2.1   软骨细胞形态   分离培养的原代软骨细胞呈圆球形，悬浮于培养液中；接种后12 h开始贴壁，24 h后细胞逐渐展开变平，边缘出现突起，可见伪足伸出；培养3 d后大部分细胞贴壁，增殖迅速，胞核清晰，有1个或2个核仁；约7 d单层铺满整个培养皿底面，可进行传代。传代后细胞贴壁较快，约5 d即可传代，细胞呈明显铺路石状外观。

传代细胞在4代以内时，细胞形态均与原代细胞相类似，而第4代后细胞逐渐变为长梭形。传代至第4代，部分细胞变为长梭形，出现不规则形细胞，第5代后梭形细胞开始大量出现，呈纤维细胞样外观，第6代后细胞基本呈不规则形，见图1。白细胞介素1β刺激24 h后，部分软骨细胞由椭圆形或圆形逐渐变为长梭形，部分细胞膜完整性被破坏，见图2。







2.2   甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色结果   软骨细胞爬片经甲苯胺蓝染色后，细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色，清晰可见1个或2个核仁，细胞外基质为淡蓝色，见图3A。Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色可见细胞质被激发出绿色荧光，细胞核经DAPI染色后被激发出蓝色荧光，见图3B，C，表明分离培养的细胞表达特征性Ⅱ型胶原，符合软骨细胞的生物学特征。

软骨细胞给予体外冲击波干预后，细胞核经DAPI染色显示蓝色荧光，细胞质呈现绿色荧光，细胞状态良好，见图4。



2.3   体外冲击波对软骨细胞活力的影响    CCK-8结果显示，与对照组比较，白细胞介素1β组细胞活力明显下降(P < 0.001)；与白细胞介素1β组比较，白细胞介素1β+体外冲击波组细胞活力明显升高(P < 0.001)，见图5。



2.4   体外冲击波对软骨细胞增殖的影响   与白细胞介素1β组相比，白细胞介素1β+体外冲击波组软骨细胞增殖能力显著提高，见图6。



2.5   体外冲击波对软骨细胞自噬相关基因Beclin 1、P62、Atg5、LC3 mRNA表达的影响   与对照组相比，白细胞介素1β组软骨细胞Beclin 1、Atg5、LC3 mRNA表达显著下调(PBeclin 1 < 0.001，PAtg 5 < 0.001，PLC3 < 0.001)，P62 mRNA表达上调(P < 0.001)。与白细胞介素1β组相比，白细胞介素1β+体外冲击波组软骨细胞的Beclin 1、Atg5、LC3 mRNA表达显著上调(PBeclin 1 < 0.001，PAtg 5 < 0.001，PLC3 < 0.001)，P62 mRNA表达下调(P < 0.001)，见图7。

[1] SHEN J, ABU-AMER Y, O’KEEFE RJ, et al. Inflammation and epigenetic regulation in osteoarthritis. Connect Tissue Res. 2017;58(1):49-63. [2] MARTEL-PELLETIER J, BARR AJ, CICUTTINI FM, et al. Osteoarthritis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16072. [3] 陈浩雄,徐启良,黄竞杰,等.牛膝总皂苷体外干预膝关节炎软骨细胞增殖与凋亡的研究[J].现代中西医结合杂志,2021,30(22):2400-2404. [4] ZHOU ZB, HUANG GX, FU Q, et al. circRNA.33186 Contributes to the Pathogenesis of Osteoarthritis by Sponging miR-127-5p. Mol Ther. 2019; 27(3):531-541. [5] MURATA R, NAKAGAWA K, OHTORI S, et al. The effects of radial shock waves on gene transfer in rabbit chondrocytes in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 2007;15(11):1275-1282. [6] MA F, LI G, YU Y, et al. MiR-33b-3p promotes chondrocyte proliferation and inhibits chondrocyte apoptosis and cartilage ECM degradation by targeting DNMT3A in osteoarthritis. Biochem Biophys Res Commun. 2019;519(2): 430-437. [7] RACANELLI AC, KIKKERS SA, CHOI AMK, et al. Autophagy and inflammation in chronic respiratory disease. Autophagy. 2018;14(2):221-232. [8] LÓPEZ DE FIGUEROA P, LOTZ MK, BLANCO FJ, et al. Autophagy activation and protection from mitochondrial dysfunction in human chondrocytes. Arthritis Rheumatol. 2015;67(4):966-976. [9] BOUDERLIQUE T, VUPPALAPATI KK, NEWTON PT, et al. Targeted deletion of Atg5 in chondrocytes promotes age-related osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2016;75(3):627-631. [10] LUO P, GAO F, NIU D, et al. The Role of Autophagy in Chondrocyte Metabolism and Osteoarthritis: A Comprehensive Research Review. Biomed Res Int. 2019; 2019:5171602. [11] CARAMÉS B, TANIGUCHI N, OTSUKI S, et al. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(3):791-801. [12] JI Q, WANG P, HE C. Extracorporeal shockwave therapy as a novel and potential treatment for degenerative cartilage and bone disease: Osteoarthritis. A qualitative analysis of the literature. Prog Biophys Mol Biol. 2016;121(3):255-265. [13] WANG CJ. Extracorporeal shockwave therapy in musculoskeletal disorders. J Orthop Surg Res. 2012;7:11. [14] CACCHIO A, GIORDANO L, COLAFARINA O, et al. Extracorporeal shock-wave therapy compared with surgery for hypertrophic long-bone nonunions. J Bone Joint Surg Am. 2009;91(11):2589-2597. [15] WANG CJ, SUN YC, WONG T, et al. Extracorporeal shockwave therapy shows time-dependent chondroprotective effects in osteoarthritis of the knee in rats. J Surg Res. 2012;178(1):196-205. [16] WANG CJ, WENG LH, KO JY, et al. Extracorporeal shockwave therapy shows chondroprotective effects in osteoarthritic rat knee. Arch Orthop Trauma Surg. 2011;131(8):1153-1158. [17] ZHAO X, LI Y, LIN X, et al. Ozone induces autophagy in rat chondrocytes stimulated with IL-1β through the AMPK/mTOR signaling pathway. J Pain Res. 2018;11:3003-3017. [18] 孙盼盼,赵旭,林小雯,等.医用臭氧对大鼠骨关节炎软骨细胞中 PPARγ及自噬水平表达的影响[J].山东大学学报(医学版),2020,58(6):14-21. [19] QI H, JIN S, YIN C, et al. Radial extracorporeal shock wave therapy promotes osteochondral regeneration of knee joints in rabbits. Exp Ther Med. 2018; 16(4):3478-3484. [20] 綦惠,杰永生,郑蕊,等.放散式体外冲击波对软骨细胞生物学行为的影响[J].北京生物医学工程,2020,39(3):278-284. [21] LIU Q, WANG S, LIN J, et al. The burden for knee osteoarthritis among Chinese elderly: estimates from a nationally representative study. Osteoarthritis Cartilage. 2018;26(12):1636-1642. [22] NEOGI T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2013;21(9):1145-1153. [23] JOHNSON VL, HUNTER DJ. The epidemiology of osteoarthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2014;28(1):5-15. [24] MOBASHERI A, RAYMAN MP, GUALILLO O, et al. The role of metabolism in the pathogenesis of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2017;13(5):302-311. [25] WU CW, TCHETINA EV, MWALE F, et al. Proteolysis involving matrix metalloproteinase 13 (collagenase-3) is required for chondrocyte differentiation that is associated with matrix mineralization. J Bone Miner Res. 2002;17(4):639-651. [26] MA Y, WU Y, CHEN J, et al. miR-10a-5p Promotes Chondrocyte Apoptosis in Osteoarthritis by Targeting HOXA1. Mol Ther Nucleic Acids. 2019;14:398-409. [27] GAO GC, CHENG XG, WEI QQ, et al. Long noncoding RNA MALAT-1 inhibits apoptosis and matrix metabolism disorder in interleukin-1β-induced inflammation in articular chondrocytes via the JNK signaling pathway. J Cell Biochem. 2019;120(10):17167-17179. [28] ROMEO P, LAVANGA V, PAGANI D, et al. Extracorporeal shock wave therapy in musculoskeletal disorders: a review. Med Princ Pract. 2014;23(1):7-13. [29] SCHMITZ C, CSÁSZÁR NB, MILZ S, et al. Efficacy and safety of extracorporeal shock wave therapy for orthopedic conditions: a systematic review on studies listed in the PEDro database. Br Med Bull. 2015;116(1):115-138. [30] 高宏梁,周新华,吴猛,等.低能量体外冲击波对膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的影响[J].中国现代医生,2018,56(1):32-35. [31] KIM YH, BANG JI, SON HJ, et al. Protective effects of extracorporeal shockwave on rat chondrocytes and temporomandibular joint osteoarthritis; preclinical evaluation with in vivo99mTc-HDP SPECT and ex vivo micro-CT. Osteoarthritis Cartilage. 2019;27(11):1692-1701. [32] NOTARNICOLA A, IANNONE F, MACCAGNANO G, et al. Chondrocytes treated with different shock wave devices. Muscles Ligaments Tendons J. 2017;7(1):152-156. [33] VETRANO M, RANIERI D, NANNI M, et al. Hyaluronic Acid (HA), Platelet-Rich Plasm and Extracorporeal Shock Wave Therapy (ESWT) promote human chondrocyte regeneration in vitro and ESWT-mediated increase of CD44 expression enhances their susceptibility to HA treatment. PLoS One. 2019;14(6):e0218740. [34] CHENG NT, MENG H, MA LF, et al. Role of autophagy in the progression of osteoarthritis: The autophagy inhibitor, 3-methyladenine, aggravates the severity of experimental osteoarthritis. Int J Mol Med. 2017;39(5):1224-1232. [35] CARAMÉS B, HASEGAWA A, TANIGUCHI N, et al. Autophagy activation by rapamycin reduces severity of experimental osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2012;71(4):575-581. [36] SALMINEN A, KAARNIRANTA K, KAUPPINEN A. Beclin 1 interactome controls the crosstalk between apoptosis, autophagy and inflammasome activation: impact on the aging process. Ageing Res Rev. 2013;12(2):520-534. [37] LONG M, LI X, LI L, et al. Multifunctional p62 Effects Underlie Diverse Metabolic Diseases. Trends Endocrinol Metab. 2017;28(11):818-830. [38] LAHUERTA M, AGUADO C, SÁNCHEZ-MARTÍN P, et al. Degradation of altered mitochondria by autophagy is impaired in Lafora disease. FEBS J. 2018;285(11):2071-2090. [39] SCHAAF MB, KEULERS TG, VOOIJS MA, et al. LC3/GABARAP family proteins: autophagy-(un)related functions. FASEB J. 2016;30(12):3961-3978. [40] 孙明帅,范重山,李凯杰,等.骨关节炎中软骨细胞自噬的作用及其靶向治疗[J].中国组织工程研究,2021,25(35):5688-5693. [41] 杜汉承.雷诺嗪联合血栓通胶囊对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中细胞自噬及心肌核因子-κB、人磷酸化Akt蛋白、IP7水平的影响[J].中国药物经济学,2020,15(9):39-43. [42] 唐琴,朱海鹏,郭卫中,等.锌对THP-1细胞自噬、NF-κB通路活化及产生白细胞介素23的影响[J].免疫学杂志,2018,34(4):319-325. [43] DU L, SHEN T, LIU B, et al. Shock Wave Therapy Promotes Cardiomyocyte Autophagy and Survival during Hypoxia. Cell Physiol Biochem. 2017;42(2):673-684. [44] QIU Q, SHEN T, YU X, et al. Cardiac Shock Wave Therapy Alleviates Hypoxia/Reoxygenation-Induced Myocardial Necroptosis by Modulating Autophagy. Biomed Res Int. 2021;2021:8880179. [45] LONG Q, LI X, HE H, et al. Autophagy activation protects shock wave induced renal tubular epithelial cell apoptosis may through modulation of Akt/ GSK-3β pathway. Int J Biol Sci. 2016;12(12):1461-1471. [46] ZHU GQ, JEON SH, BAE WJ, et al. Efficient Promotion of Autophagy and Angiogenesis Using Mesenchymal Stem Cell Therapy Enhanced by the Low-Energy Shock Waves in the Treatment of Erectile Dysfunction. Stem Cells Int. 2018;2018:1302672.

[1]	孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[2]	张 辉, 王佳洋, 王 茜, 甘洪全, 王志强. 动态培养环境下透明质酸与国产多孔钽复合对软骨细胞功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 339-345.
[3]	陈晓驷, 谭小艳, 刘田丰, 韩登鹏, 魏 波, 胡资兵, 吴少科. 积雪草酸对骨质疏松模型大鼠生物力学特性与骨小梁面积及Runx2蛋白的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 246-251.
[4]	张伟业, 展嘉文, 朱立国, 王尚全, 陈 明, 魏 戌, 冯敏山, 于 杰, 韩 涛, 蔡楚豪, 周帅琪, 邵晨晨. 循环牵张力作用下髓核外泌体对终板软骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 223-229.
[5]	谢平金, 罗 臻, 卢启贵, 郭艳幸, 陈群群, 李飞龙. 川芎嗪和过表达miR-20b-5p干预早期膝骨关节炎模型大鼠滑膜、 软骨和软骨下骨血管新生的组织学变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 237-245.
[6]	税晓平, 李春莹, 李明娟, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠海马抗氧化应激指标和脑源性神经营养因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 264-269.
[7]	李明秀, 王 轩, 杨 杰, 李 毅. 骨关节炎体外模型特点及设计新思路[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 300-306.
[8]	刘映鸿, 伊亚婷. 血管生成在骨关节炎中的作用机制及治疗启示[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 307-313.
[9]	冯 皓, 张 斌, 王建平. 骨髓间充质干细胞移植可提高骨质疏松大鼠骨代谢水平[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 72-75.
[10]	张璟岚, 张滨婧, 陈艺菲, 张辰玥, 胡芝爱, 胡海琨. 磁场对间充质干细胞成骨的生物学效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 145-151.
[11]	马牧南, 解 军, 桑宇超, 黄 磊, 张国栋, 杨晓丽, 傅松涛. 电针联合骨髓间充质干细胞治疗化疗致大鼠卵巢功能不全[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 1-7.
[12]	魏艳召, 郑晓晗, 高仕君, 黄 婷, 魏续芳, 陈薪旭, 赵振强. 人胚胎干细胞自分泌巨噬细胞迁移抑制因子及受体表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 34-41.
[13]	杨 燕, 王静娴, 张荣红, 李 晨, 范安然, 崔冬冰, 吴淑梅. 不同来源条件培养基对人牙髓干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 49-53.
[14]	兰 倩, 辜仰聪, 肖 欣, 毕雪婷, 李 娜. 人牙周膜干细胞来源外泌体干预成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 54-58.
[15]	金 涛, 刘 林, 朱晓燕, 史宇悰, 牛建雄, 张同同, 吴树金, 杨青山. 骨关节炎与线粒体异常[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1452-1458.

骨关节炎是一种常见于中老年人的退行性疾病，其主要病理变化包括软骨细胞数量的减少和软骨的退化。目前发现的危险因素包括遗传、表观遗传、代谢等方面，但其发病机制仍不清楚。骨关节炎疾病晚期除药物缓解疼痛和关节置换外，尚无较好的治疗方法[1-2]。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，生物或机械因素可导致软骨细胞减少和软骨基质破坏，并发展为骨关节炎[3]。ZHOU等[4]研究发现circRNA.33186可促进白细胞介素1β干预的软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡，从而有效促进软骨修复和细胞外基质合成。MURATA等[5]将冲击波作用于体外培养的软骨细胞，发现其可以增强组织愈合和生长因子基因转染的效力，可能有助于治疗软骨疾病。相关研究表明，骨性关节炎的病因与软骨稳态的破坏有关[6]。因此，维持软骨细胞稳态、提高软骨细胞增殖活性在骨关节炎发生发展过程中十分重要。

自噬是真核细胞的一种自我保护程序，主要通过溶酶体降解受损的细胞器和有害蛋白[7]，从而维持细胞内环境的稳态，保护细胞免于死亡[8-9]。研究发现，骨关节炎的病理过程与软骨细胞自噬水平有关[10]，激活自噬可在一定程度上抑制骨关节炎软骨细胞的变性，从而延缓骨关节炎病程进展[11]。然而，自噬延缓骨关节炎发生发展的确切机制尚不清楚。

体外冲击波疗法(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)作为一种新兴的治疗技术，主要通过使用由电液、电磁或压电发电机诱导的单脉冲瞬态声波，将其集中于患病部位，从而达到治疗的目的[12]。近年来，体外冲击波治疗肌腱病、外上髁炎、钙化性肌腱炎、长骨骨折不愈合以及股骨头缺血坏死等肌肉骨骼疾病取得显著成效[13-14]。研究发现，体外冲击波对膝骨关节炎有积极影响[15]。体外冲击波治疗可增加软骨细胞活性，减少软骨细胞凋亡[16]。然而较少研究探讨体外冲击波与软骨细胞增殖、自噬之间的关系，故该研究从细胞层面入手，旨在探究体外冲击波对大鼠骨关节炎软骨细胞增殖和自噬的影响，希望能够得到更为直观的结果，也为后期的体内实验以及临床应用提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学体外实验，以细胞为对象进行分组对照观察，多组数据间差异采用单因素方差分析，多因素相互作用采用析因设计方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年12月至2021年6月在中国康复医学研究所实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   1周龄雄性SD大鼠10只，清洁级，体质量15-20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0008。实验方案经中国康复研究中心动物实验伦理委员会批准，批准号为2019-126-1。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   实验试剂   DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(Gibco，美国)；Ⅱ型胶原酶(Sigma-Aldrich，美国)；PB、甲苯胺蓝染液(Solarbio，中国)；Ⅱ型胶原多克隆抗体、Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG(H+L)(Abcam，美国)；重组鼠白细胞介素1β (Peprotech，美国)；CCK-8试剂盒(Lablead，中国)；Beclin 1、P62、Atg5、LC3B、GAPDH抗体(Abcam，美国)；Trizol试剂盒(Invitrogen，美国)；定量PCR试剂盒(Roche，瑞士)等。
1.3.3   实验仪器   显微外科手术器械；CO2恒温培养箱(Thermo，美国)；超净工作台(苏州智净净化，SW-CJ-2F，中国)；离心机(Thermo，美国)；相差显微镜(Nikon，日本)；冲击波治疗仪(Storz medical，德国)；酶标仪(普朗，DNM-9606，中国)；定量PCR仪(杭州博日科技，LineGene 9600，中国)等。
1.4   实验方法   
1.4.1   软骨细胞的分离、培养   将1周龄SD大鼠麻醉后颈椎脱臼处死，放入体积分数为75%乙醇中浸泡10 min；无菌条件下分离膝关节透明软骨，将分离所得软骨组织剪碎至1 mm3大小，PBS冲洗两三次后转移至离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，将其放置于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱消化一两个小时；弃上清液，加入0.2%Ⅱ型胶原酶，再次置于培养箱中孵育过夜。当游离出单个细胞后终止消化，细胞滤网过滤，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶，置于恒温培养箱培养。每2 d换1次液，显微镜观察细胞生长情况。当细胞铺满瓶底(80%-90%融合)时，将细胞悬液按1∶2比例传代、培养。取第3代细胞用于后续实验。
1.4.2   甲苯胺蓝染色   将第3代软骨细胞接种于12孔板，2×104个/孔，待融合率达60%-70%时，取出提前放置好的无菌盖玻片，PBS冲洗3次，每次5 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，1%甲苯胺蓝染液浸染30 min，PBS洗去多余染液，脱水，封固，显微镜观察拍照并记录。在冲击波作用后应用上述相同方法进行甲苯胺蓝染色实验。
1.4.3   Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色   将第3代软骨细胞接种至事先放置无菌玻片的12孔板，2×104个/孔，待细胞长至60%-70%时，取出细胞爬片，PBS冲洗后40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min，加入0.5% TritonX-100室温通透15 min，PBS冲洗3次，加入体积分数5%山羊血清封闭30 min，加入Ⅱ型胶原多克隆抗体(1∶100)4 ℃冰箱孵育过夜；第2天PBS冲洗后加入1∶50稀释的荧光二抗室温避光孵育1 h(以下操作都避光)，DAPI核染5 min，洗去多余染液后封固拍照。在冲击波作用后应用上述相同方法进行Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色实验。

1.4.4   白细胞介素1β诱导构建骨关节炎软骨细胞体外模型     将第3代软骨细胞按随机数表法随机分为4组，见表1。依据参考文献[17-18]，软骨细胞培养24 h开始给予10 μg/L白细胞介素1β刺激24 h，构建骨关节炎软骨细胞体外模型。根据相关文献[19-20]，将第3代消化下来的软骨细胞悬液(1 mL，1×106个)置于无菌EP管中，把EP管浸泡在偶联剂中，用体外冲击波治疗仪(Storz Medical，MASTERPULS MP100，发散式)探头对准EP管底部刺激管内细胞，冲击频率设置为8 Hz，能量强度为1.5×105 Pa，冲击次数500次[20]。为了确保冲击波作用后细胞存活，干预完成后应尽快移至培养箱。

1.4.5   CCK-8法检测细胞活力   将干预后的各组软骨细胞接种在96 孔板中(100 μL/孔，2×103个/孔)，放至37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中预培养1 h，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃孵育2 h，使用酶标仪在450 nm 处测量吸光度值(A值)，记录结果。细胞活力=[A(干预)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100%。
1.4.6   CCK-8法检测细胞增殖   将干预后的各组软骨细胞以2×103个/孔接种于96孔培养板，各设8个复孔，置于恒温培养箱培养，次日起每天取出1块板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度值(A值)，连续测定7 d。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制软骨细胞生长曲线。
1.4.7   实时荧光定量PCR检测Beclin 1、P62、Atg5、LC3 mRNA表达水平   采用TRIzol法从干预后的各组软骨细胞中提取总RNA，使用超微量分光光度计检测提取RNA的浓度及纯度，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照说明书配置反应体系，每个反转录体系加入mRNA 400 ng。反应程序：42 ℃温浴15 min；85 ℃温浴5 min。使用定量PCR试剂盒进行qPCR反应。cDNA稀释5倍作为检测样品，反应程序：预变性95 ℃ 10 min；变性95 ℃ 5 s，退火延伸 60 ℃ 40 s(50个循环)；以GAPDH作为标准，采用2-ΔΔCt法分析相应基因表达，每个样品设3个重复。引物序列见表2。 

1.5   主要观察指标   ①软骨细胞形态；②软骨细胞鉴定结果；③软骨细胞的活力和增殖能力；④软骨细胞自噬相关基因Beclin 1、P62、Atg5、LC3的表达。
1.6   统计学分析   采用SPSS 22.0统计学软件，计量资料均以x±s表示，多组数据间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多因素相互作用采用析因设计方差分析；使用Graphpad Prism 6.0软件进行绘图，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过首都医科大学生物统计学专家审核。

骨关节炎作为一种常见疾病，随着近年来老龄化的加剧，发病率越来越高，不仅影响患者的身心健康，还给社会带来了巨大的经济负担[21-22]。骨关节炎的病因往往是多因素且十分复杂的，相关研究表明，机械应力、代谢功能障碍和炎症都与骨关节炎进展有关[23]。骨关节炎受累关节的病理改变主要是由细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α刺激核因子κB和丝裂原活化蛋白激酶信号通路，促进分解代谢，从而使关节软骨、软骨下骨发生改变以及膜代谢改变[24]。在骨关节炎的发展过程中，基质金属蛋白酶在骨关节炎中起着重要的作用，其中基质金属蛋白酶13在骨关节炎的病理中起着最重要的作用[25]。

白细胞介素1β是一种致炎细胞因子，可诱导软骨细胞凋亡，被广泛用于诱导骨关节炎细胞模型[26]。该实验通过白细胞介素1β诱导建立骨关节炎软骨细胞模型，结果显示白细胞介素1β诱导的软骨细胞增殖能力减弱，这与ZHOU等[4]、GAO等[27]的研究报道结果一致。目前体外冲击波延缓骨关节炎进展的机制仍不明确。研究发现体外冲击波可能通过促进血管再生、抗炎、诱导与组织修复有关的生长因子和细胞因子的表达、提高软骨细胞增殖活性等多种因素来达到治疗骨关节炎的目的[13，28-29]。此前已有研究证实体外冲击波可以抑制骨关节炎软骨细胞凋亡，从而达到保护软骨的目的[30-31]，但较少研究着眼于体外冲击波对软骨细胞自噬的影响，故该研究主要探讨二者间的关系，希望为体外冲击波治疗骨关节炎提供更多的思路和治疗靶点。

此外，NOTARNICOLA等[32]使用4种不同来源的冲击波刺激体外培养的软骨细胞，即电磁装置、压电装置、电液装置和径向装置(即发散式)，均在0.05 mJ/mm2的能量密度下，用500次脉冲处理，研究证实了体外冲击波对骨关节炎等软骨疾病的治疗潜力。VETRANO等[33]利用电磁冲击波发生器进行冲击波处理，参数设置为0.14 mJ/mm2，1 000次脉冲，得出电磁冲击波通过诱导软骨细胞表面透明质酸的主要细胞受体CD44的表达，进而增强软骨细胞的细胞活性，从而促进退化软骨的修复。KIM等[31]研究了体外冲击波对大鼠颞下颌关节骨关节炎的影响，发现体外冲击波能显著提高细胞活力，降低基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13等软骨降解标志物的表达。该实验结果表明，白细胞介素1β组软骨细胞的活力显著下降，提示构建骨关节炎软骨细胞模型成立；白细胞介素1β+体外冲击波组骨性关节炎软骨细胞的活力得到明显改善，与前人研究一致。

自噬是细胞转化率低的组织(如关节软骨)中必不可少的稳态过程。随着年龄的增长，自噬的抑制以及自噬的丧失与细胞死亡和骨关节炎发病有关[11，34]；相反，激活自噬可降低实验性骨关节炎的严重程度[35]。CHENG等[34]研究发现在骨关节炎动物模型中，维持软骨细胞的自噬可以防止软骨变性。因此，软骨细胞自噬的增加可能是骨关节炎治疗的一个潜在机制。然而，关节软骨自噬的调控途径尚不明确。

为了探究体外冲击波对软骨细胞自噬的影响，文中主要分析了4个自噬相关蛋白(Beclin 1，P62，Atg5，LC3)。
Beclin 1是酵母Atg6同源物，在自噬中起正调控作用[36]。P62作为衡量自噬通量的指标，被认为与自噬降解呈负相关[37]。
Atg5是自噬活性标志物，与Beclin 1一起正向调控自噬[38]。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ2种存在形式，当自噬发生时，细胞质形式的LC3-Ⅰ通过类泛素酶反应与磷脂胺结合，转化为磷脂缀合物形式的LC3-Ⅱ，从而进行自噬过程[39]。

目前最常见的软骨细胞自噬调控途径分为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 和核因子κB信号通路。mTOR激酶可负向调控细胞自噬，激活后通过Akt和丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路抑制自噬的发生，而通过AMPK和p53信号转导通路的负性调节又可促进自噬[40]。核因子κB可激活自噬相关基因，激活后还可诱导自噬的相关保护机制[41-42]。DU等[43]发现冲击波疗法通过调节AMPK/mTOR通路促进缺氧时心肌细胞自噬，保护心肌细胞功能。QIU等[44]发现冲击波疗法通过调节自噬可减轻缺氧/复氧诱导的心肌坏死。LONG等[45]研究证实冲击波通过激活细胞信号通路Akt/GSK-3β从而促进肾细胞的自噬，表现为LC3-Ⅱ的转换、Beclin-1的诱导和P62的降解。ZHU等[46]研究表明体外冲击波疗法与间充质干细胞联合治疗可以激活更多的血管内皮生长因子， 从而触发PI3K/AKT/mTOR信号通路参与自噬。该研究发现体外冲击波可上调骨关节炎软骨细胞Beclin 1、Atg5和LC3基因水平，并降低P62的基因表达水平，从而保护退化的软骨细胞。这些结果揭示了体外冲击波在调节软骨细胞自噬中的重要作用。

该研究存在以下局限性：在应用于临床前需要更多的实验，包括体内实验，后期研究使用大型动物可以帮助确定体外冲击波的最佳条件，如能量强度、脉冲频率等，为临床骨关节炎治疗做准备。体外冲击波没有影响软骨细胞的活性，但应评估体外冲击波对邻近结构的影响。体外冲击波是否对人类骨关节炎软骨细胞自噬也有同样的效果还有待进一步验证。该实验旨在研究体外冲击波这一物理干预方法是否会对骨关节炎软骨细胞增殖和自噬产生影响，但具体哪些受体或通路参与其调控过程，还需更多实验加以验证。

综上所述，体外冲击波促进白细胞介素1β诱导的软骨细胞增殖，并提高骨关节炎软骨细胞的自噬水平，其可能通过调节软骨细胞自噬等表型进而参与骨关节炎的进展。体外冲击波疗法可能为骨关节炎提供一种新的治疗靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
体外冲击波：是一种通过物理学机制介质(空气或气体)传导的机械性脉冲压强波，目前被广泛应用于物理治疗康复医学领域。体外冲击波疗法通过减轻患者疼痛、改善关节活动和预防缺血性坏死的发生等方式有效治疗肌肉骨骼疾病，与其他治疗方法相比，具有无创、无痛、便捷、安全、并发症发生率低、成本低等优点。
自噬：是真核细胞通过溶酶体途径降解细胞质蛋白和细胞器以维持生存的过程，在细胞增殖分化、凋亡坏死过程中起着重要作用，其主要是清除和降解功能失调的细胞器和有害蛋白，从而维持细胞内环境的稳态，保护细胞免于死亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

目前体外冲击波延缓骨关节炎进展的机制仍不明确。研究发现体外冲击波可能通过促进血管再生、抗炎、诱导与组织修复有关的生长因子和细胞因子的表达、提高软骨细胞增殖活性等多种因素来达到治疗骨关节炎的目的。此前已有研究证实体外冲击波可以抑制骨关节炎软骨细胞凋亡，从而达到保护软骨的目的，但较少研究着眼于体外冲击波对软骨细胞自噬的影响，故该研究主要探讨二者间的关系，希望为体外冲击波治疗骨关节炎提供更多的思路和治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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