2.1  实验动物数量分析  实验选取雄性SD大鼠39只，分为4组。其中安静对照组和运动组共15只，在整个实验过程中无脱失，全部纳入实验结果进行分析；剩余24只大鼠用于2型糖尿病建模，舍去4只血糖未达到成模标准的大鼠后，剩余20只全部纳入实验结果进行分析。

2.2  有氧运动对2型糖尿病大鼠基础指标的影响  对照组和运动组、糖尿病组和糖尿病运动组在运动前的各项基础指标均无显著差异。与对照组相比，2型糖尿病组大鼠体质量、血清胰岛素水平和胰岛素敏感性指数均显著降低(P < 0.01，P < 0.05)，空腹血糖和胰岛素抵抗指数显著升高(P < 0.01)。有氧运动干预4周后，糖尿病组与糖尿病运动组大鼠的体质量、空腹血糖和血清胰岛素均无显著差异，但糖尿病运动组大鼠胰岛素抵抗指数显著降低(P < 0.01)，同时胰岛素敏感性指数也具有升高趋势(P=0.105)，见表1。

2.3  有氧运动对2型糖尿病大鼠肌萎缩的影响  肌萎缩蛋白MAFbx免疫组织化学染色结果显示：糖尿病组大鼠比目鱼肌胞浆中MAFbx广泛表达(图1箭头处)，糖尿病运动组大鼠比目鱼肌胞浆中MAFbx分布明显少于糖尿病组，见图1。统计肌纤维平均横截面积结果显示：与安静对照组相比，糖尿病组大鼠比目鱼肌肌纤维平均横截面积显著下降(P < 0.01)，运动组大鼠比目鱼肌肌纤维平均横截面积显著上升(P < 0.01)；与糖尿病组相比，糖尿病运动组大鼠比目鱼肌肌纤维平均横截面积显著上升(P < 0.01)，见表2。

2.4  有氧运动对2型糖尿病大鼠AMPK、PGC-1α的影响 与安静对照组相比，糖尿病组大鼠比目鱼肌中AMPK和PGC-1α的蛋白表达水平显著降低(P < 0.01，P < 0.05)，见图2，运动组大鼠比目鱼肌中AMPK和PGC-1α的蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)；与糖尿病组相比，糖尿病运动组大鼠比目鱼肌中AMPK的蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)，而PGC-1α的蛋白表达水平无显著差异。

2.5  有氧运动对2型糖尿病大鼠MuRF1和MAFbx的影响  与安静对照组相比，糖尿病组大鼠比目鱼肌中MuRF1和MAFbx的蛋白表达水平显著升高(P < 0.01)，见图3，运动组大鼠比目鱼肌中MuRF1和Atrogin-1/MAFbx的蛋白表达水平显著升高(P < 0.01，P < 0.05)；与糖尿病组相比，糖尿病运动组大鼠比目鱼肌中MuRF1和Atrogin-1/MAFbx的蛋白表达水平显著降低(P < 0.01)。

在2型糖尿病的发展进程中，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase，AMPK)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactiva-tor-1，PGC-1)信号通路受到抑制、线粒体能量代谢功能障碍，导致脂肪堆积、炎性因子增加，最终激活泛素-蛋白酶体蛋白水解途径，其中肌肉萎缩F盒蛋白(MAFbx)和肌肉环指蛋白1(MuRF1)是2个肌肉特异性泛素E3连接酶，在骨骼肌萎缩疾病中广泛表达，最终导致骨骼肌体积减小和质量降低^[1-3]。

研究发现，虽然有氧运动对蛋白质合成影响较小^[4]，但在2型糖尿病、癌症等以分解代谢为主要特征的疾病中，却对蛋白质分解系统具有较好的抑制作用^[5]。高前进等^[6]的研究显示4周跑台运动能通过抑制骨骼肌线粒体自噬水平、提高2型糖尿病大鼠的骨骼肌含量。此外，有氧运动的应用价值还表现在对线粒体功能和能量代谢调节方面，长时间低强度有氧运动能显著提高机体AMPK和PGC-1α的蛋白表达水平^[7]、改善血脂代谢及降低机体炎症反应^[8-10]，提示有氧运动在改善2型糖尿病线粒体功能障碍和肌萎缩方面具有重要的应用前景。但关于有氧运动对2型糖尿病环境下线粒体及其AMPK调节通路的影响，以及有氧运动通过AMPK调节2型糖尿病肌萎缩的机制研究尚未见报道。

因此，实验采用高脂饲养联合腹腔注射链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型，探究有氧运动对2型糖尿病肌萎缩的影响，以及AMPK和PGC-1α在其中的调节作用，以期为有氧运动调节线粒体功能、改善2型糖尿病肌萎缩和代谢障碍提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机分组对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2016年8月至2017年6在北京体育大学运动与体质健康教育部重点实验室内完成。

1.3  材料  健康6周龄雄性SPF级SD大鼠35只，体质量(214.1±7.7) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。实验已于2016-06-25通过北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准(批准号：2016014)。饲养和训练均于北京体育大学实验动物房内完成。饲养环境：湿度相对值为45%-55%，室温为20-24℃，12 h/12 h循环昼夜照明，分笼饲养，每笼4只，自由进食和饮水。

高脂饲料购于北京华阜康生物科技股份有限公司(H10045)，饲料能量比：脂肪60%、碳水化合物20%及蛋白质20%。

1.4  实验方法

1.4.1  动物建模与运动方案  SD大鼠35只适应性饲养1周后，随机取15只大鼠给予普通饲料饲养9周；剩余20只大鼠给予高脂饲料饲养9周。高脂饲养大鼠在9周饲养后间隔3 d连续腹腔注射2次链脲佐菌素(25 mg/kg)，普通饲养大鼠腹腔注射相应量枸橼酸钠缓冲液。链脲佐菌素注射后1周取大鼠尾静脉血测空腹血糖浓度。参考Srinivasan等^[11]将空腹血糖≥11.1 mmol/L作为建模标准，剔除不成模大鼠，最终得到2型糖尿病模型大鼠20只，建模率为83.3%。将普通饲养大鼠随机分为安静对照组(n=6)和运动组(n=9)；将2型糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(n=8)和糖尿病运动组(n=12)。

分别对运动组和糖尿病运动组进行4周运动干预，所有运动大鼠先进行3 d适应性跑台训练。正式运动方案：坡度-5°，跑速16 m/min，60 min/d，5 d/周，共4周^[12]。

1.4.2  采样与取材  分别在运动前后取大鼠禁食12 h后的尾静脉全血用于血糖测试，离心血液得血清用于胰岛素测试。运动后称质量，腹腔注射体积分数10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血；分离比目鱼肌，取肌腹位置肌肉切成约0.5 cm×0.3 cm×0.3 cm的长块，放入盛有OCT的方盒中，在液氮预冷的异戊烷中固定后包裹锡纸存放至-80 ℃冰箱保存，用于切片制备；剩余肌肉以锡纸包裹后直接至于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白提取和检测。

1.4.3  血样测试  血糖仪测定空腹血糖浓度，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清胰岛素水平，并以此计算大鼠胰岛素抵抗和敏感性指数。胰岛素抵抗指数=血清胰岛素(IU/L)×空腹血糖浓度(mmol/L)/22.5；胰岛素敏感性指数=1/空腹血糖浓度(mmol/L)×血清胰岛素水平(mIU/L)。

1.4.4  免疫组织化学染色  制作厚度为8 μm的切片并保存，切片在使用前于4 ℃预冷的40 g/L多聚甲醛中固定  10 min，1×PBS(pH 7.4)冲洗3次×5 min，体积分数5%羊血清封闭20 min，加MAFbx兔多克隆一抗(1∶200)后于湿盒内4 ℃孵育过夜，复温10 min，1×PBS冲洗3次×5 min，加兔多克隆二抗(1∶300)室温孵育40 min，1×PBS冲洗3次×5 min，DAB显色3-5 min，显微镜观察到棕色沉淀后流水冲洗10 min，苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化后流水冲洗10 min。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜拍片。观察MAFbx分布，计算肌纤维平均横截面积。

1.4.5  Western blot蛋白分析  比目鱼肌组织经剪碎、匀浆、裂解后，离心(14 000 r/min，10 min)取上清，进行BCA法蛋白定量，加样缓调整蛋白浓度，煮沸变性蛋白后按   10 μL/孔上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后将蛋白后转移到硝酸纤维素膜上，将膜放入封闭液(体积分数5% BSA)中常温封闭2 h，分别加入封闭缓冲液稀释的一抗室温孵育30 min后4 ℃过夜(β-actin，1∶5 000；AMPK，  1∶1 000；PGC-1α，1∶1 000；MuRF1，1∶1 000；MAFbx，1∶1 000)，室温TBST 摇洗10 min×3 次，加入二抗室温孵育2 h(1∶5 000)，TBST摇洗10 min×3次。ECL超敏发光检测液涂抹，X射线胶片曝光后显影、定影、扫描，IPP 6.0软件分析目的条带和内参的吸光度值，以目的条带吸光度值/β-Actin条带吸光度值作为目的条带的蛋白相对含量值。

1.5  主要观察指标  运动前后各组大鼠体质量、血糖、血清胰岛素水平，运动后各组大鼠比目鱼肌中MAFbx分布和肌纤维平均横截面积情况，运动后各组大鼠比目鱼肌中AMPK，PGC-1α，MuRF1及MAFbx的蛋白表达情况。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0软件进行数据统计，数据以x(_)±s表示。组间数据比较采用单因素方差分析和SNK检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

3.1  有氧运动对2型糖尿病大鼠基础代谢指标的影响  有氧运动疗法作为控制2型糖尿病的重要方法，对2型糖尿病患者的血糖、血脂、内皮功能、身体成分、胰岛素敏感性和生活质量等方面均有重要影响^[13-15]。一项前瞻性研究表明，仅通过增加体力活动，肥胖2型糖尿病患者的体质量、糖化血红蛋白水平和代谢机能就均能得到良好控制^[16]。最新的一项Meta分析显示，有氧运动可以更好地控制2型糖尿病患者的糖化血红蛋白水平、增加能量的消耗，在改善血脂代谢的同时还能减轻机体因肥胖而导致的慢性炎症反应^[17]。因此，与抗阻运动相比，有氧运动可以使2型糖尿病患者获得更多的运动收益^[18-19]。实验同样发现，有氧运动能在一定程度上减轻2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗程度、提升胰岛素敏感性；但这种作用与大鼠体质量、血糖和胰岛素的改善关系不大，提示有氧运动改善2型糖尿病代谢障碍可能更多是通过增加外周骨骼肌组织对能源物质的摄取和利用效率来发挥作用。

3.2  有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌AMPK和PGC1α的影响  线粒体功能障碍线粒体功能障碍将导致活性氧产生增加、氧化应激升高^[20，21]，进一步导致的慢性炎症反应、脂肪堆积和能量代谢障碍是2型糖尿病发生发展的重要原因；而有氧运动通过恢复线粒体功能是维持机体代谢稳态的关键要素^[22]。WANG等^[23]的研究表明，有氧运动通过Toll样受体4介导的胞外信号调节AMPK信号通路，降低2型糖尿病小鼠模型血清中炎症因子的表达水平，进而调节血脂并降低胰岛素抵抗。AMPK是机体质量要的能量感受器，运动、能量限制、肌肉收缩等刺激均可导致细胞内AMP/ATP比值发生变化，当这种变化达到一定程度时，AMPK将被激活，活化的AMPK可直接磷酸化PGC-1α的Thr177和Ser538位点，继而通过一系列的作用途径促进线粒体合成、调节能量代谢等功能^[24]。KAUPPINEN等^[25]最新的研究还表明，AMPK和PGC-1α的升高可以抑制核转录因子κB的表达，进而促进氧化代谢和炎症的分解。LIU等^[2]的研究同样显示，中等强度有氧运动通过上调AMPK/PGC1α信号通路，能在一定程度上抑制核转录因子κB表达，并降低其对泛素连接酶系统的激活，提示AMPK/PGC-1α信号通路可能是有氧运动控制炎症性骨骼肌萎缩的治疗靶点。在实验中，2型糖尿病大鼠比目鱼肌中线粒体功能障碍，AMPK/PGC-1α信号通路受到明显抑制，而规律的有氧运动干预可以有效激活正常大鼠AMPK/PGC-1α信号通路关键蛋白表达水平，但对于糖尿病大鼠来说，有氧运动只能激活AMPK活性，而对PGC-1α活性无明显影响，提示在2型糖尿病环境下，有氧运动对线粒体功能的激活线粒仍存在一定阻碍。

3.3  有氧运动对2型糖尿病大鼠肌萎缩的影响  由慢性炎症引起的泛素-蛋白酶体蛋白水解途径的激活是2型糖尿病骨骼肌萎缩的发病的重要机制，而有氧运动对过度激活的蛋白质分解系统的抑制作用是其防治肌萎缩疾病的重要依据^[4，25-27]。传统观念认为，抗阻运动比有氧运动在维持骨骼肌质量方面更有效，其主要是通过激活雷帕霉素及其下游信号通路来增加蛋白质的合成；而有氧耐力运动对雷帕霉素活性和蛋白质合成没有明显影响^[4]。因此，有氧运动对骨骼肌质量的影响较小，其主要作用在于提高机体有氧能力、氧化酶活性和代谢能力^[28]。但在实验中，规律的有氧运动可以明显抑制2型糖尿病大鼠的骨骼肌萎缩程度，这主要与有氧运动抑制2型糖尿病过度表达的泛素蛋白酶体关键因子MAFbx和MuRF1的表达有关。在正常情况下，有氧运动对蛋白质分解系统的抑制作用对增加骨骼肌质量的贡献很小^[5]，但在2型糖尿病肌萎缩等分解系统占主导因素的环境下，抑制蛋白质的分解系统就能对维持骨骼肌质量起到重要作用^[13]。OSTLER等^[29]的研究报道，2型糖尿病小鼠模型骨骼肌中的蛋白降解标记物-多泛素化蛋白水平显著升高，中等强度的有氧运动可以提高糖尿病小鼠的糖耐量和运动能力，同时减少蛋白质降解的标记物，但对肌肉重量无明显影响。LIU等^[2]的研究进一步表明，有氧运动通过降低炎症反应、抑制核转录因子κB信号通路从而发挥对泛素蛋白酶体的抑制作用。AKAGAWA等^[30]对2型糖尿病骨骼肌萎缩大鼠进行6周持续有氧运动干预发现，有氧运动通过刺激骨骼肌细胞的增值分化并抑制蛋白分解系统基因的表达，在治疗早期就能有效改善大鼠骨骼肌纤维横截面积。实验结果与上述研究基本一致，综合表明有氧运动对过度激活的蛋白分解的有效抑制是减缓2型糖尿病肌萎缩的的重要原因。

3.4  结论和局限性  骨骼肌中AMPK/PGC1α表达降低与MAFbx和MuRF1表达升高是导致2型糖尿病肌萎缩的重要原因，4周有氧运动通过激活AMPK/PGC1α的活性、下调MAFbx和MuRF1的表达，进而有效抑制2型糖尿病肌萎缩现象、改善2型糖尿病代谢障碍。实验设计仅分析了有氧运动对AMPK和PGC1α表达水平的影响，以及其对MAFbx和MuRF1表达的可能调控作用，后续研究将继续深入探究有氧运动对骨骼肌炎症反应和肌萎缩调控分子的作用，以便更好地解释运动改善炎症性肌萎缩的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)：是生物能量代谢调节的关键分子，AMPK在低氧、缺血、运动和营养缺乏等条件下易被激活，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心因子。

肌萎缩：宏观上表现为肌肉体积和质量的降低，微观上表现为肌纤维数目或直径减少。骨骼肌是摄取和利用葡萄糖的重要组织，肌萎缩的发生将增加2型糖尿病等代谢性疾病的发病风险。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

实验探究有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌萎缩的影响，以及AMPK/PGC-1α在其中的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程