永生化人肝细胞HepZJ的临床前急性毒性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1659

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 2067-2074.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1659

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

永生化人肝细胞HepZJ的临床前急性毒性评价

卢扬洲¹，黎少¹，姜华²，李伟²，高毅¹

¹南方医科大学珠江医院肝胆二科，广东省广州市 510280；²中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心/药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京市 100176

修回日期:2018-12-24 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 高毅，博士，主任医师，教授，博士生导师，南方医科大学珠江医院肝胆二科，广东省广州市 510280；并列通讯作者：李伟，主任药师，中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心/药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京市 100176
作者简介:卢扬洲，男，1991年生，广东省陆丰市人，汉族，硕士，主要从事肝脏组织工程和生物人工肝研究。
基金资助:
国家高技术研究发展计划资助(2012AA020505)，项目负责人：高毅；国家自然科学基金资助项目(81470875)，项目负责人：高毅；广东省自然科学基金资助项目(2014A030312013)，项目负责人：高毅；广东省级科技计划项目(2015B020229002)，项目负责人：高毅

Pre-clinical acute toxicity of an immortalized human hepatocyte cell line HepZJ

Lu Yangzhou¹, Li Shao¹, Jiang Hua², Li Wei², Gao Yi¹

¹Department of Hepatobiliary Surgery II, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; ²National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institutes for Food and Drug Control/The Beijing Key Lab for Pre-clinical Safety Evaluation of Drugs, Beijing 100176, China

Revised:2018-12-24 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Gao Yi, MD, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Hepatobiliary Surgery II, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; Li Wei, Chief pharmacist, National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institutes for Food and Drug Control/The Beijing Key Lab for Pre-clinical Safety Evaluation of Drugs, Beijing 100176, China
About author:Lu Yangzhou, Master, Department of Hepatobiliary Surgery II, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
Supported by:
the National High Technology Research and Development Plan of China, No. 2012AA020505 (to GY); the National Natural Science Foundation of China, No. 81470875 (to GY); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030312013 (to GY); Guangdong Provincial Science and Technology Plan Project, No. 2015B020229002 (to GY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
急性毒性实验：安全性实验的重要组成部分，它是指机体(人或实验动物)1次或24 h内多次接触外来药物后，观察在短期内(一般不超过14 d)引起中毒效应(包括死亡)的实验，这对于了解药物的毒性强度、性质和可能的靶器官，以及阐明药物的安全剂量是必不可少的。该实验以细胞系HepZJ作为药物进行临床前急性毒性研究。
细胞治疗：是近年来兴起的疾病治疗新技术，即利用某些具有特定功能细胞的特性，采用生物工程方法获取并通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有替代损伤组织行使功能、增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。

摘要
背景：肝细胞移植、肝脏组织工程与生物人工肝的研究为肝衰竭患者带来福音，然而截至目前仍未发现十分合适的种子细胞。课题组前期自行构建人永生化肝细胞系HepZJ作为新的种子细胞，并进行了临床前安全性评价研究。
目的：对新型永生化人肝细胞系HepZJ进行急性毒性研究，为HepZJ应用于临床可能发生的毒副反应以及设计安全剂量提供参考依据。
方法：在HepZJ细胞急性毒性研究中，将低、中、高(5×10⁶，5×10⁷，8.25×10⁷)3个剂量组的HepZJ细胞悬液和空白对照溶液经尾静脉单次注射进入SD大鼠体内，观察大鼠的临床症状和体质量变化，注射结束后第1天以及第14天剖检进行血液学相关检验、大体病理和免疫组化检查，综合分析该细胞系的毒副反应和安全剂量。
结果与结论：在HepZJ细胞急性毒性研究中，高剂量组大鼠注射结束时出现1只死亡，与对照组比较，血常规、凝血功能和血清生化部分指标差异有显著性意义(P < 0.05)；14 d后各项检查差异无显著性意义(P > 0.05)。低剂量组和中剂量组大鼠与对照组在临床症状、体质量变化、血液指标和大体病理形态上差异均无显著性意义。结果表明，永生化人肝细胞系HepZJ单次注射安全剂量为5×10⁷/只，无明显毒副反应，剂量过大时可出现明显毒副反应，包括炎症应激、凝血障碍和肝功能损伤等，甚至死亡。因此，只有准确控制HepZJ的使用剂量，才能保证该细胞的临床应用安全性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3525-0133(高毅)

关键词: 永生化人肝细胞系, 安全性, 急性毒性, 单次注射, 毒副反应, 安全剂量, 细胞治疗产品, 肺栓塞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hepatocyte transplantation, liver tissue engineering and biological artificial liver have brought good news to liver failure patients, but there are still no very appropriate seed cells so far. Our laboratory has built a human immortalized liver cell line named HepZJ as new seed cells, and a preclinical safety evaluation has been implemented.
OBJECTIVE: To complete the toxicity study of the new immortalized hepatocyte cell line HepZJ so as to provide reference for predicting possible toxic and adverse effects and designing safe dose of HepZJ in clinical practice.
METHODS: In the acute toxicity test, the HepZJ cell suspension of low, medium, high dose groups (5×10⁶, 5×10⁷, 8.25×10⁷) and normal saline of control group were injected into the Sprague-Dawley rats through the caudal vein, respectively. The clinical symptoms of rats and its weight change were then observed. Anatomical examination was performed at 1 and 14 days after injection for hematological, gross pathological and immunohistochemical analyses. The adverse reactions and safety dosage of the cell line were analyzed comprehensively.
RESULTS AND CONCLUSION: In the acute toxicity test of HepZJ cells, one rat in the high dose group died just after injection. Compared with the control group, parts of indexes in blood routine, clotting function and serum biochemical examination showed significant difference (P < 0.05) in the high dose group, while there was no significant difference at 14 days after injection. The experimental rats in the low dose group and medium dose group showed no obvious difference in clinical symptoms, body mass, blood indexes and gross pathological examination as compared with the control group (P > 0.05). To conclude, the safe dose of HepZJ is 5×10⁷ cells for each injection, having no obvious adverse reactions. A larger dose may lead to obvious adverse reactions, such as inflammatory stress, clotting disorders, liver dysfunction and even death. Therefore, to accurately control the dose of HepZJ is the guarantee for the clinical safety of HepZJ.

Key words: Hepatocytes, Cell Transplantation, Acute Toxicity Tests, Tissue Engineering

中图分类号:

卢扬洲，黎少，姜华，李伟，高毅. 永生化人肝细胞HepZJ的临床前急性毒性评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2067-2074.

Lu Yangzhou, Li Shao, Jiang Hua, Li Wei, Gao Yi. Pre-clinical acute toxicity of an immortalized human hepatocyte cell line HepZJ[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 2067-2074.

图/表（结果） 2

2.1 临床症状 在急性毒性实验中，HepZJ高剂量组尾静脉注射细胞悬液后即时有1只雌性大鼠出现蜷缩俯卧、呼吸困难、口唇发绀，数分钟后死亡，立即予剖检处理(因剖检后血液凝固而未能行相关指标检测，于注射后第1天统一观察大体标本)。另有1只雌鼠和1只雄鼠出现静止俯卧、焦躁不安，数分钟后恢复正常。余各组SD大鼠在注射后14 d内饮食正常、被毛均匀分布、活动正常，无异常临床症状。

2.2 各组大鼠体质量比较 在急性毒性实验中，注射后第1天和第14天时，各实验组与对照组体质量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3，提示HepZJ细胞对动物体质量无不良影响。

2.3 各组大鼠血常规指标比较 注射结束后第1天，HepZJ低剂量组、HepZJ中剂量组白细胞、红细胞、血小板计数与空白对照组比较差异无显著性意义，HepZJ高剂量组与空白对照组中性粒细胞绝对值分别为(9.2±0.8)× 10⁹ L^-1，(7.0±1.5) ×10⁹ L^-1，差异有显著性意义(P < 0.05)，淋巴细胞绝对值分别为(3.1±1.1)×10⁹ L^-1，(4.3±0.8)×10⁹ L^-1，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4A。注射结束后第14天，各实验组与空白对照组比较各指标差异无显著性意义，见图4B。结果提示HepZJ单次注射后短时间内可在动物体内诱发炎症反应，14 d(恢复期)后炎症反应消失。

2.4 各组大鼠凝血功能指标比较 注射结束后第1天，HepZJ低剂量组、HepZJ中剂量组各指标与空白对照组比较差异无显著性意义，HepZJ高剂量组与空白对照组活化部分凝血激酶时间分别为(12.5±0.5) s，(11.3±0.6) s，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5A。注射结束后第14天，各实验组与空白对照组比较各指标差异无显著性意义，见图5B。结果提示HepZJ单次注射短时间内在动物体内可致凝血功能异常，14 d(恢复期)后凝血功能恢复正常。

2.5 各组大鼠血清生化指标比较 对于肝功能检测，注射后第1天HepZJ低剂量组、HepZJ中剂量组各指标与空白对照组比较差异无显著性意义，HepZJ高剂量组与空白对照组的丙氨酸氨基转换酶分别为(32.7±4.6) U/L、(26.0±3.6) U/L，差异有显著性意义(P < 0.05)，总胆红素分别为(22.0±4.4)× 10^-1 μmol/L、(15.1±1.9)×10^-1 μmol/L，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6A。第14天(恢复期)结束时各指标差异无显著性意义，见图6B。对于肾功能检测，注射后第1天与第14天各指标差异无显著性意义，见图7。结果提示HepZJ单次注射短时间内在动物体内可致肝功能异常，14 d后肝功能恢复正常，但是对肾功能及内环境电解质无不良影响。

2.6 各组大鼠大体病理及免疫组化检测结果 在急性毒性实验中，除HepZJ高剂量组1只大鼠死亡外，HepZJ低剂量组和HepZJ中剂量组大鼠在注射后第1天和第14天，剖检观察心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵巢、子宫和大网膜，其体积大小、形态、颜色、质地等未见明显异常，未行免疫组化检查。HepZJ高剂量组注射后第1天(包括死亡大鼠)大体标本，见图8，其中肝、肾轻度淤血呈暗红色，脾的被膜、红髓区相对白髓区增大，肺的颜色轻度发白，余器官未见明显异常。因此，只对脾、肝、肺、肾行免疫组化检查，镜下模糊着色为可疑染色，浅黄色为弱染色，棕黄色为中度染色，棕褐色为强染色，无着色判定为阴性结果，综合分析判定可疑染色、弱染色、中度染色和强染色是非特异性着色还是阳性结果。

脾脏免疫组化染色：注射后第1天有3只雄性及4只雌性鼠脾脏红髓区域，包括脾窦和脾索周围胞质呈片状棕黄色着色，白髓未见异常。第14天剖检所有大鼠未见明显异常，见图9，提示HepZJ进入体内后短时间内可被脾脏摄取，但随时间延长可被代谢吸收。

肝脏免疫组化染色：注射后第1天有1只雄性及1只雌性鼠肝脏肝小叶散在浅黄色着色，偶尔可见中央静脉浅黄色着色。第14天剖检所有大鼠未见明显异常，见图10，提示HepZJ进入体内后少数细胞短时间内可被肝脏摄取，但随时间延长可被代谢吸收。

肺脏免疫组化染色：注射后第1天所有SD大鼠肺脏肺泡上皮有较多细胞质棕黄色着色，支气管壁偶见浅黄色着色。第14天剖检所有大鼠未见明显异常，见图11，提示HepZJ进入体内后短时间内可聚集在肺部，但随时间延长可被代谢吸收。

肾脏免疫组化染色：未见明显异常，见图12。

以上结果提示HepZJ经尾静脉注射进入动物体内后的主要靶器官是脾脏、肝脏和肺脏，剂量过高时可引起HepZJ细胞栓塞，出现严重肺栓塞时可引起死亡。

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引言

各类肝病如病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等最终结局是肝衰竭。肝移植是治疗终末期肝衰竭的最有效方法^[1]，但肝源的严重短缺极大地限制了肝移植手术的临床应用范围。随着细胞移植、组织工程的不断研究发展，肝细胞移植技术和生物人工肝系统为肝衰竭患者提供一种新的并且具有广阔应用前景的治疗思路^[2-3]。然而，无论是肝细胞移植还是生物人工肝，它们都需要种子细胞作为细胞材料。于是，合适的肝细胞就成为了肝细胞移植技术和生物人工肝系统用于临床治疗的基础与核心。目前用于肝细胞移植及生物人工肝研究的治疗细胞种类多样，具有各自的优势，但都存在不同程度的不足^[4]。原代肝细胞理论上最接近人肝细胞的结构和功能，是最理想的选择，但是其来源短缺，获取过程繁杂，体外增殖能力弱以致难以大量获取，传代后肝细胞功能退化明显等缺点阻碍了临床应用^[5-6]；肿瘤源性细胞系来源广泛，增殖能力强，并具备某些肝细胞功能，但是在解毒和代谢能力方面较弱，另外由于肿瘤基因的存在，该细胞系具有潜在致瘤性^[7-8]；动物源性肝细胞来源较广，在解毒代谢功能方面有优势，但是由于异种的缘故，其生物合成功能对人体无益，其携带的反转录病毒(PERV)对人体有感染风险，进入人体后面临免疫排斥反应^[9-10]；干细胞生长潜能良好，可诱导分化成肝细胞，具有很好的研究价值，但目前尚处于研究阶段^[11-12]；胎肝细胞免疫原性低，在体外具备较好的增殖分化能力，但是来源匮乏，并且涉及道德伦理问题^[13-14]。鉴于各类治疗细胞存在的缺陷，科研者总是不遗余力地探索新的细胞材料。

课题组前期应用导入hTERT基因的方法^[15]，PCR扩增hTERT质粒中的hTERT基因，再导入pIRES-RFP载体，建立慢病毒载体phTERT-IRES-RFP；然后以慢病毒载体phTERT-IRES-RFP作为模板扩增后导入plenti6.3-MCS- V5质粒，获得pLENT6.3/V5-hTERT-IRES-RFP重组载体。让人原代肝细胞被重组载体感染，杀稻瘟筛选出阳性克隆，构建新型永生化人肝细胞系HepZJ。显微镜观察，HepZJ有人原代肝细胞的形态，传代能力强且染色体核型在50代内稳定无异常。RT-PCR证实HepZJ有GST-π、ALB、HBCF-X、P4503A、CK18、HNF4、GS和ASGPR等基因的表达；全自动生化分析仪检测证实，HepZJ培养上清液中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶活性随着时间延长呈下降趋势，尿素氮水平随时间延长则呈上升趋势，这些结果都提示该细胞系保留着良好的肝细胞功能。

为使该细胞系可作为种子细胞应用于肝细胞移植、肝组织工程和生物人工肝等临床实践，课题组又通过支原体检测、内毒素检测、体内生物分布以及致瘤性研究，证实其生物安全性^[16]。急性毒性实验是安全性实验的重要组成部分，它是指机体(人或实验动物)1次或24 h内多次接触外来药物后，观察在短期内(一般不超过14 d)引起中毒效应(包括死亡)的实验，这对于了解药物的毒性强度、性质和可能的靶器官，以及阐明药物的安全剂量是必不可少的。实验以细胞系HepZJ作为药物进行临床前急性毒性研究，旨在探讨该细胞系对体内血细胞、凝血功能、肝肾功能和内环境的影响，是对其临床应用安全性的进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞的体内急性毒性实验。

1.2 时间及地点 2017年9至12月在南方医科大学再生医学研究所和中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心完成。

1.3 材料 DMEM基础培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；0.25%Trypsin & 0.02% EDTA胰蛋白酶(吉诺生物医药技术有限公司)；细胞死活荧光染色试剂盒(天津卫凯生物工程有限公司，A1016-01)；0.4%锥虫蓝染液(北京索莱宝科技有限公司)；戊巴比妥钠(湖北鸿运隆生物科技有限公司)；APTT(TC0305)、PT(TC0307)测定试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)；Sysmex CA-1500血凝分析仪；ADVIA 2120i血细胞分析仪及配套试剂；日立7180型全自动生化分析仪及配套试剂；人抗白蛋白抗体(AAA)免疫组化试剂盒(上海皓尘生物技术有限公司，HC-I1000H)。

6周龄SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量150-200 g，购自中国食品药品检定研究院，许可证号SCXK(京) 2014-0013。

1.4 实验方法

1.4.1 HepZJ细胞的培养及细胞悬液的配制 参考Ra等^[17]的操作方法，以含体积分数为10%胎牛血清的培养基在37 ℃，体积分数为5% CO₂条件下复苏并培养HepZJ细胞(南方医科大学再生医学研究所，第6代)，每隔2 d换液1次，随时观察细胞生长形态，见图1A。待细胞生长至足量时，取部分细胞进行死活染色，见图1B；消化并离心细胞，生理盐水反复润洗除去血清，锥虫蓝染色确保活率大于90%，并配制不同浓度梯度的HepZJ细胞生理盐水悬液备用。

1.4.2 SD大鼠单次尾静脉注射永生化人肝细胞系HepZJ 将80只SD大鼠雌、雄各半随机分为4组，分组见表1。以相应剂量的HepZJ细胞悬液和生理盐水分别经尾静脉以80 μL/s的速度注射进入SD大鼠体内，见图2。观察大鼠临床症状，包括死亡情况、饮食、被毛、活动状况等，持续14 d。每周测定1次体质量，分别于注射结束后第1天和第14天对动物进行剖检(每次10只，雌雄各半)，自下腔静脉采血作血液学和血清生化学检测，观察心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵巢、子宫和大网膜大体病理，根据剖检大体标本决定是否做镜下免疫组化检查。若动物异常死亡，则立即剖检。

1.4.3 血液学及血清生化指标测定 ①新鲜静脉血EDTA-2K抗凝备用，使用配套试剂对ADVIA 2120i血细胞分析仪进行校准和质量控制，确保仪器准确后对血液样品进行测定。选取白细胞计数、中性粒细胞绝对值^[18]、淋巴细胞绝对值、红细胞计数、血小板计数作为血常规分析指标；②新鲜静脉血与0.109 mol/L柠檬酸钠按9∶1混合均匀抗凝，以3 000 r/min低温离心15 min，收集上层液体(血浆)，加入活化部分凝血激酶时间、凝血酶原时间测定试剂以凝固法在Sysmex CA-1500血凝分析仪上检测。以凝血酶原时间和活化部分凝血激酶时间作为凝血功能分析指标^[19]；③新鲜静脉血常温静置30 min，3 000 r/min离心5 min获得血清，使用配套试剂对日立7180型全自动生化分析仪进行校准和质量控制，确保仪器准确后对血清样品测定。选取丙氨酸氨基转换酶、天冬氨酸氨基转换酶、总胆红素^[20]、尿素氮、肌酐^[21]、葡萄糖、白蛋白、血清钾(K⁺)和血清钠(Na⁺)作为肝、肾功能分析指标。

1.4.4 大体病理和免疫组化检查 细胞注射后第1天和第14天剖检获取心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵巢、子宫和大网膜，观察项目包括体积大小、形态、颜色、质地等。如果大体标本出现异常，则以石蜡固定切片，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法进行免疫组化染色，以抗人白蛋白抗体为一抗，兔抗为二抗按常规步骤染色，对HepZJ细胞进行体内定位。①脱蜡水化组织切片；②体积分数为3%H₂O₂作用10 min，以阻断内源性过氧化物酶；③蒸馏水洗，PBS浸泡5 min；④抗原修复：处理好的切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)切片盒，放入微波炉，将微波炉调至中高挡(98-100 ℃)加热10-15 min，观察切片盒若有水分损失，则直接加入蒸馏水数次；将切片盒从微波炉取出放置室温冷却；⑤PBS洗5 min×3次；⑥正常羊血清工作液封闭，放置37 ℃温箱孵育30 min；⑦滴加一抗，4 ℃冰箱孵育过夜；⑧PBS洗5 min×3次；⑨滴加兔Anti-Goat IgG H&L(HRP)，37 ℃温箱孵育3 min；⑩PBS洗5 min×3次；?滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温湿盒10 min；?PBS洗5 min×3次；?DAB显色；?苏木精复染、水洗，盐酸乙醇分化，返蓝；脱水透明后封固。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠血常规指标比较；②各组大鼠凝血功能指标比较；③各组大鼠血清生化指标比较；④各组大鼠大体病理及重要脏器免疫组化检测结果。

1.6 统计学分析 实验结果数据以x(_)±s表示，使用Office Excel 2003和Graphpad prism 5软件进行数据处理和图表绘制，采用单样本t 检验和独立样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近些年来，国内外细胞及其治疗技术发展迅速，随着免疫细胞治疗、干细胞治疗、基因编辑技术以及组织工程学等基础研究和临床医疗探索的发展和日益完善，细胞作为药品的研发、临床应用已成为研究热点，为临床上许多疑难杂症提供新的治疗思路和方法。细胞治疗产品的结构和机制与化学药物、生物药物、医疗器械相比更加复杂多样，既往标准化的药物临床前评价方法不一定完全适用于细胞产品。细胞治疗产品的临床前评价内容取决于细胞种类及临床应用；细胞的研究计划及临床试验方案也被纳入评价内容的选择；正是因为细胞治疗产品多种多样，其治疗途径、治疗机制、体内生物学行为、临床治疗的利弊有着极大的差异和不稳定性，对不同细胞产品的评价内容应围绕“具体情况具体分析”的原则^[22]。在细胞安全性方法学方面，可分为体外安全性检测和体内安全性检测^[17^，^23-24]。体外安全性检测项目包括细胞染色体核型、转录基因、转录蛋白和微生物污染等，体内安全性检测项目包括急性毒性实验^[25-26]、长期毒性实验^[27]、致瘤性实验^[28]、生物分布实验等^[29]。通过这些安全评价是细胞进入临床应用的基础。

由于肝移植手术难以推广，内科综合治疗效果差强人意，人们迫切期待一种新的有效的急性和慢性肝衰竭治疗方法出现。以细胞治疗为基础的肝细胞移植技术和生物人工肝则展现出广阔的前景^[30-31]。课题组前期利用慢病毒表达载体对原代培养的正常人肝细胞稳定转染hTERT的方法建立新型永生化人肝细胞系HepZJ^[15]。安全性实验包括体内毒性实验、致瘤性实验和生物分布实验^[17^，^32]，课题组前期通过一系列安全性实验证实HepZJ细胞无支原体污染，无致瘤性，并分析该细胞在动物体内的生物分布情况。此次研究在查阅相关文献及指导文件的基础上设计了急性毒性实验^[33-36]，这是对前期安全性实验的有力补充。同时，以永生化细胞系作为药品进行急性毒性实验在国内外尚未见报道，具有一定的创新性。

在急性毒性实验中，药物经静脉进入全身各个系统包括循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统后，均可能发生毒性反应。全身器官包括血液、心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵巢、子宫和大网膜等都可能成为靶器官。在体内毒性既往研究中，Yun等^[32]以及Ra等^[17]将人脐带间充质干细胞注射进入小鼠体内后获取血液、尿、脑、心、肝、肾等器官进行生化或组织学分析，未见异常结果。He等^[37]将人脐带间充质干细胞注射进入食蟹猴体内后分析体质量、心电图、血常规、血生化、免疫指标，并获取相应器官包括脑、心、脾和肺进行组织学分析，未见异常结果。课题组结合临床实践，在注射HepZJ细胞后对动物的症状、死亡情况、体质量变化、血常规、凝血功能、肝肾功能进行观察和检测。根据前期生物分布研究结果和大体标本观察，对肝、脾、肺和肾进行免疫组化检查，有针对性地分析HepZJ细胞对机体可能出现的毒性作用。

实验中，HepZJ低、中剂量组与空白对照组相比，注射后14 d内无异常临床表现及死亡现象，体质量变化、血常规、凝血功能、肝肾功能和大体标本在第1天和第14天检查均未见显著性差异。HepZJ高剂量组于注射后出现1只大鼠死亡，另有雌雄大鼠各1只虽未死亡，但出现静止俯卧、焦躁不安，结合前期实验结果和相关文献，考虑为肺栓塞引起^[38-39]。HepZJ高剂量组注射后第1天出现中性粒细胞绝对值显著增多，淋巴细胞绝对值显著减少，活化部分凝血激酶时间显著延长，丙氨酸氨基转换酶和总胆红素显著升高，免疫组化染色脾脏、肝脏和肺脏可见HepZJ细胞滞留，尤其是肺脏，再次说明细胞注射易引起肺栓塞，需要控制注射的速度。第14天时各血液学、生化指标以及免疫组化镜下检查均无显著性差异。这些结果说明单次细胞注射剂量低于5×10⁷/只时，对动物无不良影响。当单次细胞注射剂量达到8.25×10⁷/只时短时间内可导致动物凝血功能障碍、肝功能损伤，并诱发全身炎症反应，并可引起器官细胞栓塞，但出现严重肺栓塞时可导致动物死亡。HepZJ引起的毒性反应与注射剂量有关，剂量越小，毒副反应严重程度越低，14 d(恢复期)后凝血功能、肝功能均恢复正常，炎症反应消失。因此，HepZJ注射的安全剂量为中剂量(5×10⁷/只)，不会引起毒副反应。当达到高剂量(8.25×10⁷/只)时，可能导致死亡。

细胞移植的临床治疗量一般为1×10⁶/kg，该实验参考国内外资料^[40-41]，设计并完成了新型永生化人肝细胞系HepZJ的临床前毒性实验，证实以HepZJ为治疗细胞的安全剂量至少为临床剂量的100倍左右，并充分评估了可能出现的毒副反应，使得以HepZJ为细胞材料在肝细胞移植、生物人工肝系统的临床应用更有安全保障，同时也为其他种类细胞系的体内毒性研究提供一个可参考的实验设计方法。然而，实验也存在不足之处，如急性毒性实验中，仅对大体标本异常的器官进行免疫组化检查，注射结束后剖检所获得的标本未行病理学检查，未能更加客观具体阐述动物炎症反应的靶器官及严重程度，长期毒性实验尚未开展等，这些都有待进一步完善和开展实验设计。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

永生化人肝细胞HepZJ的临床前急性毒性评价

Pre-clinical acute toxicity of an immortalized human hepatocyte cell line HepZJ

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