2.1  尿源性干细胞的生长形态  在接种第3天，单个及散在的细胞呈贴壁生长状态，细胞形态为椭圆形；在接种第5天，能看到细胞分裂生长，细胞开始形成集落，细胞形态如米粒状，细胞核较大；在接种第9天，细胞分裂迅速，细胞形态逐渐向长梭形变化，细胞数量增加；在接种第12天，细胞达80%-90%融合，然后将24孔板中的细胞消化传代，转移至10 cm培养皿中继续培养，细胞开始扩增，见图1。

2.2  尿源性干细胞表型  尿源性干细胞呈现高表达间充质干细胞表面标记物CD29(98.11%)和CD90(95.74%)，极低表达造血干细胞标志物CD34(1.31%)和CD45(0.32%)，证明尿源性干细胞保持了间充质干细胞的活性，见图2。

2.3  尿源性干细胞的生长曲线  尿源性干细胞呈现对数生长，生长曲线大致呈S型，分为潜伏期、对数生长期、平台期和衰亡期，见图3。第0-1天为潜伏期，细胞生长较缓慢，细胞处于贴壁生长阶段，细胞分裂和增殖不显著；第2-7天为对数生长期，细胞分裂迅速，增殖显著；第8-9天为平台期，细胞生长较前缓慢，增殖速度下降，第10-12天进入衰亡期，细胞分裂减少，细胞数量稍有下降。

2.4  尿源性干细胞向尿路上皮细胞诱导分化结果  尿源性干细胞经尿路上皮诱导专用培养基诱导分化14 d后，倒置显微镜下可见细胞形态变成“鹅卵石”样，见图4A，B。免疫细胞化学染色可见诱导组Cytokeratin 20表达阳性(++)和Uroplakin Ⅲ蛋白表达强阳性(+++)，见图4C，D。荧光定量PCR结果显示诱导组尿路上皮细胞特异性基因Cytokeratin 7、Cytokeratin 20和Uroplakin Ⅲ表达显著高于对照组(P < 0.001)，见图5A。Western blot结果显示诱导组Cytokeratin 7、Cytokeratin 20和Uroplakin Ⅲ蛋白表达水平显著高于对照组，见图5B。以上证实尿源性干细胞经体外诱导后可以表达尿路上皮细胞特异性表型蛋白，初步向尿路上皮细胞诱导分化成功。

2.5  尿源性干细胞向平滑肌细胞诱导分化结果  尿源性干细胞经平滑肌细胞诱导专用培养基诱导分化14 d后，倒置显微镜下可见细胞形态变成“纺锤”样，见图6A，B。免疫细胞荧光染色结果显示诱导组α-SMA表达阳性(++)和SM22蛋白表达阳性(++)，见图6C，D。荧光定量PCR结果显示诱导组平滑肌细胞特异性基因α-SMA和SM22表达显著高于对照组(P < 0.001)，见图7A。Western blot结果显示诱导组α-SMA和SM22蛋白表达水平显著高于对照组，见图7B。以上证实尿源性干细胞经体外诱导后可以表达平滑肌细胞特异性表型蛋白，初步向平滑肌细胞诱导分化成功。

成体干细胞是存在于已分化组织中的多能干细胞，主要包括骨髓间充质干细胞、肌肉源性干细胞、脂肪源性干细胞等^[1]。近年来研究发现一种从尿液中获取的成体干细胞，称为尿源性干细胞。目前关于尿源性干细胞的来源尚未明确，但是其多向分化能力得到充分证实^[2-5]。有研究应用人尿源性干细胞体外构建组织工程化组织，然后移植到裸鼠皮下，证实能够形成尿路组织结构，为尿路修复重建提供了新的种子细胞^[6-7]。另有研究表明，从储存24 h尿液中获得的尿源性干细胞仍能保持干细胞功能^[8]。尿源性干细胞具有高度增殖能力、多向分化潜能、取材方便、安全无创等优点，在组织工程学领域逐渐受到重视。该研究主要探讨人源性尿源性干细胞体外分离获取方法，以及体外向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化的可行性。此项研究的创新性包括以下2点：第一，优化了分离提取过程，单克隆尿源性干细胞经培养后可以产生大量细胞，提高了细胞获取率；第二，应用2种专用培养基，体外诱导尿源性干细胞分别向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学观察实验。

1.2  时间及地点  于2016年9月至2017年10月在济宁医学院协同创新中心实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验试剂  KSFM培养基、EFM培养基、胎牛血清、青链霉素(Gibco公司)；表皮生长因子和转化生长因子β1(Sigma公司)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术公司)；流式细胞抗体CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC和CD90-FITC(BD公司)；α-SMA、SM22、Cytokeratin 7、Cytokeratin 20和uroplakin Ⅲ抗体(Abcam公司)。

1.3.2  尿源性干细胞专用培养基配制  KSFM培养基和EFM培养基按照1∶1的比例混合，然后加入体积分数为5%胎牛血清，最后加入1%青链霉素。

1.3.3  尿路上皮诱导分化专用培养基配制  KSFM培养基和EFM培养基按照1∶1比例混合，然后加入体积分数为2%胎牛血清、30 μg/L表皮生长因子，最后加入1%青链霉素。

1.3.4  平滑肌细胞诱导分化专用培养基配制  KSFM培养基和EFM培养基按照1∶1的比例混合，然后加入体积分数为5%胎牛血清、2.5 μg/L转化生长因子β1，最后加入1%青链霉素。

1.4  实验方法

1.4.1  尿源性干细胞体外分离实验  经由济宁医学院伦理审查委员会批准，收集健康成人志愿者(22-35岁)尿液标本，所有志愿者均签署知情同意书。在无菌条件下，采用一次性无菌容器收集健康成年志愿者新鲜中段尿液   200 mL，用50 mL离心管分装成4管，400×g离心10 min，吸弃上清，加入含1%青链霉素的PBS约20 mL，混匀洗涤，重复上述离心后弃去上清，最后剩余的沉淀物用5 mL尿源性干细胞专用培养基重悬，接种于24孔板，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱静置培养3 d后观察细胞生长情况，更换培养基，弃去未贴壁细胞，以后每隔3 d换液1次，待原代培养的尿源性干细胞达80%-90%融合时，用0.25%胰酶消化，以1∶2比例传代接种，倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.4.2  CCK-8法检测细胞增殖情况  取第3代尿源性干细胞专用培养基孵育24 h，根据CCK-8试剂盒说明书，将尿源性干细胞以1.0×10⁴/孔接种于96孔板，置于孵箱内培养，于第0-12天分别加入CCK-8试剂，应用酶标仪检测450 nm波长吸光度值。以吸光度值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。

1.4.3  流式细胞仪检测细胞表型  第3代尿源性干细胞经0.25%胰酶消化、离心，细胞沉淀用1%PBS重悬，制备细胞浓度为1×10⁸ L^-1的单细胞悬液，分别加入CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC和CD90-FITC单克隆抗体，室温下避光孵育30 min，PBS洗涤细胞1遍，离心，弃上清，再加入PBS重悬细胞，然后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗2遍，通过流式细胞仪检测细胞表型。

1.4.4  尿源性干细胞向尿路上皮细胞诱导分化  取第4代尿源性干细胞进行体外诱导，以细胞密度1.2×10⁶接种于6孔板，培养1 d后开始加入尿路上皮诱导分化专用培养基，每2 d换液1次，在倒置显微镜下观察细胞形态变化。对照组继续应用尿源性干细胞专用培养基培养。诱导分化第14天，对诱导组和对照组进行相关鉴定检测。

1.4.5  尿源性干细胞向平滑肌细胞诱导分化  取第4代尿源性干细胞进行体外诱导，以细胞密度1.2×10⁶接种于6孔板，培养1 d后开始加入平滑肌细胞诱导分化专用培养基，每2 d换液1次，在倒置显微镜下观察细胞形态变化。对照组继续应用尿源性干细胞专用培养基培养。诱导分化第14天，对诱导组和对照组进行相关鉴定检测。

1.4.6  荧光定量PCR检测特异性基因表达  尿路上皮分化检测Cytokeratin 7、Cytokeratin 20和Uroplakin Ⅲ基因，平滑肌细胞分化检测α-SMA和SM22基因。操作步骤如下：应用Trizol从细胞中提取总RNA，进行反转录。取1 μL Oligo(dT)(10 μmol/L)及2 μL mRNA在65 ℃下变性5 min，加入9 μL RNase Free H₂O，4 μL 5×RT Buffer，2 μL dNTP Mixture，1 μL RNase inhibitor(10 U/μL)，1 μL ReverTra Ace，在42 ℃孵育60 min，4 ℃保存。应用BIO-RAD荧光定量PCR仪检测细胞中特异性基因的表达，引物见表1。用SYBR Green RT-PCR试剂盒进行定量检测，以β-actin为内参。50 μL反应体系含cDNA模板2.5 μL，上、下游引物各10 μmol/L，10×PCR缓冲液5 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL，高保真Taq DNA聚合酶0.4 μL，加去离子水补足至50 μL。95 ℃预变性3 min，40个循环(94 ℃ 10 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 10 s)。应用BIO-RAD软件收集荧光信号和扩增曲线。将目的基因的Ct值减去同个样本内参基因的Ct值，而得到相对ΔCt值。实验重复3次。

1.4.7  免疫细胞化学染色检测尿路上皮细胞特异性蛋白的表达  将细胞接种于6孔板中，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS浸洗3 min，体积分数为3%甲醇稀释过氧化氢避光封闭20 min，滴加稀释的一抗(anti-Cytokeratin 7、anti-Cytokeratin 20和anti-Uroplakin Ⅲ)，4 ℃过夜；PBS浸洗5 min，水平振荡，滴加biotin二抗孵育40 min，PBS浸洗，滴加PBS稀释的辣根过氧化物酶亲和素(SP)    (1∶200)，PBS浸洗，DAB显色，苏木精复染，倒置显微镜下观察拍照。根据染色强度进行计分，计分标准如下：0分表示阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-8分为阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)。实验重复3次。

1.4.8  免疫细胞荧光染色检测平滑肌细胞特异性蛋白的表达  细胞用乙醇及冰醋酸的混合液(比例为99∶1)固定15 min，PBS浸洗10 min，体积分数为10%羊血清封闭   30 min，加入稀释的一抗(anti-α-SMA和anti-SM22)，4 ℃过夜，PBS浸洗5min，加入荧光标记的二抗孵育1 h，PBS浸洗，荧光显微镜下观察拍照。根据染色强度进行计分，计分标准如下：0分表示阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-8分为阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)。实验重复3次。

1.4.9  Western blot检测Cytokeratin 7、Cytokeratin 20、Uroplakin Ⅲ、α-SMA和SM22的蛋白表达  使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白质，将蛋白质提取物(15-20 μg)在8%-10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行分离，电泳后通过半干转移将分离的蛋白质转移到PVDF膜，然后将膜在含5%脱脂奶粉的PBS中封闭1 h，倾去封闭液，加入稀释好的一抗，4 ℃过夜，用TBS-T液漂洗PVDF膜3次，每次10 min，用含二抗的TBS-T液(1∶10 000)浸泡PVDF膜，平摇2 h，滤纸吸干，浸入ECL化学发光试剂(等量混合A液和B液即可)，室温下温育5 min，显现印迹，UVP凝胶成像系统下进行灰度值分析。实验重复3次。

1.5  主要观察指标  ①尿源性干细胞的生长形态；②尿源性干细胞的生长曲线；③尿源性干细胞的抗原表达；④尿源性干细胞向尿路上皮细胞的诱导分化能力；⑤尿源性干细胞向平滑肌细胞的诱导分化能力。

1.6  统计学分析  实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0软件进行t 检验统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

组织工程学为尿路修复重建带来了新的希望。ATALA研究团队^[9-10]将体外构建的组织工程化膀胱应用于伴有膀胱功能异常的脊髓膜膨出患儿，随后又报道了组织工程化尿道修复尿道缺损的临床研究，取得了令人瞩目的成果。为进一步探索和优化组织工程学技术在尿路重建中的应用，许多学者相继报道了应用不同种子细胞和支架材料构建组织工程化组织的实验研究^[11]。还有研究报道了组织工程化组织修复尿道缺损和膀胱重建的实验研究^[12-14]。目前能够应用于临床的报道均选用自体细胞作为组织工程的种子细胞，虽然各项研究表明一些来自骨髓、脂肪组织、骨骼肌组织的间充质干细胞可作为潜在的种子细胞，但是这些间充质干细胞的获得均需要侵袭性操作，因此迫切希望用非侵袭性的方法开发可替换的细胞来源，而且以上组织来源的间充质干细胞诱导为尿路上皮细胞的成功率相对较低。美国维克森林大学再生医学实验室的研究者发现在尿液中存在一种干细胞——尿源性干细胞^[3]。国内外学者相继报道了尿源性干细胞扩增能力强和多向分化的研究结 果^[15-18]。与来自骨髓、脂肪组织、骨骼肌组织的间充质干细胞相比，分离尿源性干细胞仅仅需要简单、非侵袭性的方法。尿源性干细胞的提纯不需要酶消化处理，缩短了原代培养的制备过程并增加了细胞活力。更为重要的是尿源性干细胞可以更有效地分化为尿路上皮细胞^[19]。

该研究证实单克隆尿源性干细胞经培养后可以产生大量细胞，分离过程需注意以下几点：①健康成人尿液的采集过程需避免污染，尿液中应减少结晶，避免细胞分离时受损；②尿源性干细胞分离过程注意无菌操作；③每100 mL尿液约分离10个贴壁生长的尿源性干细胞集落，因此操作时应谨慎，尽量减少细胞丢失；④由单个细胞向多个细胞生长周期较为缓慢，大约2周时间，应严密观察细胞状态，待细胞在24孔板生长较为旺盛时，再行传代培养，切不可急于传代。以上经验有别于既往报道的研究，优化了提取过程，提高了细胞获取率，为以后的学者提供了可行的方法。

CD29、CD44、CD54、CD73、CD90和CD105作为间充质干细胞的表面标记物，常用于识别干细胞谱系^[20-22]。该实验结果证实尿源性干细胞具有干细胞特征，CD29和CD90呈现高表达，但不表达造血干细胞标记物CD34和CD45^[23-24]。这些结果与既往国内外学者报道的结果一致，证实了从尿液中成功提取了尿源性干细胞。

尿源性干细胞不是来源于尿路上皮细胞，所以尿源性干细胞并不表达尿路上皮细胞标记物。该研究发现尿源性干细胞能够通过高浓度表皮生长因子诱导向尿路上皮细胞分化，表达细胞角蛋白Cytokeratin-7和Cytokeratin 20和尿溶蛋白Uroplakin Ⅲ，这些均是尿路上皮细胞的特征性标记物。细胞角蛋白主要分布在上皮细胞，为角质细胞中主要的骨架蛋白，这种蛋白的主要功能是维持上皮组织的完整性和连续性。细胞角蛋白具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关^[25-27]。尿溶蛋白是一类与尿路上皮分化密切相关的特异性糖蛋白，分为UroplakinⅠ、UroplakinⅡ和UroplakinⅢ^[28-30]。UroplakinⅢ特异性表达于尿路上皮，能够起到维持尿路上皮延展功能和防止有害物质渗透的作用^[31]，是干细胞向尿路上皮分化的晚期表型蛋白^[32-35]。因此，Uroplakin Ⅲ的阳性表达证实了尿源性干细胞向尿路上皮的最终分化。

研究表明，与脂肪源性干细胞相比较，尿源性干细胞显示出更好的向尿路上皮细胞分化的能力，这可能归因于其尿路起源的原因^[36]。有学者推测尿源性干细胞可能来源于上尿路，这意味着尿源性干细胞可能既拥有外胚层内皮干细胞的分化潜能，又拥有中胚层间质干细胞的分化潜能^[37]。因此，尿源性干细胞更适合应用于尿路组织的修复重建。

在成体干细胞向平滑肌细胞分化的过程中，转化生长因子β1常被作为诱导剂，原因在于转化生长因子β信号通路在胚胎发育及平滑肌细胞分化过程中起到至关重要的作用^[38]。转化生长因子β信号通路包括经典的转化生长因子β-smads信号通路和非经典的信号通路。转化生长因子β-smads信号通路作为平滑肌细胞分化的始发因素，主要启动胚胎组织平滑肌细胞早期特异性基因(α-SMA、SM22)的表达^[39]。该实验结果显示尿源性干细胞经转化生长因子β1诱导后表达α-SMA和SM22。α-SMA和SM22被认为是平滑肌细胞分化的早期表型蛋白，证实了尿源性干细胞初步向平滑肌细胞分化的能力。但是在平滑肌细胞分化过程中，Myocd作为一种核受体转录因子蛋白，与血清效应因子和Nkx2.5形成复合物，结合到平滑肌细胞基因启动子区CArG，调控胚胎组织平滑肌细胞晚期特异性基因(SMHC、smoothelin、calponin)表达^[40]。单纯增加外源性转化生长因子β1并不能增强Myocd的表达，最终难以形成成熟的平滑肌细胞^[41-42]。下一步研究将以尿源性干细胞向成熟表型平滑肌细胞分化为研究重点，探索尿源性干细胞向成熟表型平滑肌细胞分化的机制，为尿路组织修复重建提供有效的种子细胞。

尿源性干细胞为尿路组织的修复重建提供理想的种子细胞来源，该研究总结了一套切实可行的分离获取方法，并分别应用2种专用培养基诱导尿源性干细胞向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化，实验结果证实了分化能力，具有较高的可行性，为以后的研究提供了坚实的基础。尿源性干细胞在临床应用之前，仍存在许多问题，如尿源性干细胞的真正来源、尿源性干细胞向尿路上皮细胞及平滑肌细胞分化的具体机制、诱导分化后的细胞功能、用于构建组织工程的细胞是否具有免疫原性等。虽然当前对有些难题尚不足以解决，但是随着干细胞和组织工程学的研究进展以及对尿源性干细胞研究的进一步深入，这些问题将会逐渐解决，尿源性干细胞必将为医学的发展作出贡献。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

干细胞分化：干细胞通过体外诱导的方法，基因组在时间和空间上选择性表达，产生特异性蛋白质，定向成为特定的成熟细胞。

平滑肌：是由平滑肌细胞组成的非横纹肌肌肉组织，分布在动脉和静脉血管管壁、膀胱、子宫、男性和女性生殖道、消化道、呼吸道、眼睛的睫状肌和虹膜。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。传统的干细胞多取材于胚胎、骨髓和脐血，在伦理和供体来源方面受到一定限制。尿源性干细胞具有高度增殖能力、多向分化潜能、取材方便、安全无创等优点，在组织工程学领域逐渐受到重视。尿源性干细胞在临床应用之前仍存在许多问题，如尿源性干细胞的真正来源、尿源性干细胞向尿路上皮细胞及平滑肌细胞分化的具体机制、诱导分化后的细胞功能、用于构建组织工程的细胞是否具有免疫原性等。虽然当前对有些难题尚不足以解决，但是随着干细胞和组织工程学的研究进展以及对尿源性干细胞研究的进一步深入，这些问题将会逐渐解决，尿源性干细胞必将为医学的发展作出贡献。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程