永生化鼠牙囊细胞成骨特异基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：牙囊细胞体外培养时易丧失自我更新能力、发生老化，且纯化非常困难，难以实现大量扩增，制约了其在牙周组织工程中的研究应用。
目的：探讨永生化对鼠牙囊细胞成骨效应的影响。
方法：利用脂质体介导含有SV40T-Ag的质粒pSSR69-pAmpho转染293细胞，取病毒上清液感染鼠牙囊细胞，潮霉素筛选，建立永生化的鼠牙囊细胞，以未转染细胞作为对照组。利用RT-PCR检测两组鼠牙囊细胞成骨相关因子碱性磷酸酶、骨钙素、骨形态发生蛋白2、Runx2的表达。
结果与结论：实验组与对照组鼠牙囊细胞成骨相关因子骨形态发生蛋白2、Runx2、碱性磷酸酶基因表达差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组骨钙素基因表达高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明在永生化鼠牙囊细胞分化晚期可促进骨钙素的分泌使成骨细胞提早进入骨钙化阶段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 鼠牙囊细胞, 永生化, 成骨效应, 成牙骨质效应

Abstract:

BACKGROUND: During in vitro culture, dental follicle cells are easy to loss self-renewal capacity and become aging, and they are also very difficult to be purified and amplified in quantity, which limits the application of dental follicle cells in periodontal tissue engineering.
OBJECTIVE: To study the osteogenic effect of immortalized rat dental follicle cells.
METHODS: pSSR69-pAmpho plasmids containing SV40T-Ag were used to transfect 293 cells. Rat dental follicle cells were transfected with virus supernatant and screened by hygromycin to establish immortalized rat dental follicle cells (experimental group). Untransfected cells served as controls. RT-PCR was used to detect the osteogenic related factors (alkaline phosphatase, osteocalcin, bone morphogenetic protein 2, and Runx2) in the experimental group and control group.
RESULTS AND CONCLUSION: The results showed no statistical differences between the experimental group and the control group in the expressions of alkaline phosphatase, bone morphogenetic protein 2 and Runx2 (P > 0.05). The expression of osteocalcin was significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). These findings suggest that in the late osteogenesis differentiation, immortalized rat dental follicle cells may promote the secretion of osteocalcin and then make osteoblasts early entry into the bone calcification stage.

全文链接：

Key words: Dental Sac, Cells, Gene Expression

中图分类号:

R394.2

郑鸿. 永生化鼠牙囊细胞成骨特异基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 130-134.

Zheng Hong. Expression of osteoblast-specific genes in immortalized rat dental follicle cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 130-134.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Hou LT, Liu CM, Chen YJ, et al.Characterization of dental follicle cells in developing mouse molar.Arch Oral Biol. 1999; 44(9):759-770.
[2] Owen TA, Aronow M, Shalhoub V,et al.Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix.J Cell Physiol. 1990;143(3):420-430.
[3] Handa K, Saito M, Tsunoda A,et al.Progenitor cells from dental follicle are able to form cementum matrix in vivo. Connect Tissue Res. 2002;43(2-3):406-408.
[4] Kémoun P, Laurencin-Dalicieux S, Rue J,et al.Localization of STRO-1, BMP-2/-3/-7, BMP receptors and phosphorylated Smad-1 during the formation of mouse periodontium.Tissue Cell. 2007;39(4):257-266.
[5] Zhao M, Xiao G, Berry JE,et al.Bone morphogenetic protein 2 induces dental follicle cells to differentiate toward a cementoblast/osteoblast phenotype.J Bone Miner Res. 2002; 17(8):1441-1451.
[6] Yao S, Norton J, Wise GE.Stability of cultured dental follicle cells.Cell Prolif. 2004;37(3):247-254.
[7] Avilion AA, Piatyszek MA, Gupta J, et al. Human telomerase RNA and telomerase activity in immortal cell lines and tumor tissues.Cancer Res. 1996;56(3):645-650.
[8] Ouyang H, Mou LJ, Luk C,et al.Immortal human pancreatic duct epithelial cell lines with near normal genotype and phenotype.Am J Pathol. 2000;157(5):1623-1631.
[9] Pollock K, Stroemer P, Patel S,et al.A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.Exp Neurol. 2006;199(1): 143-155.
[10] Eldridge SR, Martens TW, Sattler CA,et al.Association of decreased intercellular communication with the immortal but not the tumorigenic phenotype in human mammary epithelial cells.Cancer Res. 1989;49(15):4326-4331.
[11] Kamata N, Fujimoto R, Tomonari M,et al.Immortalization of human dental papilla, dental pulp, periodontal ligament cells and gingival fibroblasts by telomerase reverse transcriptase.J Oral Pathol Med. 2004;33(7):417-423.
[12] 杨尊,刘婷,郑鸿,等.SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后相关生物学特性初步研究[J].华西口腔医学杂志,2013,31(1): 4-7.
[13] Sharma GG, Gupta A, Wang H,et al.hTERT associates with human telomeres and enhances genomic stability and DNA repair.Oncogene. 2003;22(1):131-146.
[14] Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M,et al.Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 1998;279(5349):349-352.
[15] Kitagawa M, Tahara H, Kitagawa S,et al.Characterization of established cementoblast-like cell lines from human cementum-lining cells in vitro and in vivo.Bone. 2006;39(5): 1035-1042.
[16] Saito M, Handa K, Kiyono T,et al.Immortalization of cementoblast progenitor cells with Bmi-1 and TERT.J Bone Miner Res. 2005;20(1):50-57.
[17] Foddis R, De Rienzo A, Broccoli D,et al.SV40 infection induces telomerase activity in human mesothelial cells. Oncogene. 2002;21(9):1434-1442.
[18] Weinreb M, Shinar D, Rodan GA.Different pattern of alkaline phosphatase, osteopontin, and osteocalcin expression in developing rat bone visualized by in situ hybridization.J Bone Miner Res. 1990;5(8):831-842.
[19] Owen TA, Aronow M, Shalhoub V,et al.Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix.J Cell Physiol. 1990;143(3):420-430.
[20] Hauschka PV, Lian JB, Gallop PM.Direct identification of the calcium-binding amino acid, gamma-carboxyglutamate, in mineralized tissue.Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(10): 3925-3929.
[21] King GJ, Keeling SD, Wronski TJ.Histomorphometric study of alveolar bone turnover in orthodontic tooth movement.Bone. 1991;12(6):401-409.
[22] 关键,程宗生,王健平,等.成骨细胞中Runx2对机械离心力刺激的响应[J].华西口腔医学杂志,2010,28(1):38-40.
[23] Gersbach CA, Byers BA, Pavlath GK,et al.Runx2/Cbfa1 stimulates transdifferentiation of primary skeletal myoblasts into a mineralizing osteoblastic phenotype.Exp Cell Res. 2004; 300(2):406-417.
[24] Boudreaux JM, Towler DA.Synergistic induction of osteocalcin gene expression: identification of a bipartite element conferring fibroblast growth factor 2 and cyclic AMP responsiveness in the rat osteocalcin promoter.J Biol Chem. 1996;271(13):7508-7515.
[25] Ducy P, Starbuck M, Priemel M,et al.A Cbfa1-dependent genetic pathway controls bone formation beyond embryonic development.Genes Dev. 1999;13(8):1025-1036.
[26] Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, et al.Osf2/Cbfa1: a transcriptional activator of osteoblast differentiation.Cell. 1997;89(5):747-754.
[27] Jüttner KV, Perry MJ.High-dose estrogen-induced osteogenesis is decreased in aged RUNX2(+/-) mice.Bone. 2007;41(1):25-32.
[28] Morsczeck C.Gene expression of runx2, Osterix, c-fos, DLX-3, DLX-5, and MSX-2 in dental follicle cells during osteogenic differentiation in vitro.Calcif Tissue Int. 2006;78(2):98-102.
[29] Morsczeck C, Schmalz G, Reichert TE,et al.Gene expression profiles of dental follicle cells before and after osteogenic differentiation in vitro.Clin Oral Investig. 2009;13(4):383-391.
[30] Pan K, Sun Q, Zhang J,et al.Multilineage differentiation of dental follicle cells and the roles of Runx2 over-expression in enhancing osteoblast/cementoblast-related gene expression in dental follicle cells.Cell Prolif. 2010;43(3):219-228.
[31] 郁卫东,秦书俭. 骨形态发生蛋白-2在骨形成过程中的作用机制[J].中国临床解剖学杂志,2000,18(1):82-83.
[32] Yamamoto N, Akiyama S, Katagiri T,et al.Smad1 and smad5 act downstream of intracellular signalings of BMP-2 that inhibits myogenic differentiation and induces osteoblast differentiation in C2C12 myoblasts.Biochem Biophys Res Commun. 1997;238(2):574-580.
[33] Noël D, Gazit D, Bouquet C,et al.Short-term BMP-2 expression is sufficient for in vivo osteochondral differentiation of mesenchymal stem cells.Stem Cells. 2004; 22(1):74-85.
[34] Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A,et al.BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation.J Biol Chem. 2008;283(43):29119-29125.
[35] Kémoun P, Laurencin-Dalicieux S, Rue J,et al.Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell Tissue Res. 2007;329(2):283-294.

引言

鼠牙囊细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞和成牙骨质细胞，具有成骨及成牙骨质的特性，是牙周组织改建的基础。其向成骨细胞分化早期诱导碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原酶的表达^[1]，分化进入矿化期后可合成分泌骨钙素^[2]。碱性磷酸酶在成骨过程中水解磷酸酯，为羟基磷灰石的沉积提供必要的磷酸。骨钙素与钙离子及羟基磷灰石结合，形成骨沉积。另外，其还可向成牙骨质细胞方向分化^[3]，并产生类牙骨质样基质。在牙根形成过程中，骨形态发生蛋白2在前成牙骨质细胞中表达^[4]，这表明骨形态发生蛋白2与牙囊细胞成牙骨质分化具有一定的相关性。且Zhao等^[5]研究表明骨形态发生蛋白2可诱导鼠牙囊细胞向成牙骨质细胞方向分化。

然而，鼠牙囊细胞体外培养易丧失自我更新能力、发生老化，且纯化非常困难，难以实现大量扩增，制约了其在牙周组织工程中的研究应用^[6]。近来许多研究将细胞进行无限增殖^[7-9]，从而为科学研究提供足够多的细胞，无限增殖的细胞即永生化细胞。1989年Eldridge等^[10]首次将体细胞永生化并保持了原细胞的特性且未产生癌变倾向。而部分细胞在永生化后其特性会产生变化。Kamata等^[11]研究发现通过hTERT将成纤维细胞永生化后虽具有碱性磷酸酶的表达但不具有矿化的能力，这与成纤维细胞的特性不一致。

有研究证实永生化后牙囊细胞的成骨能力可能会增强^[5]，有利于人牙周组织工程的研究，并且为后期相关实验提供足够数量的牙囊细胞。本实验拟通过SV40T-Ag将鼠牙囊细胞永生化，探讨永生化对鼠牙囊细胞成骨效应的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：简单随机化设计的动物实验。

时间及地点：于2011年5月至2012年3月在重庆医科大学生命科学研究院实验室完成。

材料：

实验动物：新生六七天SD乳鼠20只，SPF级，体质量20-24 g，雌雄不拘，由重庆医科大学实验动物中心提供。

实验方法：

鼠牙囊细胞分离培养^[12]：采用酶消化法与组织块法结合培养原代鼠牙囊细胞并传代建立有限鼠牙囊细胞系，通过差速贴壁法分离纯化鼠牙囊细胞得到较纯的牙囊细胞。

鼠牙囊细胞的永生化^[12]：利用脂质体介导含有SV40T-Ag的质粒pSSR69-pAmpho转染293细胞，取病毒上清液感染第3代鼠牙囊细胞，潮霉素筛选，建立永生化的鼠牙囊细胞系。

Westen Blot检测鼠牙囊细胞的端粒酶活性：以永生化后第30代大鼠牙囊细胞为实验组，第3代正常大鼠牙囊细胞为对照组进行端粒酶活性检测。用预冷的PBS清洗细胞，提取蛋白质于-20 ℃保存。上样50 μg进行电泳，转膜，去除气泡，同时保持胶的湿润。将其放入电泳槽，胶面向阴极，然后放入充满缓冲液的缓冲槽，4 ℃电泳过夜后取出，弃胶。将膜放入染液中快速染色，然后放置于封闭液中，37 ℃下摇晃4 h。5%的脱脂奶粉脱色摇床上洗膜15 min，封TRT一抗(1∶400)4 h，封二抗(1∶2 000)2 h，洗膜，显影。应用Image tool V3.0图像分析软件进行图像分析。

细胞处理及样品收集：以永生化后第30代牙囊细胞为实验组，第3代牙囊细胞为空白对照组。消化后接种于96孔板(接种细胞浓度为1×10⁸ L^-¹)，培养于加有矿化诱导液(1×10⁸mol/L地塞米松，50 mg/L β-甘油磷酸钠，10 mmol/L维生素C)的培养基中诱导其骨向分化。

成骨特异基因的RT-PCR检测：于第6天提取细胞总RNA，反转录获得cDNA，按反转录试剂盒说明书，在冰盒中配置20 μL合成体系，加入1 μL cDNA为模板进行扩增。采用RT-PCR法检测两组细胞内的碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2、骨形态发生蛋白2的基因表达。各引物系列见表1。

RNA提取及RNA质量检测：将细胞收集后，移入1.5 mL EP管中，加1 mL TRNzol，冰上裂解20 min，加氯仿1/5体积(0.2 mL)，漩涡振荡混匀；4 ℃，15 000×g离心5 min；转上层水相(约400 μL)于另一1.5 mL EP管中；加等体积异丙醇(约400 μL)，振荡混匀；4 ℃，15 000×g离心20 min；弃上清，加冰预冷的体积分数为75%乙醇1 mL；4 ℃，15 000×g离心5 min；弃上清，加无水乙醇1 mL；4 ℃，15 000×g离心5 min；弃上清，空气干燥5-10 min；溶于40 μL 0.1% DEPC水中，-70 ℃保存待用。

取2 μL RNA稀释50倍，紫外分光光度计测定260 nm/280 nm处吸光度值比值，所得结果乘以50，为RNA实际浓度。

所提RNA进行琼脂糖凝胶电泳，先制胶后电泳：100 mL TAE缓冲液中加入1 g琼脂糖，微波炉中加热溶解，溶解后冷至60 ℃，加入5 μL EB染料，倒入已插入梳子的制胶槽中，待其冷却凝固后待用。将所提RNA取1 μg电泳，5 V/1 cm电泳。

反转录合成cDNA：按反转录试剂盒说明书，在冰盒中按下列组成配置20 µL合成体系：RNA 2 μg，5×RT Buffer 4.0 μL，RNA Ace 0.5 μL，Rnase Inhibitor 0.5 μL，dNTPs 2.0 μL，Oligo(dT) 1.0 μL，补0.1%DEPC水至20.0 μL。反应条件：94 ℃--5 min→(94 ℃--30 s→57 ℃--30 s→ 72 ℃--30 s)×30 cycles→72 ℃--10 min。

主要观察指标：RT-PCR法检测两组细胞内的碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2、骨形态发生蛋白2的基因表达。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。所有计量资料用x(_)±s表示，两组间的比较采用t 检验，多组间比较则采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

3.1 端粒长度 端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，它的长度和稳定性决定了细胞的寿命。人们发现在体外培养的细胞中随着细胞的老化端粒的长度逐渐变短，而人端粒酶反转录基因激活便可以维持细胞增殖过程中端粒的长度^[13]。Bodnar等^[14]首次将人端粒酶反转录基因转染入人体细胞，延长了细胞的寿命。Kitagawa等^[15]使用人端粒酶反转录基因转染成功将成牙骨质细胞及牙周韧带细胞永生化。Saito等^[16]成功通过Bmi-1和人端粒酶反转录基因将鼠牙囊细胞永生化成功并发现永生化后牙囊细胞可分化为成牙骨质细胞且行使分泌牙骨质功能。本研究利用SV40T-Ag将牙囊细胞永生化发现端粒长度增长，端粒酶活性被激活，这些均与Foddis等^[17]的研究一致。

3.2 永生化后鼠牙囊细胞中碱性磷酸酶及骨钙素合成分泌的变化碱性磷酸酶及骨钙素是成骨细胞分化过程中产生的相关蛋白^[18]，而有研究指出碱性磷酸酶在成骨分化的早期即大量出现^[1]，骨钙素是成骨分化的晚期指标^[19]。在体液环境中碱性磷酸酶将有机磷酸酯水解并释放磷离子致钙盐沉积，是细胞向成骨细胞分化趋势的早期标志。骨钙素亦称γ-羧基谷氨酸蛋白(γ-carboxyglutamate acid-containing protein)，1975年由Hauschka等^[20]发现。1991年King等^[21]研究正畸牙齿移动过程中发现在骨形成的高峰，血清骨钙素浓度增加。而鼠牙囊细胞在成骨分化早期的特点就是碱性磷酸酶活性的高度表达。本实验中实验组与对照组牙囊细胞碱性磷酸酶指标差异无显著性意义，而骨钙素指标差异有显著性意义。这可能与牙囊细胞早期向成骨细胞分化过程中均要分泌大量碱性磷酸酶有关。而骨钙素是在成骨细胞分化的晚期，即成骨细胞骨形成钙化期形成，这表明永生化可能加快了骨钙素的分泌使成骨细胞提早进入骨钙化阶段。

3.3 永生化后鼠牙囊细胞中成骨相关因子Runx2的变化 目前已证实Runx2基因是成骨细胞分化的特异性转录因子^[22]，在成骨细胞分化中起着关键作用。Runx2与成骨细胞作用特异性元素(OSE)结合可激活骨钙素、骨桥蛋白(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、Ⅰ型胶原等转录和表达从而促进成骨分化^[23]。激活蛋白1(AP-1)是Runx2的结合位点，而Boudreaux等^[24]研究发现FGF2正是通过AP-1激活骨钙素的转录。Ducy等^[25]通过研究Runx2缺陷的小鼠发现Runx2在小鼠出生后扮演了骨形成的重要角色。Ducy等^[26]将Runx2嵌入cDNA并结合成骨细胞作用特异性元素，发现在骨骼的发育过程中Runx2首先在间充质细胞中表达。另外，Runx2控制成骨分化受其他多种因素影响，如细胞因子、细胞外基质、激素、机械力等。已有学者证实，Runx2作为成骨特异性转录因子可被细胞外基质激活通过MAPK信号转导通路将信号传入核内促进成骨相关标志蛋白的合成分泌。Juttner等^[27]研究发现激素可促使Runx2的转录，并增加前成骨细胞的数量。

Morsczeck等^[28]通过RT-PCR检测体外细胞实验发现在成骨分化过程中骨髓间充质干细胞Runx2有所改变，而牙囊细胞Runx2的表达则不变。Morsczeck等^[29]研究牙囊细胞在成骨分化前后相关基因的表达发现成骨相关特异性基因Runx2持续表达。Pan等^[30]研究牙囊细胞分化发现Runx2水平的增加可使牙囊细胞成骨及成牙骨质相关基因的表达上调。本实验采用RT-PCR检测鼠牙囊细胞永生化后相关成骨基因的表达，发现Runx2表达有所增加，但与对照组比较牙囊细胞的表达差异无显著性意义。这表明牙囊细胞永生化后作为Runx2特异性转录因子的特性不受其他因素影响，保留了原有特性。

3.4 永生化后鼠牙囊细胞骨形态发生蛋白2合成分泌的变化 骨组织形成过程中有多种因素控制，而骨形态发生蛋白2是惟一能单独诱导骨形成的一种因子，且其诱导作用较强。有研究证实骨形态发生蛋白2具有促使成骨细胞、软骨细胞及成牙骨质细胞的分化功能^[31]。骨形态发生蛋白2通过Smad1蛋白传递信号与Smad4和Smad5蛋白结合，以及其他基因能上调Runx2基因的转录^[32]，直接及间接促进间充质干细胞成骨方向分化^[33]。另外，Matsubara等^[34]发现骨形态发生蛋白2与Runx2对细胞成骨方向分化具有协同作用，相比较单独的一种基因增加几倍的效果。2007年Kémoun等^[35]利用骨形态发生蛋白2刺激牙囊细胞，使其获得了成牙骨质细胞的特性。

本实验通过PCR检测发现实验组牙囊细胞与对照组牙囊细胞骨形态发生蛋白2指标变化差异无显著性意义。这表明永生化后牙囊细胞具有成骨及成牙骨质分化的特性，但其作用与正常牙囊细胞无异。