富血小板血浆联合髓芯减压调控激素性股骨头坏死模型兔氧化应激反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2583

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (11): 1677-1682.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2583

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富血小板血浆联合髓芯减压调控激素性股骨头坏死模型兔氧化应激反应

王哲，李炎，娄理想，陆川，丁启龙，顾锡龙，李泽清

青海大学附属医院创伤骨科，青海省西宁市 810000

收稿日期:2019-07-16 修回日期:2019-07-18 接受日期:2019-10-09 出版日期:2020-04-18 发布日期:2020-02-21
通讯作者: 李泽清，博士，副主任医师，青海大学附属医院创伤骨科，青海省西宁市 810000
作者简介:王哲，男，1991年生，河北省石家庄市人，汉族，青海大学在读硕士，主要从事骨外科学研究。
基金资助:
青海省自然科学基金(2018-ZJ-943Q)

Platelet-rich plasma combined with core decompression regulates oxidative stress in a rabbit model of steroid-induced femoral head necrosis

Wang Zhe, Li Yan, Lou Lixiang, Lu Chuan, Ding Qilong, Gu Xilong, Li Zeqing

Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, China

Received:2019-07-16 Revised:2019-07-18 Accepted:2019-10-09 Online:2020-04-18 Published:2020-02-21
Contact: Li Zeqing, MD, Associate chief physician, Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, China
About author:Wang Zhe, Master candidate, Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Qinghai Province, No. 2018-ZJ-943Q

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
激素性股骨头缺血性坏死：股骨头坏死又称股骨头无菌性坏死，或股骨头缺血性坏死，是由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的一种病变，激素性股骨头坏死就是因为长时间使用激素而引起的一种股骨头坏死。
氧化应激损伤：氧化应激指机体在遭受各种内源性或外源性刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。正常情况下机体内活性氧自由基的产生和清除处于动态平衡，有害刺激可以打破这种平衡，机体会形成氧化应激状态。

背景：氧化应激在股骨头坏死损伤中发挥重要作用，富血小板血浆富含生长因子，可以加快骨折愈合，配合髓芯减压术能促进非创伤性股骨头坏死的恢复。

目的：探讨富血小板血浆联合髓芯减压术能否通过Keap1/Nrf2/HO-1信号通路抑制兔激素性股骨头坏死模型氧化应激反应。

方法：将40只实验新西兰兔随机分为正常组、模型组、对照组和富血小板血浆组，每组10只。除正常组外其他3组兔在无菌环境下建立激素性股骨头坏死模型，术后4周向富血小板血浆组动物股骨头内髓芯减压后注射植入0.4 mL 3%的富血小板血浆，对照组兔只进行髓芯减压术治疗，对照组与模型组兔正常饲养。14周后苏木精-伊红染色观察各组兔股骨头骨髓腔内病理学变化和骨陷窝空缺率，检测各组兔血清中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽及丙二醛等氧化应激指标活性，TUNEL检测股骨头组织内骨细胞凋亡情况，免疫荧光检测股骨头组织内Keap1、Nrf2分布，Western Blot检测股骨头组织内Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达。实验方案经青海大学附属医院动物实验伦理委员会批准(批准号为qhdx-201908374)。

结果与结论：①与正常组相比，模型组骨组织内骨小梁变细，结构紊乱；对照组较模型组有所改善，骨小梁结构得到恢复，空骨陷窝减少(P < 0.05)，富血小板血浆组经富血小板血浆联合髓芯减压治疗较对照组得到进一步改善，骨小梁结构更加完善，空骨陷窝进一步减少(P < 0.05)，与正常组无显著差异(P > 0.05)；②模型组血清中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽的含量均显著低于正常组(P < 0.05)，而丙二醛浓度显著高于正常组(P < 0.05)；对照组以上指标稍有改善，但与模型组比较差异不显著(P > 0.05)；富血小板血浆以上氧化应激指标较模型组和对照组明显改善(P < 0.05)；③模型组股骨头组织内Keap1蛋白表达显著低于正常组(P < 0.05)，Nrf2、HO-1蛋白表达显著高于正常组(P < 0.05)；富血小板血浆组股骨头组织内Keap1的表达较模型组和对照组低(P < 0.05)，Nrf2、HO-1的表达显著高于模型组和对照组(P < 0.05)；④结果提示，富血小板血浆能有效抑制兔激素性股骨头坏死过程中氧化应激反应，该作用可能是通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路活性而发生的。

ORCID: 0000-0002-8371-2665(王哲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 富血小板血浆, 股骨头坏死, 氧化应激, Keap1/Nrf2/HO-1信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Oxidative stress plays an important role in femoral head necrosis. Platelet-rich plasma (PRP) contains growth factors that can accelerate fracture healing. PRP combined with core decompression can promote recovery from non-traumatic femoral head necrosis.

OBJECTIVE: To investigate whether PRP combined with core decompression can inhibit oxidative stress in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head model via Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway.

METHODS: Forty New Zealand rabbits were randomly divided into normal group, model group, control group and PRP group, with 10 rabbits in each group. In the model and PRP groups, a model of steroid-induced femoral head necrosis was established in a sterile environment. At 4 weeks after operation, the rabbits in the PRP group were injected with 0.4 mL of 3% PRP after core decompression. The control group received core decompression treatment, and the control and model groups were raised normally. After 14 weeks, the experimental animals were sacrificed. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of bone marrow cavity and the vacancy rate of bone lacunae in the femoral head of each group. Total antioxidant capacity, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, reduced glutathione, and malondialdehyde were detected. TUNEL was used to detect bone cell apoptosis in the femoral head. Immunofluorescence staining was used to determine the distribution of Keap1 and Nrf2. Western blot was used to measure Keap1, Nrf2, and HO-1 protein expression in the femoral head. Approval was obtained from the Animal Ethics Committee of the Affiliated Hospital of Qinghai University, approval No. qhdx-201908374.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the normal group, the trabecular bone in model group was thinned with structure disorder. Compared with the model group, the trabecular bone structure in control group was restored, and the number of vacant bone lacunae was reduced (P < 0.05). Compared with the control group, the animals treated with PRP combined with core decompression were further improved, the trabecular bone structure was further improved, and the number of vacant bone lacunae was further reduced (P < 0.05). Whereas there was no significant difference between the PRP group and normal group (P > 0.05). (2) The total antioxidant capacity and serum levels of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, and reduced glutathione in the model group were significantly lower than those in normal animals (P < 0.05), while the MDA concentration was significantly higher than that in the normal group (P < 0.05). These oxidative stress indexes were slightly improved in the control group compared with the model group (P > 0.05), while these indexes were significantly improved in the PRP group than the model and control groups (P < 0.05). (3) The expression of Keap1 in the model group was significantly lower than that of the normal group (P < 0.05), and the expression of Nrf2 and HO-1 protein was significantly higher than that of the normal group (P < 0.05). The expression of Keap1 in the PRP group was lower than that of the model and control groups (P < 0.05), and the expression of Nrf2 and HO-1 was significantly higher than that of the model and control groups (P < 0.05). Therefore, PRP can effectively inhibit oxidative stress in the process of steroid-induced femoral head necrosis, which may be caused by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Key words: platelet-rich plasma, femoral head necrosis, oxidative stress, Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway

中图分类号:

王哲, 李炎, 娄理想, 陆川, 丁启龙, 顾锡龙, 李泽清. 富血小板血浆联合髓芯减压调控激素性股骨头坏死模型兔氧化应激反应[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1677-1682.

Wang Zhe, Li Yan, Lou Lixiang, Lu Chuan, Ding Qilong, Gu Xilong, Li Zeqing. Platelet-rich plasma combined with core decompression regulates oxidative stress in a rabbit model of steroid-induced femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(11): 1677-1682.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰兔40只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组兔骨组织病理学变化见图1。正常组兔股骨头组织内骨小梁和骨细胞清晰，周围有大量成骨细胞，骨陷窝少，骨髓腔内有大量造血细胞，且形态正常；股骨头坏死模型组兔骨组织内骨小梁变细，间距变大，结构紊乱，部分骨小梁出现断裂，骨髓脂肪细胞增多，造血细胞减少，存在大量空骨陷窝；对照组兔较模型组有所改善，骨小梁结构得到恢复，空骨陷窝减少(P < 0.05)，造血细胞增多。经富血小板血浆联合髓心减压治疗的富血小板血浆组兔较对照组得到进一步改善，骨小梁结构更加完善，空骨陷窝进一步减少(P < 0.05)，与正常组差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 各组兔血清中氧化应激指标的水平 4个实验组的总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽分别比较，差异均有显著性意义[F_{总抗氧化能力}= 212.5，P < 0.000 1；F_{超氧化物歧化酶}=103.8，P < 0.000 1； F_{谷胱甘肽过氧化物酶}=218.8，P < 0.000 1；F_{还原型谷胱甘肽}=196.3，P < 0.000 1；F_丙二醛=159.3，P < 0.000 1]；其中，模型组兔血清中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽的水平均显著低于正常组(P < 0.05)，而丙二醛浓度显著高于正常组(P < 0.05)；对照组血清总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽的含量较模型组稍有升高，丙二醛浓度较模型组稍有降低，但差异无显著性意义(P > 0.05)；富血小板血浆组血清总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽的浓度均明显回升，显著高于模型组和对照组，同时，丙二醛浓度显著下调，低于模型组和对照组(P < 0.05)。见表1。

2.4 各组兔股骨头组织内细胞凋亡情况 4组间股骨头组织内细胞凋亡率差异有显著性意义(F=2 933.32，P < 0.000 1)，其中，模型组兔股骨头组织内细胞凋亡率显著高于正常组(P < 0.05)，对照组兔细胞凋亡率显著低于模型组(P < 0.05)，但仍高于正常组(P < 0.05)，富血小板血浆组兔股骨头组织内细胞凋亡率较模型组明显降低(P < 0.05)，与正常组差异无显著性意义(P > 0.05)。见图2。

2.5 免疫组织化学和Western Blot定量检测Keap1、Nrf2、HO-1的表达 4组间股骨头组织内Keap1、Nrf2、HO-1的表达差异均有显著性意义(F_(Keap1)=789.1，P < 0.000 1；F_(Nrf2)=549.2，P < 0.000 1；F_(HO-1)=1 272.2，P < 0.0001)，模型组兔股骨头组织内Keap1蛋白表达显著低于正常组 (P < 0.05)，Nrf2、HO-1蛋白表达显著高于正常组(P < 0.05)，对照组兔股骨头内Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达量与模型组差异无显著性意义(P > 0.05)，富血小板血浆组兔股骨头组织内Keap1的表达较模型组和对照组更低，Nrf2、HO-1的表达显著高于模型组和对照组(P < 0.05)。见图3，4和表2。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年8月至2019年4月在青海大学医学院实验室及动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康雄性新西兰兔40只，9至10周龄，体质量3.5-4.0 kg，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004，饲养于恒温恒湿环境。

1.3.2 主要实验试剂马血清(美国Hyclone公司)；甲泼尼龙琥珀酸钠(国药集团容生制药有限公司)；总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽和丙二醛检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；抗兔Keap1、Nrf2、HO-1 单克隆抗体(Santacruz公司)；Keap1、Nrf2、HO-1兔单克隆抗体、内参β-Actin兔单克隆抗体、荧光二抗(Cell Signaling公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组将40只实验动物随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、对照组和富血小板血浆组。

1.4.2 富血小板血浆制备采用PCCS kit法无菌提取富血小板血浆，具体过程为：取5.0 mL新西兰大耳白兔股静脉血加入预先放置10%枸椽酸钠抗凝剂的离心管中，离心 3 000 r/min，3 min 45 s，吸取上层血浆及血小板，再次离心，3 000 r/min，13 min，弃上层清液后与激活剂(凝血酶与10%CaCl₂的混合物)适当比例震荡，混匀，静置于4 ℃冰箱过夜，再离心，1 500 r/min，5 min，吸出上清液(即为富血小板血浆液)，调节至3%备用。

1.4.3 兔激素性股骨头坏死模型的建立采用改良的马血清联合激素造模法：将模型组、对照组和富血小板血浆组兔以10 mL/kg于兔耳缘静脉注射马血清，3周后再次以6 mL/kg注射马血清，第5周腹腔注射甲泼尼龙琥珀酸钠45 mg/kg，连续注射3 d，1次/d。随后1周内用青霉素常规治疗，预防感染。

1.4.4 给药途径和方法造模后第4周，对照组动物的两侧股骨头进行髓芯减压治疗，富血小板血浆组兔子的股骨头内髓芯减压后注射0.4 mL 3%富血小板血浆，每周注射1次，连续注射4周。正常组和模型组动物常规饲养。

1.4.5 组织取材治疗4周后，各组实验动物清晨采集耳缘静脉血2 mL，抽血前12 h禁食，10 h禁水，静置15 min后离心，分离上层血清。抽血后麻醉后处死动物，于无菌条件下取出双后肢股骨头，将其中一侧组织固定、包埋、切片，另一侧组织于-80 ℃条件下保存，以备后续实验使用。

1.4.6 苏木精-伊红染色检测组织病理学改变将股骨头组织切片进行苏木精-伊红染色，于400倍镜下从各切片中选取3个不重复区域，每个区域内选取骨陷窝50个，数出其中孔骨陷窝的数量，计算空骨陷窝率。每组实验独立重复3次。

1.4.7 血清中氧化应激指标的检测总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽，及丙二醛活性的检测采用相应试剂盒，按照说明书中指示步骤进行。每组实验独立重复3次。

1.4.8 TUNEL检测股骨头组织内凋亡细胞石蜡切片脱蜡，梯度乙醇洗涤，按照TUNEL试剂盒指示操作，显微镜下观察细胞凋亡情况。凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数。每个切片选取5个不重复的视野观察，取平均值。每组实验独立重复3次。

1.4.9 免疫组织化学检测股骨头组织内Keap1、Nrf2蛋白表达石蜡切片脱蜡，梯度乙醇洗涤，抗原修复，Keap1 (1∶100)，Nrf2(1∶50)，HO-1(1∶100)一抗孵育24 h(4 ℃)，二抗(1∶100)室温孵育2 h，DBA显色5 min，梯度脱水、封固。显微镜下观察并拍照，以黄棕色反应物为阳性，每张切片取5个互相不重叠的视野。Image-Pro Plus 6.0软件进行吸光度分析和图像分析处理。每组实验独立重复3次。

1.4.10 Western blot测股骨头组织内Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达研磨冻存组织，提取蛋白，离心取上清液，取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，加一抗，同时以GAPDH为内参，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，根据一抗种属加入相应二抗，室温孵育1 h，ECL显色，将胶片扫描后用Bandscan5.0软件进行蛋白灰度分析。每组实验独立重复3次。

1.5 主要观察指标 ①各组兔骨组织病理学变化；②各组兔血清中氧化应激指标的水平；③各组兔股骨头组织内细胞凋亡情况；④免疫组织化学和Western Blot定量检测Keap1、Nrf2、HO-1的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件包进行统计学处理。计量资料以x(_)±s表示，多组间定量资料的比较采用ANOVA，组内两两比较用LSD-t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前对于激素性股骨头坏死的发病机制存在多种假说，如脂质代谢受阻、凝血异常、微循环异常、氧化应激等，其中氧化应激机制在股骨头坏死中的作用已得到广泛证实^[12-14]。氧化应激是机体内抗氧化系统如超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶及还原型谷胱甘肽等防御能力下降，同时体内活性氧产生过多所造成的^[8^，^21]。有报道证实骨坏死可能由激素通过氧化应激反应产生，因为大量使用激素会导致机体氧化还原状态严重失衡，从而导致氧化应激发生，机体防御能力下降，增强了激素对骨骼系统的毒性作用，骨骼血液循环系统遭到破坏，最终导致股骨头坏死^[19-20]。同时，活性氧是细胞凋亡的重要介质，作用于凋亡途径中的各个环节。大量的文献报道机体内活性氧过量聚集会诱导不同类型的细胞发生凋亡^[22-23]。此次研究结果显示，激素性股骨头坏死模型组兔的血清内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽、总抗氧化能力浓度均显著低于正常组，而丙二醛浓度高于正常组，说明激素性股骨头坏死兔处于氧化应激状态，同时，与此趋势一致的是，模型组兔股骨头组织内细胞凋亡率显著高于正常组，这一现象与前期研究结果是相一致的。

Nrf2是调控细胞氧化应激损伤的关键性转录因子，正常生理状态下，Nrf2与Keap1结合，以复合体的形式存在于胞质内，此时Nrf2处于非活性状态，当细胞受到氧化损伤信号刺激时，Nrf2被激活进入细胞核内，启动下游HO-1的转录，增强细胞抗氧化能力^[24]，该信号通路在骨骼细胞的氧化应激、抗凋亡过程中发挥重要作用^[25-26]。此次研究中，发现模型组兔股骨头组织内Keap1蛋白的表达低于正常组兔，Keap1相对表达量的降低，释放激活了Nrf2，因此模型组Nrf2表达量高于正常组，继而激活下游抗氧化酶，使模型组HO-1的表达量显著增加。

髓芯减压术是早中期激素性股骨头坏死的胃肠手术，在激素性股骨头坏死的临床治疗中得到广泛应用。富血小板血浆近年来在股骨头坏死的临床治疗中得到重视并取得较好的预后效果，但其作用机制并未得到充分证实。有研究证实，髓芯减压联合富血小板血浆在治疗激素性股骨头坏死模型兔中能够对基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制因子起到积极的正性作用^[27]，能有效促进组织修复。另有研究证实富血小板血浆与骨髓间充质干细胞可调节骨形态发生蛋白2/Smads信号通路，促进股骨头骨细胞增殖，减少骨陷窝空缺率^[28]。鉴于氧化应激反应在激素性股骨头坏死发病机制中的重要作用，MARTINS等^[29]证实富血小板血浆能减少大鼠骨骼肌挫伤所致的氧化损伤，同时SEKERCI等^[30]报道富血小板血浆能抵抗大鼠卵巢实验性缺血再灌注过程中的氧化应激损伤。

此次研究中，探讨了富血小板血浆对激素性股骨头坏死过程中氧化应激损伤是否有抑制作用。结果显示，对照组动物仅进行髓芯减压术后，股骨头组织内病理变化较模型组同样得到改善，凋亡细胞比率较模型组显著减少，与模型组和对照组相比，富血小板血浆组股骨头内骨小梁结构进一步得到恢复，空骨陷窝明显减少，造血细胞显著增多，说明单纯的髓芯减压术和富血小板血浆髓芯减压术联用均能有效缓解激素性股骨头坏死的骨损伤；对照组血清内总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽和丙二醛浓度较模型组并无明显变化，而富血小板血浆组血清总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽的浓度较模型组和对照组均明显回升，丙二醛浓度明显下降，提示富血小板血浆能一定程度上恢复激素性股骨头坏死的抗氧化能力，同时，富血小板血浆组股骨头内凋亡细胞比例较模型组和对照组显著下降，可能与富血小板血浆减弱激素性股骨头坏死的氧化应激反应有关。为了进一步探讨富血小板血浆在激素性股骨头坏死中抗氧化应激的作用机制，进一步检测了各组动物股骨头组织中Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的变化，结果显示富血小板血浆有助于提高激素性股骨头坏死氧化应激应答的效果，富血小板血浆组股骨头组织内Keap1的表达较模型组进一步降低，更多的Nrf2被激活释放，进而进一步激活下游的抗氧化酶，使HO-1的表达上升，而单纯实行髓芯减压术的对照组并无此现象，以上实验结果说明富血小板血浆对股骨头组织内Keap1/Nrf2/HO-1信号通路有活化作用。

综上所述，富血小板血浆能有效抑制兔激素性股骨头坏死过程中氧化应激反应，该作用可能是通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路活性而发生的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富血小板血浆联合髓芯减压调控激素性股骨头坏死模型兔氧化应激反应

Platelet-rich plasma combined with core decompression regulates oxidative stress in a rabbit model of steroid-induced femoral head necrosis

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