2.1  实验动物数量分析  实验选择幼兔20只，分为2组，实验过程2组各死亡1只，18只进入结果分析。

2.2  两组基本数据比较  实验组和对照组幼兔体质量[(992.73±3.78) g，(993.52±4.96) g]及死亡率相比差异无显著性意义，说明组间具有可比性。

2.3  兔臀肌组织病理学改变  8周后处死动物发现：所有组在注射后均有局部肿胀，臀肌注射部位有硬结形成，对照组的标本剖面发现有大片出血、坏死病灶，病灶方向与肌纤维走行基本一致，周围肌肉失去正常弹性，范围几乎达到整块臀肌。而接受推拿的实验组9只臀肌仅有散在小片状坏死病灶，性状与对照组类似。

2.3.1  苏木精-伊红染色  见图1。实验组可见少量炎性细胞，部分肌纤维可见规则的明暗交替的横纹图中可见肌纤维细胞核呈扁椭圆形，异染色质较少，染色较浅，位于肌浆的周边即肌膜下方。而对照组可见少量炎性细胞，大量密集的胶原纤维，排列不规则。实验组1级1只、2级6只、3级2例共9只；对照组3级4只、4级5只共9只，行统计学比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3.2  Masson染色  见图2。实验组以肌纤维为主，中间夹杂少许蓝染的胶原纤维。而对照组有大片胶原纤维蓝染，略呈一定方向排列，周围有正常红色肌纤维。

2.3.3  天狼星红染色  见图3。实验组以肌纤维为主，组织间隙内不规则胶原纤维形成。而对照组大片组织呈纤维化改变，胶原纤维致密，按一定方向规则排列；再用偏光显微镜观察，提示胶原纤维主要为Ⅰ型胶原蛋白(纤维染色后呈橙黄色)。

2.4  兔臀肌组织中转化生长因子β1的表达

2.4.1  RT-PCR检测  图4A。实验组的转化生长因子β1呈低表达，对照组呈高表达，统计学比较差异有显著性意义(P < 0.000 1)。

2.4.2  Western-blot检测  图4B，C。实验组的转化生长因子β1呈低表达，对照组呈高表达，统计学比较差异有显著性意义(P=0.009)。

2.4.3  免疫组织化学染色  与实验组相比，对照组的转化生长因子β1呈现高表达状态(P < 0.05)，见表1，图5。

臀肌挛缩症是各种因素导致臀肌坏死、局部纤维化、瘢痕增生的一类疾病，患者的髋关节活动受限、骨骼发育畸形，导致他们无法完成并脚下蹲、跷二郎腿、侧卧等日常动作，给患者的身心造成巨大困扰。该病最早由VALDERRAMA于1969年发现，并将其定义为一种肌肉注射后导致的医源性疾病，一开始报道的例数不多，之后则在全世界多个国家陆续出现相关报告，如韩国、印度、伊拉克、波兰、乌干达和美国等，最新的文献认为，该疾病的流行范围与经济发展水平有关，在医疗资源紧张的地区，臀肌挛缩症的发病率明显升高^[1]。在中国，臀肌挛缩症的病因主要是20世纪八九十年代肌肉注射“苯甲醇+青霉素”所致，为了缓解青霉素肌肉注射引起的疼痛，医护人员将其溶解于苯甲醇中，虽然取得了良好的止痛效果，但苯甲醇会导致局部肌肉坏死、胶原蛋白沉积，臀部正常的、有弹性的肌肉组织逐渐被无弹性的纤维结缔组织所替代，进而出现髋关节活动受限，成为注射性臀肌挛缩症，据调查显示患病率为10%-25.74%^[2-4]，给家庭和社会造成沉重负担，必须引起重视。许多文献表明，推拿能够有效治疗肌肉纤维化类疾病^[5-7]，如先天性肌性斜颈、放疗后的局部肌肉纤维化等，因此作者以幼兔臀肌挛缩模型为研究对象设计了该实验，以探讨推拿治疗对于臀肌挛缩症可能的治疗作用及相关机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年4月至2018年10月在北京大学香港科技大学医学中心完成。

1.3  材料  20只新西兰大白兔幼兔，四五周龄，体质量   1 kg，清洁级，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2019-0035，饲养于深圳北京大学香港科技大学医学中心动物实验中心(屏障环境)。随机分为实验组和对照组2组，每组10只，两组均给予青霉素钠+苯甲醇注射(无麻醉下注射)，实验组给予推拿治疗，对照组不做其他处理。实验中对动物的处置符合相关规定。

1.4  实验方法

1.4.1  臀肌挛缩的造模方法  参考李海峰^[8]的方法建立臀肌挛缩兔模型，取幼兔的臀部肌肉丰富的部位进行肌肉注射，2组每次均在双侧臀部肌注2%苯甲醇注射液2 mL+注射用青霉素钠20×10⁴ U，所用动物由专人在每天下午进行1次注射，连续8周。

1.4.2  推拿方案  实验组参考王宇峰等^[9]的方法，制定的推拿手法有3个步骤，由一位中医专业的推拿师负责操作。第1步：三指摩法，食指、中指、无名指3个手指自然伸直并拢，以3个手指的指腹附着于注射部位采用轻柔的逆时针摩法，频率120次/min，操作5 min；第2步：拇指推法，以拇指指腹沿着家兔臀部的肌肉走行，施以拇指平推法，频率60次/min，操作5 min；第3步：大鱼际揉法，以大鱼际揉注射部位，频率120次/min，操作5 min。上述治疗从第5周开始实施，频率为1次/d，5次为1疗程，疗程间休息2 d，共治疗4个疗程。

1.4.3  标本检测  在连续注射8周后，麻醉后空气栓塞法处死动物，以标记点为中心，在臀部肌肉组织病变范围内取材，并去除周围正常的肌肉组织，组织块大小约1 cm× 0.5 cm×0.5 cm。将标本用100 g/L的多聚甲醛溶液固定1周后，用体积分数80%，90%，100%，100%乙醇进行梯度乙醇脱水各1 h。进行苏木精-伊红染色、Masson染色及天狼星红染色后，在显微镜下观察组织病变情况。苏木精-伊红染色根据SZAPIEL等^[10]的方法，将纤维化程度分级，0级为无纤维化，1级为单个病灶的纤维组织增生，2级为2处纤维组织增生，3级为≥3处纤维组织增生，4级为大量成片的纤维组织增生。

(1)RT-PCR检测转化生长因子β1 mRNA的表达：按生产商提供的方案，使用Trizol试剂(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)，提取样品总mRNA，然后使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas, Vilnius, Lithuania)将其转化为cDNA。引物合成为锐博生物技术有限公司(广州，中国)。

以该cDNA作为PCR模板，使用转化生长因子β1引物(正向，5'-GGC CAG ATC CTG TCC AAG C-3'；反向，5'-GTG GGT TTC CAC CAT TAG CAC-3')；以及GAPDH引物(正向，5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'；反向，5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3')。所有靶序列均按以下程序扩增30-31个循环：94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 60 s。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，使用溴化乙锭染色，在290 nm激发下拍照，使用Quantity One软件(Bio-Rad, Hercules, CA)测量各条带强度。使用7900HT Real-time PCR系统(Applied Biosystems)及SYBR Green PCR master mix(Applied Biosystems)作实时PCR，反应体系20 μL，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，行40个循环(95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s)。执行解离程序，生成熔解曲线，以确认扩增的特异性。GAPDH作为内参基因，实验均作一式3份重复。

(2)免疫组织化学染色检测转化生长因子β1的表达：组织样品制备好后，包埋于石蜡块，然后切片。样品于37 ℃下过夜干燥，于二甲苯中脱蜡，使用梯度乙醇再水化，再于体积分数3%过氧化氢溶液中浸泡20 min以封闭内源性过氧化物酶活性。将载玻片于三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(pH 8.0)中煮沸10 min，作抗原修复。切片于室温下，用体积分数10%山羊血清孵育20 min，以封闭非特异性蛋白结合。再以转化生长因子β1抗体(1∶500)于37 ℃湿盒中封闭处理好的切片60 min，再使用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)漂洗5次×10 min后，使用二抗(1∶100)于37 ℃孵育30 min。2次用PBS漂洗后，用DAB(3，3-二氨基联苯胺)染色，观察免疫活性蛋白。

免疫组织化学染色半定量分析标准^[11]：(-)=无染色；(+)=弱染色，不超过最高染色强度的30%；(++)=中等强度染色，占比为最高染色强度的30%-60%；(+++)强染色，大于最高染色强度的60%。

(3)用Western blot法检测转化生长因子β1的蛋白表达：使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂(1 mmol/L phenylmethyl sulfonyl fluoride，0.1 mmol/L N-tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone，1 g/L aprotinin，1 g/L pepstatin，0.5 g/L leupeptin，1 mmol/L NaF，1 mmol/L Na₄P₂O₄，2 mmol/L Na₃VO₄)的改良的RIPA缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1% NP-40，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA)匀浆组织样本。裂解液于16 800×g(RCF =1.118 ×10^-5×N2 × R，N：14 800 r/min，R：7.5 cm) 4 ℃离心15 min，以除去细胞碎片。收集上清，并使用BCA蛋白测定法(Rockford，MA)测定其蛋白水平，然后取同样的蛋白量加入SDS上样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4% SDS，12% β-巯基乙醇，20%甘油和0.01%溴酚蓝)煮沸5 min。样本做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用含有10%脱脂牛奶和0.1% Tween 20的TBST缓冲液对PVDF膜做封闭处理，然后于4 ℃下一抗孵育过夜，多次TBST缓冲液清洗后，于室温下二抗孵育2 h。使用底物化学发光法(Amersham Pharmacia Biotech, USA)显示免疫反应蛋白，使用Quantity One软件(Bio-Rad，Hercules，CA)作光密度分析。

1.5  主要观察指标  ①兔臀肌细胞形态和结构变化；②臀肌组织中转化生长因子β1的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 13.0软件进行分析，体外进行的每个实验重复3次。所有数据均以x(_)±s表示，采用成组t检验，多组计量资料均数比较，采用单因素方差分析，多组等级资料比较采用非参数秩和检验，均以P < 0.05为差异有显著性意义。

在对臀肌挛缩症长期的研究过程中，学者们发现绝大多数患者有幼时频繁肌肉注射史，但是也有少部分人没有明显的注射史，这就促使人们寻找其他可能的病因，细胞因子的作用也就开始为人们所重视。目前研究的热点集中在转化生长因子β1、转化生长因子β3、热休克蛋白47上，研究表明上述几种细胞因子在臀肌挛缩症患者的病变组织中呈强阳性表达，是目前较为肯定的与组织纤维化有密切关系的几种细胞因子^[11-13]。其中，转化生长因子β1不仅可以增加胶原分泌，还可以通过上调其他多种细胞因子而间接地起到促进纤维化作用，与组织纤维化的关系更为密切^[14-20]。Smad蛋白家族处于转化生长因子β/Smad信号通路中的下游，在将转化生长因子β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，激活或抑制靶基因的转录^[21-32]。已有许多研究表明，转化生长因子β受体(TbR)Ⅰ和Ⅱ具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，可以促进受体调节型Smad(R-Smad)发生磷酸化，最终完成信号跨膜的过程^{[22，26，30，33-35]}。另有研究表明Smad2和Smad3是组织纤维化的重要因素，提示如果能够下调Smad2/3的磷酸化水平可能有助于抑制纤维化的病变过程^[36-37]。

在祖国医学文献中，臀肌挛缩分类应属于筋伤中的筋结、筋缩类。清代吴谦等编著的《医宗金鉴·正骨心法要旨》，对筋伤的诊断和手法治疗有了明确的记载。并提出了正骨八法，其中的“摸”法主要用于筋伤疾病的诊断，“推、拿、按、摩”等手法则主要用于治疗各种筋骨伤疾病。发展至今，中医学对推拿的研究已经深入到分子层次，研究表明推拿可使β-内啡肽含量显著升高，而5-羟色胺含量明显下降，产生镇痛效果^[38]。按摩也可以显著提高炎性疼痛模型大鼠的热疼痛阈值，升高炎症疼痛大鼠局部神经递质腺苷浓度，从而起到局部镇痛的作用^[39]。按摩联合针刺疗法可以减轻骨骼肌超微结构的损害和降低磷酸肌酸激酶，对运动型骨骼肌损伤具有保护作用^[40]。冯跃等^[6]发现按摩手法可以减少肌肉纤维增生及α-SMA的阳性表达，其他研究者也认为推拿能够减轻甚至逆转肌肉纤维化的过程^[41-42]。

在作者前期研究中发现，臀肌挛缩症患者的挛缩带中，除了Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白和转化生长因子β1高表达以外，R-Smad磷酸化和Smad4的表达水平明显升高，而Smad7减少，PAI-1的蛋白质和mRNA水平也出现明显升高，提示转化生长因子β/Smad信号通路在臀肌挛缩症的发病中起着重要作用^[43]。而在臀肌挛缩症的治疗方面，除手术外，作者对康复推拿进行了深入研究，根据中医手法和快速康复理念，设计了4步强化练功法^[44]，取得了良好疗效。另外，有研究者发现，推拿疗法可以影响急性软组织损伤家兔血清中神经递质的水平，从而起到镇痛效果^[9]。还有研究者发现尽早推拿或热敷可以有效降低肌肉注射黄体酮后局部硬结的发生率^[45]。

因此，此次研究提出早期推拿可以有效缓解臀肌的纤维化进程。苏木精-伊红染色作为基础的染色方法，缺乏特异性，仅能显示基本的病理变化。经典的显示结缔组织的染色方法有Masson染色和天狼星红染色。其中Masson染色是三色染色法，光镜下肌纤维、红细胞被丽春红染成红色，而胶原纤维被甲苯胺蓝染成蓝色或亮绿色。由于作者前期研究发现苯甲醇所致挛缩带中主要含Ⅰ型胶原蛋白，因此，此次研究还另采用了天狼星红染色来区分胶原类型。在普通光镜下能使胶原纤维染成红色，而非胶原纤维部分不见红色背景；在偏振光显微镜下，Ⅰ型胶原显示出很强的双折光性，为亮红色或强橙黄色；Ⅲ型胶原双折光性弱，为绿色^[46]。最终的研究结果表明，在经过推拿治疗的幼兔中，其臀部肌肉坏死、结缔组织增生的情况较对照组明显减轻。另外，未经推拿的对照组中Ⅰ型胶原蛋白合成增加和转化生长因子β1的表达显著上调。

此次研究的不足之处在于：①未设置正常肌肉组加以比较；②该研究的推拿方案是在动物造模未完全完成的时候开始应用的，而临床所见的臀肌挛缩症患者往往已经是注射若干年后才到医院就医，推拿对于这些患者是否有效还需要后续进一步的研究。

结论：总的来说，这项研究不仅证实了转化生长因子β1信号通路在臀肌挛缩症的发病过程中起着重要作用；而且发现推拿治疗可以有效缓解臀肌的纤维化进程，这些发现为臀肌挛缩症的机制研究和治疗提供了新的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

臀肌挛缩症：是各种因素导致臀肌坏死、局部纤维化、瘢痕增生的一类疾病，患者的髋关节活动受限、骨骼发育畸形，导致他们无法完成并脚下蹲、跷二郎腿、侧卧等日常动作。该病最早由Valderrama于1969年发现，并将其定义为一种肌肉注射后导致的医源性疾病，一开始报道的例数不多，之后则在全世界多个国家陆续出现相关报告。

天狼星红染色：原理利用胶原分子与强酸性染料天狼星红结合一起后加强双折光现象，使不同颜色和形态的胶原纤维得以区分。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

作者前期研究中发现，臀肌挛缩症患者的挛缩带中，除了I/Ⅲ型胶原蛋白和转化生长因子β1高表达以外，R-Smad磷酸化和Smad4的表达水平明显升高，而Smad7减少，PAI-1的蛋白质和mRNA水平也出现明显升高，提示转化生长因子β/Smad信号通路在臀肌挛缩症的发病中起着重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程