2.1  心室重塑  为了检测不同处理对心室重塑的影响，测量了移植后4周梗死心脏的瘢痕长度、梗死室壁厚度及心肌细胞的面积，见图1。与PBS组(864.91±166.97) μm相比，水凝胶组的室壁厚度更厚(1 156.52±264.41) μm，差异有显著性意义(P=0.012)，这表明单纯注射透明质酸水凝胶能影响心室重塑的进展；与PBS组(478.12±110.27) μm²相比，单独注射骨髓间充质干细胞组心肌细胞的面积明显变小(373.84±98.9) μm²，差异有显著性意义(P=0.048)。值得注意的是，与PBS组相比，细胞+水凝胶组产生了有利的整合性效应：瘢痕长度减小[(19.94±5.28)% vs. (26.83±2.44)%，P=0.007)、梗死区室壁更厚[(1 147.17±249.62) μm vs. (864.91±166.97) μm，P=0.015)以及心肌肥厚减轻[(342.47±61.74) μm² vs. (478.12±110.27) μm²，P=0.012)。这些数据提示单纯注射水凝胶和细胞均能改善心室重塑，并且两者的作用点不同；两者联合能产生最大效益。

2.2  血管新生  在心肌梗死区及梗死周边区通过计数α-SMA阳性的管型结构来评价血管新生。40倍物镜下梗死周边区的血管密度(PBS组、水凝胶组、细胞组、细胞+水凝胶组)(n=8)分别为(10.10±3.60)，(10.33±2.12)，(15.58± 5.74)，(16.10±3.71)个。PBS组与水凝胶组相比以及细胞组与细胞+水凝胶组相比，差异均无显著性意义，见图2A和2B。有趣的是，与PBS组或者水凝胶组相比，细胞组及细胞+水凝胶组中血管数目明显增多，这提示血管的增多与移植的骨髓间充质干细胞有关。

2.3  存活心肌  存活心肌主要分布在心内膜及心外膜的边缘。各组(PBS组、水凝胶组、细胞组、细胞+水凝胶组) (n=8)的存活心肌百分率分别为(15.09±5.36)%，(18.46± 5.27)%，(20.65±3.71)%，(23.96±7.49)%，其表现为逐个增加趋势。只有细胞+水凝胶组与PBS组比较差异有显著性意义(P=0.004)，见图2C和2D，这表明二者联合能显著提高梗死区的心肌存活。

心肌梗死已成为当今社会威胁全人类生命与健康的主要疾病之一^[1]。心肌梗死后缺血的心肌细胞大量死亡，且心脏自身再生能力有限，梗死区无法修复^[2]。近几年细胞治疗展现出修复受损心脏、阻止心室重塑进展的优良潜能，进而改善心肌梗死存活者的预后^[3-4]。从临床角度看，骨髓来源间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)自身具有很多优点，如易于获取及免疫原性低，成为心血管领域中细胞移植治疗的常用细胞^[5]。

尽管骨髓来源细胞移植修复受损心脏是安全的，但是临床试验显示射血分数只有轻度提高(0-5%)^[6-8]，这远远不能达到临床要求。低移植存活率是限制细胞治疗效果的一个重要因素，而因心脏跳动导致的机械丢失、失巢凋亡及缺血缺氧诱导凋亡是移植细胞低存活率的主要机制^{[3，5，9-10]}。作者的前期结果提示透明质酸水凝胶提高了移植细胞的存活率，使得心肌梗死部位早期(2周之内)有更多的细胞参与损伤心肌的修复过程，达到了显著改善心功能的效果^[11]，下一步将进一步探索其形态学水平的变化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.4.1  大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及标记  采用颈椎脱臼法处死SD大鼠，取股骨和胫骨，用5 mL注射器吸取DMEM细胞培养液反复冲洗骨髓腔，尽量将冲出的块状骨髓冲散。将冲出的骨髓悬液接种于培养瓶内，于体积分数为5%CO₂、37 ℃细胞培养箱内原代培养，24 h后首次换液，以后每隔2 d换液1次，达70%-80%融合时以1∶2的比例传代。收集第2代细胞，加入1 g/L的CM-DIL 5 μL进行细胞标记，37 ℃孵育5 min，混匀后4 ℃冰箱放置15 min后备用。

1.4.2  透明质酸水凝胶的制备  按照透明质酸水凝胶试剂盒HyStem Hydrogel说明书制作0.8%的透明质酸水凝胶。用1 mL注射器向HyStem管形瓶中添加1.0 mL去离子水，用注射器向Extralink管形瓶中添加0.5 mL去离子水，将Extralink和HyStem按照1∶4比例混合，20 min内完成凝胶化。包封细胞时，按照每40 μL HyStem^TM溶解1×10⁶个细胞的比例，包裹CM-DIL标记的细胞，然后用移液枪吹吸溶液，使细胞在凝胶中均匀分布，注射前按照1∶4的比例再加入Extralink^TM，最终构建成50 μL的水凝胶包裹1×10⁶个细胞的复合物，再进行移植。

1.4.3  大鼠心肌梗死模型的制作  将雌性SD大鼠麻醉开胸后结扎前降支，以心脏前壁局部颜色转为苍白为标准。结扎后1周，使用超声心动图筛选符合条件的大鼠，心肌梗死入选标准是短轴缩短率小于30%^[12]。

1.4.4  动物分组及体内移植  将符合条件的大鼠随机分为4组：①PBS对照组(n=8)：心肌内注射50 μL PBS；②水凝胶组(n=8)：心肌内注射50 μL透明质酸水凝胶；③细胞组(n=8)：心肌内注射用50 μL PBS溶解的1×10⁶个骨髓间充质干细胞；④细胞+水凝胶组(n=8)：心肌内注射用   50 μL透明质酸水凝胶包封的1×10⁶个骨髓间充质干细胞。造模1周后将模型鼠行二次开胸，按照分组将移植物注射到梗死边缘区及梗死区，移植物新鲜配制，5 min内注射完毕。移植后4周，按实验计划取相应数量的实验大鼠，经水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，取出心脏进行以下实验。

1.4.5  石蜡切片的处理  移植后4周，各组大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，剪开腹主动脉，用生理盐水从下腔静脉冲洗心室，至血流明显减少，立即取出心脏，剪去大血管，放进中性甲醛中固定24-48 h。按照FISHBEIN等^[13]描述的心室切割方法，即以平行于房室沟将心脏从心尖部到心底部均分成4部分，自来水冲洗6-8 h，上机脱水、浸蜡，包埋，常温保存，切片(厚度4 μm)，65 ℃烤片1 h，备用。

1.4.6  苏木精-伊红染色测量心肌细胞的横断面面积  将切片浸入到二甲苯中脱蜡3次，每次20 min。经梯度乙醇水化，放入苏木精染液10 min，1%盐酸乙醇分化液30 s，温水浸泡15 min返蓝，入1%伊红溶液20 s，经梯度乙醇脱水(由低体积分数至高体积分数分别为70%，80%，90%，95%，100%，100%即可，每个体积分数1 min)，放入二甲苯透明，于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min，中性树脂封固，显微镜拍照，Image J软件分析。通过苏木精-伊红染色图片，测量心肌细胞的横断面面积。每只大鼠至少计数50个细胞，细胞选取条件是呈椭圆形有细胞核的细胞。

1.4.7  Masson染色测量梗死区室壁厚度、瘢痕长度及存活心肌量  将切片浸入到二甲苯中脱蜡3次，每次20 min，梯度乙醇入水，流水冲洗干净后入重铬酸钾溶液浸泡16-18 h，苏木精染液10 min，1%盐酸乙醇分化液30 s，温水浸泡15 min返蓝，放入丽春红染液浸泡3 min，磷钼酸分化10 s，甩干，放入亮绿染液30 s，经梯度乙醇脱水，放入二甲苯透明，于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min，中性树脂封固，显微镜拍照，Image J软件分析。通过Masson图片，测量梗死区室壁厚度、瘢痕长度及存活心肌量。红色代表心肌纤维，绿色代表胶原纤维。梗死区室壁厚度的测量方法：将透壁性梗死区均分成5份，测量每份长度，取均值；瘢痕长度的表示方法：梗死区中线长度与左心室中线长度的比值；存活心肌量的表示方法：梗死区域中红色的面积与整个梗死区域的面积之比。

1.4.8  免疫组化染色检测血管密度  为测定梗死区与梗死周边区的血管密度，用α-SMA抗体(1∶5 000，Abcam)对石蜡切片进行染色。每个标本取3张片子，每张取5个视野，结果用每高倍镜下的血管数目表示。在40倍物镜下，血管的选取条件：①α-SMA阳性；②有管腔；③直径为10-100 μm。将切片浸入到二甲苯中脱蜡3次，每次20 min，梯度乙醇入水，抗原修复，加入100 μL体积分数为3%H₂O₂以消除内源性过氧化物酶活性，室温下反应10-15 min，PBS轻轻冲洗3次×5 min，高压锅抗原修复，加入用一抗稀释液配制的一抗4 ℃孵育16 h，PBS轻轻冲洗3次×5 min，去掉抗体，PBS轻轻冲洗3次×5 min，按照一抗来源，加入PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育0.5 h，去掉抗体，PBS轻轻冲洗3次×5 min，加入DAB显色液，进行免疫组化显色，时间一般为1 min左右，在显微镜下连续观察显色情况。待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸取显色液，用PBS充分冲洗，入苏木精染液1 min，入1%盐酸乙醇溶液10 s，温水返蓝后，行脱水、透明、封固，显微镜拍照，Image J软件分析。

1.5  主要观察指标  梗死区室壁厚度、瘢痕长度及存活心肌量。

1.6  统计学分析  结果数据表示为x(_)±s，数据图中用误差棒表示标准差。两组比较用t 检验，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK检验。应用SPSS 17.0进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

此次研究从组织水平证实了透明质酸水凝胶作为骨髓间充质干细胞移植的载体促进了大鼠心肌梗死后心脏修复及心功能的改善。单独注射水凝胶增加了梗死区室壁厚度；单独注射骨髓间充质干细胞抑制了心肌细胞肥大，促进血管新生；两者联合不仅梗死区室壁厚度最厚，心肌细胞面积最小，其瘢痕少及胶原沉积减少，新生血管增多，而且存活心肌增多，取得最大修复受损心脏的效应。

目前大量的动物实验以及临床试验均表明骨髓间充质干细胞移植可以改善心肌梗死后心功能，减轻心室重塑，促进血管生成^[14-15]。这种细胞移植治疗的体内机制主要有2个方面：分化作用及旁分泌作用^[16]。分化作用是指移植的骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞及血管的内皮细胞和平滑肌细胞，替代受损心肌。骨髓间充质干细胞作为成体干细胞，其在体内能否向心肌细胞分化备受争议。有学者指出：即使骨髓间充质干细胞可以分化成心肌细胞，这种发生率也是罕见的，以至于不能形成有意义的肌肉块^[17]。此外，引起心脏衰竭的心肌细胞丢失数量至少达到10亿个，残存的移植细胞不可能通过替代治疗改善心肌梗死后的心脏功 能^[18]。目前关于骨髓间充质干细胞移植带来的心脏获益主要归因于骨髓间充质干细胞的旁分泌作用^[17]，这种作用主要是指移植的骨髓间充质干细胞分泌细胞因子动态改变心肌微环境，促进修复^[19]，其分泌的细胞因子主要分为4种：①血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、血小板衍生生长因子等促进血管再生；②基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9等调控细胞外基质重塑；③胸腺素β4、成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、胰岛素样生长因子1、巨噬细胞集落刺激因子等促进内源性干细胞增殖、招募及存活；④血红素氧合酶1、肝细胞生长因子、诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素6等参与免疫调节^[16]。这也就合理解释了在移植细胞数量少的情况下，依然观察到移植细胞促进血管生成以及心功能的改   善^[20]。作者前期实验结果表明透明质酸水凝胶能提高移植细胞的存活率，然后通过比较移植后4周大鼠的射血分数，证实了透明质酸水凝胶作为骨髓间充质干细胞移植的载体促进了大鼠心肌梗死后心功能的改善。从组织学水平上看，联合组明显抑制了心室重塑，室壁厚度最厚，心肌细胞面积最小，其瘢痕少及胶原沉积减少，新生血管增多，而且存活心肌增多。该实验中骨髓间充质干细胞是向心肌细胞分化还是产生了旁分泌效应，下一步将被进一步探索。

此次研究中，单独注射水凝胶修复心脏的作用机制是什么？其保护心功能的一个作用是水凝胶通过增加室壁厚度，降低室壁张力，产生力学支撑，这与前期报道一致^[21-23]。遗憾的是，此次研究中并没有检测到透明质酸水凝胶促进血管新生，而WANG等^[24]研究发现透明质酸通过调节巨噬细胞促进血管生成以改善心功能。在此次研究中，单纯透明质酸水凝胶有无产生活性生物片段以促进心肌修复，将被进一步探讨。

此次研究结果提示透明质酸水凝胶作为骨髓间充质干细胞的运输载体，促进了心肌梗死后心脏的修复，改善心功能。由骨髓间充质干细胞与透明质酸水凝胶组成的复合物在心肌梗死治疗方面有较好的应用价值，值得进一步研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

透明质酸：是一种线性的糖胺聚糖，在多种天然组织细胞外基质中含量丰富，参与细胞黏附、迁移、增殖及分化，在机体组织水分保持、关节润滑和损伤修复过程中发挥重要作用。透明质酸通过化学交联方法能形成具备一定特性和机械性能的水凝胶。

可注射水凝胶修复梗死心肌的机制：①作为细胞移植的载体，通过其本身的黏滞性阻止因心脏跳动和静脉回流导致的细胞逃逸，提高移植细胞的滞留，并能为移植的细胞提供合适的三维立体生长环境，防止细胞的失巢凋亡，提高细胞的存活率；②作为蛋白或者生长因子的控制释放载体，防止这些生物活性分子被体内的酶降解，阻止其一过性释放，延长生物活性分子在体内的作用时间，并实现局部用药；③水凝胶通过材料堆积增加梗死区室壁厚度，提供力学支撑；④性能优良的水凝胶能为内源性修复创造条件，为干细胞植入提供附着支架；⑤水凝胶降解的活性生物片段招募内源性干细胞，促进心肌再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

心血管组织工程领域中的可注射水凝胶有希望成为改善心肌梗死后心功能以及阻止心室重塑的新策略。研究报道单独注射不可降解的无生物活性的生物材料尽管增加了室壁厚度，但不能改善心肌梗死后心功能，这说明单纯的力学支撑在修复心肌梗死后的心功能是不足的。解决这一问题，可以采用有生物学效应的生物材料或者与移植细胞组成复合物。该实验显示透明质酸水凝胶与骨髓间充质干细胞的复合物可显著促进心肌梗死后心功能的修复。水凝胶注射后，需要合理的试验技术去检测整个修复的动态变化过程。组织学方法的检测需要牺牲大量的动物。动物活体内成像有希望连续检测整个修复过程。只有检测出梗死区域内的细胞外基质和细胞成分的变化才能更进一步的了解其修复机制。因此将可注射的水凝胶向临床转化，还需要做大量的前期实验和研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程