2.1  大鼠术后一般情况  动物麻醉清醒后当天即正常进食进饮，术后观察期内伤口愈合良好，无渗血渗液、感染、脓肿及窦道形成，无螺钉外露或脱出，术侧肢体无骨折、脱位，术后无动物异常死亡等。

2.2  两组血液指标检测结果  见表2。

两组术后肝功指标丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶及肾功能均未见明显异常。两组术后白细胞计数均较术前轻度升高，术后3 d实验组白细胞数计数达到峰值，与对照组比较差异无显著性意义(P=0.109)， 随着术后时间的延长，白细胞数值逐渐降低，接近术前水平。

实验组术后1 d的血沉轻微增高，术后3 d达高峰期，与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，随着术后时间的延长，血沉数值逐渐降低，直至接近术前水平。

实验组C-反应蛋白在术后1 d开始增高，术后3 d达到峰值，与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，随着术后时间的延长，C-反应蛋白数值逐渐降低，直至接近术前水平。

2.3  两组大体观察结果  实验组术后2周，胫骨前外侧植入区可吸收螺钉未见明显降解，表面有少量纤维组织覆盖，周围骨与软组织无明显炎症反应；术后1个月，螺钉质地变软，与骨质结合较为紧密，周围有少量软骨痂向中间爬行；术后3个月，可吸收螺钉继续降解，与自体骨质基本整合，难以分离；术后6个月，可吸收螺钉植入区周围有较多新生骨质长入，周围组织无异常反应增生，见图2。

对照组术后2周可见骨缺损区域明显血肿填充，早期纤维骨痂形成；术后1个月，纤维骨痂骨化变硬，骨小梁沿周边向中心爬行；术后3个月，硬骨痂形成，骨缺损进一步修复；术后6个月，骨缺损区域有较多新骨长入，修复基本完成，见图3。

2.4  两组影像学观察结果  实验组术后2周于小鼠胫骨中段可见一类圆形低密度影，边缘光滑，未见周围骨质异常反应；术后1个月可见类圆形低密度影，范围缩小且变模糊，边缘有少许硬化；术后3个月，低密度影的范围进一步缩小，周围骨质仍未见异常反应；术后6个月，类圆形低密度影仍可见，但轮廓模糊，有新生骨长入，周围未见异常骨溶解、骨化等表现，见图4。

对照组术后2周可见边界清晰的类圆形低密度影；术后1个月可见类圆形低密度影，范围模糊；术后3个月，类圆形低密度影范围明显模糊缩小，有新生骨长入；术后6个月可见新骨重塑基本完成，见图5。

2.5  实验组组织学观察结果  

苏木精-伊红染色：术后2周，超声可吸收螺钉与宿主骨界面清晰，未见周缘骨小梁向材料内部长入，材料表面见纤维组织增生包裹；术后1个月，超声可吸收螺钉周边表面可见极少量降解，于宿主骨交界面内可见新生骨痂组织形成；术后3个月，超声可吸收螺钉少部分降解，降解区域内可见新生骨组织形成；术后6个月，新生骨组织的骨小梁进一步分化成熟，见图6。

Masson染色：术后2周，超声可吸收螺钉周界可见呈浅蓝色的少量新生骨小梁组织；术后1个月，骨小梁出现生长爬行至材料内部的趋势；术后3个月，超声可吸收螺钉进一步降解，骨小梁趋于成熟；术后6个月，材料降解区域内可见大量新生骨组织形成，材料孔隙结构破坏，由骨组织替代，材料与自体骨整合良好，见图7。

外消旋聚乳酸(poly-D-L-lactic acid，PDLLA)作为一种新型的高分子可吸收材料，具有良好的生物安全性和组织相容性，被广泛应用于医学领域，尤其适用于关节内骨折的治疗^[1-2]。但是PDLLA可吸收螺钉的强度弱于传统金属螺钉，术中螺钉拧入困难及螺钉断裂、术后早期螺钉松动等风险相对较大^[3-5]，虽然临床上术后可用外固定制动三四周以维持稳定性，但是术后关节粘连、僵硬的发生率高达10%-40%^[6-7]。因此，目前PDLLA可吸收螺钉还不能完全满足临床上治疗骨折的需要。为了增加可吸收螺钉的初始固定强度，作者所在研究团队根据PDLLA玻璃化温度低的特点引入超声焊接技术^[8-9]，研制了新型治疗肢体骨折的超声焊接装置和配套使用的PDLLA可吸收螺钉。通过超声聚焦局部产热融化螺钉后，聚乳酸分子渗入周围松质骨的骨小梁内，进而形成一种不同于传统螺钉的三维把持效果，将传统的螺纹-加压-摩擦的力学固定模式变为三维渗透把持固定^[10]，理论上比传统的拧入式PDLLA可吸收螺钉具有更好的初始固定强度。但是，超声作用下PDLLA物理性状改变对材料安全性的影响尚不清楚，并且高强度超声作用于可吸收螺钉时对周围局部组织的机械振荡和热损伤是否在机体可耐受的范围内也需要进一步实验验证。因此，实验通过观察超声辅助下PDLLA可吸收螺钉植入后大鼠机体的炎症反应和可吸收螺钉的降解吸收情况，评价该材料的生物安全性和组织相容性，为进一步的研究提供生物安全性和组织相容性依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  随机分组动物体内观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年3至9月在四川大学华西医院科技园动物实验楼完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  24只健康雄性SD大鼠，平均体质量(304±15) g，8周龄，由四川大学华西基础医学实验动物中心提供，许可证号：2019011A。实验已获得四川大学华西医院动物伦理审查中心批准。

1.3.2  主要实验器械和试剂  超声辅助PDLLA可吸收螺钉，直径1.6 mm，购自广州市弘健生物医用医药制品科技有限公司，见表1；超声骨焊接固定系统包括超声波发生器、超声焊极、直径1.6 mm环形骨钻，购自广州市弘健生物医用医药制品科技有限公司；TBA-120FR全自动生化分析仪(T0SHIBA，日本)；Leica RM2235切片机(徕卡，德国)；光学显微镜 Olympus CX31(奥林巴斯，日本)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物模型的制备  将24只SD大鼠随机分为实验组和对照组，每组12只，称质量后编号。按3-8 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液全身麻醉，待动物麻醉后固定于手术台鼠板上。剪去右下肢毛发，皮肤备皮，碘伏消毒，穿无菌手术衣，带无菌手套，铺巾。纵向切开右小腿皮肤2.0-3.0 cm，锐性切开皮下组织显露胫骨外侧肌肉，纵向切开肌肉至骨膜，用小号骨膜剥离器仔细剥离骨膜，暴露胫骨。生理盐水冲洗后，用直径1.6 mm骨钻头缓慢钻入胫骨一侧，钻入深度约4 mm，尽量保证骨髓完整。生理盐水冲洗缺损区，去除残留骨渣和边缘残留骨碎片。实验组将直径为1.6 mm的PDLLA可吸收螺钉固定于胫骨前方的骨缺损处，启动超声发生器(频率38 kHz，功率40 W，温度70 ℃)，将可吸收螺钉固定入所钻孔中，钉体完全进入钉道后作用1.0-2.0 s即可移开超声波探头，完成螺钉植入过程(图1)。冲洗创面，逐层缝合伤口。术后实验动物自由活动，不进行干预。对照组不植入任何材料，关闭伤口后患肢，采取制动措施。

1.4.2  术后处理  大鼠麻醉清醒后即正常饲养，于术后3 d常规肌内注射青霉素4×10⁴ U/d，预防切口感染，注意观察伤口有无渗血深液、缝线滑脱、螺钉脱出，观察动物进食、精神及活动情况。

1.5  主要观察指标  各组动物术后1，3，7，14 d及2，4，6，8周抽尾静脉血，进行血常规、血生化、血沉、C-反应蛋白检测。术后2周、1个月、3个月、6个月分别处死各组大鼠3只，取术区包含造模区的一段胫骨进行大体观察及组织学切片观察。

大体观察：术后2周、1个月、3个月、6个月处死大鼠后，切开右下肢软组织，观察软组织有无炎症出血等情况，取出右侧胫骨观察超声螺钉位置、颜色、形态及与周围组织的相容性。

影像学观察：在处死大鼠前，对大鼠进行全麻处理，对胫骨缺损处进行数字化X射线摄影(DR)，检测骨缺损区域形状、面积、密度变化情况及有无异常固化。

组织学观察：以样本术区中心最大径选取包含周围正常组织在内的大小为10 mm×10 mm×5 mm的组织块，立即经40 g/L多聚甲醛通用型组织固定液保存2 d，再用生理盐水冲洗标本表面多聚甲醛，纱布擦干后经10%EDTA中脱钙4-8周。标本经EDTA脱钙后再用乙醇梯度脱水、晾干、浸蜡及人工包埋制作石蜡块。Leica RM2235组织切片机行组织切片，经苏木精-伊红及Masson染色后行形态学观察。组织切片制备与观察由四川大学华西医院病理科完成。

1.6  统计学分析  使用SPSS 25.0统计软件分析，分别对两组术后1各观察点检测值均数进行单因素方差分析(one-way ANOVA)及两两比较，P ≤ 0.05时为差异有显著性意义。

传统金属内固定物虽然固定强度大，但是存在以下难点尚未突破：第一，材料在体内无法降解，部分材料可能需要二次手术取出；第二，高硬度的钢板会产生应力遮挡效应，不利于骨折的后期愈合和骨再生；第三，可能造成植入物周围软骨的损伤^[11-15]。为解决上述问题，可吸收内固定材料的相关研究逐渐为越来越多的学者所关注，而公认的理想可吸收内固定物应该具有以下几点优势：无体内毒副作用；具有良好的组织相容性；弹性模量与人体骨相近；体内可逐渐降解，避免二次手术取出；对射线无干扰，方便术后复查^[16-17]。

聚乳酸能够合成多种不同构型的高分子可吸收材料，包括PDLLA、左旋聚乳酸、右旋聚乳酸和内消旋聚乳酸等。其中右旋聚乳酸合成难度大；内消旋聚乳酸在合成后易水解，难以提纯；左旋聚乳酸虽然力学强度大，但是脆性高，体内降解需要5-7年，且会出现由高结晶度引发的严重组织反应，限制了其应用推广。相比之下，PDLLA的安全性和性能更优，已经市场化地应用于临床治疗。并且PDLLA价格相对较低，体内降解迅速，一般6个月后降解显著，12-18个月即可在体内完全吸收，与生理性骨再生进程相近，是目前较为理想的可吸收内固定材料，具有广泛的应用和研究前景^[13，17-21]。

PDLLA材料具有低温下可塑形的特性，在50-60 ℃的温度范围内即达到玻璃化转变温度，降温后又重新恢复强度^[8]。超声辅助技术正是通过作用于PDLLA螺钉的探头在局部产生高温，螺钉熔化后在声波的振动作用下流入孔道内，融化后的材料可以适应任何形状的孔道及渗入周围松质骨的骨小梁内，进而形成一种不同于传统螺钉的三维把持效果^[10]。但众所周知，超声作为一种能量的载体，在作用于材料的同时也可能造成机体组织的损伤，这种损伤主要包括热损伤和振动损伤，可导致周围组织细胞蛋白质变性、细胞坏死、甚至组织破碎等^[22]。虽然超声波发生器可以将超声能量聚集到一点且超声作用时间短暂，理论上能最大程度地减少的机体组织损伤，但其安全性需要在实验中进一步加以验证。

目前，超声焊接技术已经在口腔颌面外科取得了一定的应用。RICHLAND等^[23]率先应用超声辅助技术成功治疗了小儿下颌骨发育不全，平均延长长度达到9.9 mm，与传统的移位下颌骨后不进行任何干预相比，具有防治下颌骨回移的优势。MCLEOD等^[24]应用超声辅助可吸收内固定治疗5例下颌骨髁突骨折患者，治疗效果满意，未出现围术期并发症或内固定不稳等问题，仅1例患者出现与材料吸收有关的术后伤口部位轻度肿胀，但不需要任何处理。ABDELGALIL等^[25]采用超声辅助可吸收固定板和螺钉成功的对1例粉碎性髁突骨折患者实行了骨折固定，治疗效果满意。LEE等^[26]使用超声辅助内固定治疗13例颧上颌部骨折，与22例传统内固定手术相比治疗效果相当，并减少约30 min的手术时长。陈犹白等^[27]应用超声骨焊接技术治疗面中部骨折患者93例，与100例应用传统可吸收内固定装置相比具有成功率高、术后并发症少、操作简单的优势。由于口腔颌面为非负重部位骨，不需要承受大的应力，与肢体骨折固定模式差异性较大，所以其所用的螺钉规格和超声波发生器型号均与此次实验不同，而在此之前并无超声可吸收装置用于关节周围骨折的研究报道。而且目前市面上所销售的超声可吸收螺钉均为进口产品，费用昂贵，而此次所使用的器械材料均为国产，可以显著降低成本。但是由于国产的PDLLA可吸收螺钉在此之前从未作用于超声下，所以超声技术结合国产可吸收PDLLA螺钉的安全性和组织相容性需要加以验证。

实验组大鼠术后1周的白细胞、血沉、C-反应蛋白等血液学指标较术前明显升高，但与对照组相比升高并不明显，无统计学差异，且随着时间的增加逐渐回落至正常。

组织学切片显示螺钉与骨界面整合良好，骨组织未见异常病理反应，说明术后两组早期炎性指标的升高主要是由机体对手术创伤的应激引起。尽管实验组的血液学指标比对照组稍高，但是没有统计学差异，而组织学切片也没见明显病理变化，提示该现象可能是由内固定植入操作刺激机体引起的正常炎症反应，而非材料本身和超声引起的异常组织损伤所致。NEUMANN等^[28-32]以羊为实验动物，在下颌骨或股骨等部位构建骨缺损模型，通过超声辅助技术植入可吸收内固定材料后评估超声对周围组织的损伤情况，术后没有观察到明显炎症或感染迹象，组织学见可吸收内固定材料周围出现正常活跃的骨组织，未见组织细胞损伤或其他明显病理改变，这与此次实验结果一致。ARNOLDI等^[33]也报道了类似的研究结果，其在家兔双侧股骨远端内侧构建骨缺损模型，分别以高强度超声辅助可吸收内固定、低强度超声辅助可吸收内固定、传统内固定填补骨缺损及未填充空白对照处理，术后组织学均未见骨及周围组织明显损伤，这可能是由于超声产热作用时间短，可吸收材料在植入后迅速冷却凝固，组织受热时间不足所致^[34]。ARNOLDI等^[33]在使用超声聚焦产热时温度达到了180-190 ℃，远比此次实验所使用的70 ℃要高，从这个角度看此次实所使用的超声焊接装置与配套PDLLA螺钉更加安全。

局部大体标本和影像学的变化表明，骨小梁的形成与材料降解是同步进行的，虽然相比较对照组缺损的修复速度较慢，但这可能是由于可吸收螺钉作为一种填充材料其占位效应在一定程度上影响了缺损的修复。除此之外，PDLLA可吸收螺钉材料的亲水性较差，组织细胞不容易黏附，并且其降解产物偏酸性，影响细胞的生长等也可能影响骨组织再生^[35]。但实验组骨愈合延迟是否有超声作用的参与有待于进一步验证。

实验的局限性在于：①实验动物样本量较少，没有设计传统内固定植入的动物分组，没有办法对比分析内固定材料在体内占位效应对机体骨愈合的影响，没有直接对比机体对不同内固定方法的炎症反应与骨修复情况；②只选择在大鼠胫骨干制造骨缺损模型，而不能进一步评估高强度超声对植入材料周围软骨的影响。CARVALHO、MEAD等^[36-37]认为术中钻孔或可吸收内固定材料熔化时所产生的热量可能引起植入材料周围软骨的损伤。但是NEUMANN等^[38]在羊股骨内髁处构造骨软骨骨折动物模型，通过超声辅助可吸收材料重新固定骨软骨碎片，与传统可吸收材料和钛金属材料相比并未造成更严重的软骨损伤。目前高强度超声对植入材料周围软骨的影响尚存在争议，这也需要进一步的实验研究加以确认。

植入材料的评价包括安全性和功能性评价，安全性评价应当包括体外安全性评价和体内安全性评价。随着动物实验替代方法逐渐成为趋势，体外实验代替动物体内实验来评价材料的安全性也越来越多的被采用，这些方法可以显著节省资源的投入^[39-40]。而且随着分子微观领域研究的进展，安全性评价也向着更微观的领域迈进，可以通过微观因子的变化预测机体的反应。实验主要是验证超声辅助材料的生物安全性和体内相容性，所以并未选择极限骨缺损模型，理论上给大鼠自体骨缺损修复带来了可能，但实验也基本证实了超声辅助PDLLA可吸收螺钉的生物安全性和组织相容性，但骨愈合延迟是否有超声作用的参与有待于进一步验证。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

玻璃化转变温度：外消旋聚乳酸等高分子聚合材料的物理性质，比如形变、模量、比容、密度等易受到温度的影响，而使材料从刚性玻璃态转变为易发生形变高弹态时的温度称为玻璃化转变温度。一般外消旋聚乳酸的玻璃化转变温度较低，在50-60 ℃。

超声辅助：更详细地说是超声聚焦产热或超声焊接辅助技术，与常说的超声辅助定位技术不同，该技术以超声波作为能源，通过声波聚焦和热能转化迅速提高局部温度，并且温度参数、作用时间易于控制，操作简便。实验中通过该技术达到外消旋聚乳酸材料的玻璃化转变温度后使其熔化形变，聚乳酸分子更容易与周围松质骨结构结合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

超声辅助植入外消旋聚乳酸等可吸收材料理论上可提高外消旋聚乳酸初始固定强度，减少固定松动、螺钉断裂等风险，但是目前主要应用于口腔颌面骨等非负重部位，在此之前并无超声可吸收装置用于关节周围骨折的研究报道。因此，该技术应用于肢体负重骨骨折的安全性和有效性仍有待研究证实。研究团队研制新型的治疗肢体骨折的超声焊接装置和配套使用的外消旋聚乳酸可吸收螺钉，建立大鼠胫骨骨缺损模型，结合大体标本、血清学、影像学及组织学多方面综合评价超声作用下国产外消旋聚乳酸可吸收螺钉在体内的生物安全性和组织相容性。 

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程