培养箱中进行培养；常氧组继续在体积分数为20%O₂培养箱中培养；低氧+LY294002组在低氧培养环境下的细胞培养基中加入终浓度为       25 mmol/L的LY294002，以观察抑制PI3K/Akt通路后脂肪干细胞的增殖及向内皮细胞分化情况。

1.4.5  Western blot检测低氧培养条件下PI3K/Akt通路的激活  低氧培养24 h后收集细胞，采用Western blot法检测各组细胞的磷酸化Akt(p-Akt)表达，以GAPDH作为参照物。p-Akt的表达即表示PI3K/Akt通路得到激活^[10]。

1.4.6  CCK-8检测脂肪干细胞增殖情况  将第3代脂肪干细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔板，按实验分组分别进行常氧和低氧培养，于第1-3天每天同一时间点行CCK-8法检测细胞增殖情况，每次取3个复孔，以加入单纯完全培养基的3个复孔为空白对照，每孔加入CCK-8 10 μL，培养箱孵育3 h，酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度值。以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制生长曲线。

1.4.7  脂肪干细胞向内皮细胞分化  第3代脂肪干细胞制备成单细胞悬液后，分别以每孔2×10⁵的数量接种于6孔板中，按实验分组分别进行常氧和低氧培养24 h，每孔加入  1 mL血管内皮细胞诱导培养基(90%低糖DMEM+体积分数为10%胎牛血清+50 μg/L血管内皮生长因子165+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)，隔天换液1次，诱导培养10 d。

1.4.8  qRT-PCR检测内皮细胞相关基因的表达  收集上述各组细胞，提取RNA，反转录为cDNA并扩增，运用qRT-PCR技术检测内皮细胞相关基因vWF、flt-1、flk-1的表达。在GeneBank中查找出大鼠基因序列，使用Primer 5进行目标基因的引物设计，见表1，由上海生工生物科技有限公司合成。以GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法，以常氧组的基因表达作为标准，计算其余两组各基因的相对表达量。

1.4.9  抗CD31免疫荧光染色  收集上述各组细胞，去除培养液，PBS漂洗2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，加入500 μL 3% BSA封闭非特异性抗原，30 min后去掉封闭液，加入1∶50的CD31抗大鼠抗体，4 ℃孵育过夜，吸弃一抗，PBS清洗3次，加入1∶50的二抗，避光孵育1 h，吸弃二抗，PBS清洗3次，加入500 μL DAPI工作液染色细胞核15 min，弃去染色液，PBS清洗后于倒置相差显微镜下观察、拍照。

1.5  主要观察指标  ①第3代脂肪干细胞的形态及表面标志物CD34、CD45及CD105的表达；②第3代脂肪干细胞的成骨及成脂分化能力；③低氧培养条件下PI3K/Akt通路的激活情况；④低氧培养条件下脂肪干细胞的增殖和向内皮细胞分化情况。

1.6  统计学分析  采用SPSS 18.0统计软件分析，数据以 x(_)±s表示，进行正态性、方差齐性检验，两样本均数比较采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

脂肪干细胞是目前研究最广泛的成体干细胞，其来源广泛，分离容易，人体每克脂肪组织可以得到10⁵-10⁶个脂肪干细胞^[11]。脂肪干细胞不仅可以进行自我更新，还具有多向分化潜能，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、内皮细胞等多种细胞^[12-15]。因此，从临床应用方面来说，脂肪组织来源的干细胞更加具有应用前景。脂肪中的氧体积分数一般低于3%，因此脂肪中的干细胞在生理条件下就处于一个相对缺氧环境^[16]。在体外培养过程中氧体积分数为1%-5%时即可为脂肪干细胞的增殖和功能提供足够的刺激，同时维持细胞形态和多向分化能力不变，因此可以认为低氧环境可以更好地为干细胞特性的维持提供信号传导^[16]。缺血组织中的低氧环境如何影响移植的脂肪干细胞的功能，目前仍不清楚。为了充分利用干细胞的功能，有必要深入认识低氧对干细胞的影响及其作用机制。

低氧已被证明是一种强大的细胞信号分子，直接影响着细胞的增殖、分化及基因表达^[17-20]。该实验中，通过CCK-8法绘制脂肪干细胞的生长曲线，结果发现低氧环境可以明显促进脂肪干细胞的增殖，研究使用最经典的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子作为内皮细胞诱导液^[21-22]，经过低氧培养的脂肪干细胞更多地分化为内皮细胞，表达内皮细胞特异性基因vWF、flt-1、flk-1，并表达特异性表面抗原CD31，这些结果与已发表的研究结果是一致的，说明低氧环境是一种有效的细胞增殖和向内皮细胞分化的刺激因子^[4-5，23]。

低氧环境可以激活低氧诱导因子1α，进一步刺激血管内皮细胞因子和成纤维细胞因子的表达，形成一个正反馈调节，从而促进脂肪干细胞的增殖及向内皮细胞分化，加入LY294002后，此促进作用受到抑制，说明PI3K/Akt通路参与了这些细胞因子引起的细胞生物学活动^[5，24]。此外，SHENG等^[8]的研究结果表明加入LY294002抑制PI3K/Akt通路激活后，使得低氧诱导的骨髓间充质干细胞增殖及旁分泌能力受到抑制。此外，PI3K/Akt通路已被证明参与多种细胞的分化，例如胰腺导管细胞分化为胰岛素生成细  胞^[25]、骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞^[26]、心肌干细胞分化为内皮细胞等^[27]，阻断此通路后细胞的分化过程也受到抑制。过表达Akt基因的骨髓间充质干细胞移植入大鼠缺血心肌后，可以通过减少心肌内炎症、胶原沉积和心肌细胞肥大，抑制心肌重塑，使心肌收缩和舒张功能完全恢复正常，相比较于过表达lacZ的骨髓间充质干细胞，相同数量的过表达Akt基因的骨髓间充质干细胞可以恢复4倍大的心肌容积^[28]。另外，有研究表明miR-181b-5p也可以通过上调PI3K/Akt的表达保护缺血再灌注引起的心肌损伤^[29]。以上这些研究结果均说明PI3K/Akt通路在细胞增殖、细胞分化及稳定干细胞作用中发挥重要作用。在该研究中，细胞经过低氧培养后p-Akt呈现高表达，说明低氧激活了PI3K/Akt通路，加入LY294002后p-Akt的表达受到抑制，表明LY294002可以有效抑制PI3K/Akt通路的传导，低氧诱导的脂肪干细胞增殖和内皮细胞分化能力急剧下降。PI3K/Akt信号通路促进细胞增殖可能与其下游细胞因子磷酸化Bcl-2家族成员BAD或caspase-9前体，使这些蛋白失活，从而抑制细胞凋亡，促进细胞存活^[30-31]。

综上所述，低氧培养不仅可以刺激脂肪干细胞增殖，还可以促进脂肪干细胞向内皮细胞分化，PI3K/Akt通路在此过程中发挥重要调节作用。这些研究结果有助于加深对干细胞移植治疗作用机制的认识，从而更好地发挥干细胞在再生医学中的应用潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

PI3K/Akt信号通路：Akt是PI3K/Akt信号转导通路的核心，其分子质量约为60 kD，是原癌基因c-akt表达编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。外源性抑制剂LY294002或wortmannin均可负向调节PI3K/Akt信号通路，导致第二信使PIP3逆行转化为PIP2，阻断其调节作用。

低氧：氧体积分数是机体微环境的重要组成部分，直接影响着细胞的成活和生物学行为。在体外培养过程中氧体积分数为1%-5%时即可为脂肪干细胞的增殖和功能提供足够的刺激，同时维持细胞形态和多向分化能力不变，因此可以认为低氧环境可以更好地为干细胞特性的维持提供信号传导。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

研究表明PI3K/Akt通路除了参与低氧条件下脂肪干细胞的增殖和分化外，还参与脂肪干细胞的迁移。低氧条件可以引起受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶的磷酸化，这些激酶的活化激活了PI3K/Akt通路，使得通路下游的转录因子NF-κB和Elk1磷酸化，引起脂肪干细胞迁移相关基因的改变。此外，PI3K/Akt通路还参与了低氧条件下干细胞的旁分泌过程。低氧能够显著上调血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子的表达，低氧预处理的脂肪干细胞具有更强的组织修复能力，推测是因为低氧促进脂肪干细胞大量分泌血管内皮生长因子，进而发挥了促进组织再生的作用。使用特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt通路后，低氧培养条件下干细胞分泌血管内皮生长因子的量则远远低于未阻断组。这些结果说明，PI3K/Akt通路在低氧诱导的干细胞生物学行为中发挥重要作用，可作为干预靶点以更好地发挥干细胞的功能。 

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程