利用流式细胞仪及CFSE染色剂对髓核细胞外泌体进行检测，CFSE染色剂可被动扩散进入细胞。至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团，产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物，CFSE阳性颗粒即为完整的外泌体。流式细胞术检测结果显示，应力条件与非应力条件下的髓核细胞均存在丰富的外泌体，且应力条件下的髓核细胞外泌体浓度高于非应力条件，见图2、表2。







2.2   外泌体标志蛋白检测结果   Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、Tsg101表达，可见所得非应力条件与应力条件下的髓核细胞外泌体均有特征性膜蛋白CD63、Tsg101表达，见图3。



2.3   终板软骨细胞接收外泌体情况    PKH67标记的髓核细胞外泌体与终板软骨细胞共孵育24 h后，倒置荧光显微镜下观察，对照组无绿色点状荧光，其余两组终板软骨细胞中均可以观察到绿色点状荧光，证明髓核细胞外泌体被终板软骨细胞接收，见图4。



2.4   各组终板软骨细胞增殖情况和凋亡检测   流式细胞术检测结果显示，非应力组细胞凋亡率与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；应力组细胞凋亡率明显高于对照组(P < 0.05)，与非应力组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。CCK8检测结果显示，非应力组与对照组细胞增殖活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；应力组细胞增殖活性低于对照组降(P < 0.01)，与非应力组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。







2.5   各组终板软骨细胞中相关基因mRNA表达情况   RT-PCR检测显示，与对照组相比，非应力组基质金属蛋白酶3与骨形态发生蛋白2  mRNA表达升高(P < 0.01，P < 0.05)；应力组Ⅱ型胶原mRNA表达下降(P < 0.05)，解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3、骨形态发生蛋白2及β-连环蛋白 mRNA表达升高(P < 0.01，P < 0.05)。与非应力组相比，应力组Ⅱ型胶原mRNA表达下降(P < 0.05)，解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3及骨形态发生蛋白2 mRNA表达显著升高，见表4。

椎间盘是人体承受载荷的重要部位，具有缓冲冲击、分散外力、维持脊柱稳定性的作用，而异常应力是椎间盘退变的重要诱因[1-2]。终板是位于上下椎体末端和邻近椎间盘交界的结构，其功能主要体现在对椎间盘的力学传导与应力分布，而终板软骨退变被认为是促使椎间盘退变的始动因素[3]。相关研究及作者前期研究表明，异常应力下终板软骨退变引发的营养代谢及物质转运功能障碍[4-5]，在椎间盘退变的发生和发展中起着重要作用[6-7]。而终板软骨细胞作为终板组织中的主要细胞类型，在髓核-终板的复杂微环境中又受到多种因素的调节[8-9]。探索应力对终板软骨细胞所处的椎间盘微环境的影响，有助于进一步明确终板及椎间盘应力退变机制，为椎间盘退变的防治与早期修复研究提供依据。

外泌体被认为是重要的局部微环境调控介质[10]，研究表明人类髓核细胞能够旁分泌外泌体[11]，并且应力可调节髓核外泌体的分泌过程，影响椎间盘微环境稳定状态[12]。有报道显示循环牵张力参与调节髓核与终板软骨细胞的复杂生物过程和信号传导途径[13-14]，一定条件下的循环牵张力刺激可引起终板软骨细胞退变与终板软骨细胞凋亡[15-16]。近年来还有研究表明，终板软骨细胞活性可受到其他来源细胞外泌体的影响[17]，但在应力条件下髓核细胞分泌外泌体对终板软骨细胞的作用尚不清楚。此次实验拟观察在一循环牵张力刺激下髓核细胞外泌体分泌情况，以及应力刺激髓核外泌体对终板软骨细胞的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验，两组数据间比较采用非配对t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2021年9-12月在中医正骨技术北京市重点实验室进行。
1.3   材料
1.3.1   主要材料和试剂   人终板软骨细胞与原代细胞DMEM/F-12基础培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；Annexin V binding buffer、Annexin V-FITC、CFSE染色剂(Solarbio，中国)；PKH67染色剂(Fluorescence Biotechnology，中国)；外泌体提取试剂盒(同创正业生物，北京)；反转录试剂盒(Promega A2801，美国)；anti-CD63/Tsg101(Abcam，英国)。
1.3.2   主要仪器设备   Cytoflex S流式细胞仪(Beckman，美国)；Western blot电泳系统(Bio-rad，美国)；FX-5000T细胞牵张拉伸应力加载系统、Flexcell拉力板(Flexcell公司，美国)；生物倒置显微镜(江南永新XD-202，中国)；倒置荧光显微镜(Zeiss Axio Vert.A1，德国)；CO2培养箱(Thermo，美国)；酶标仪(Bio-rad，美国)；超净台(Thermo，美国)；H-7650型透射电子显微镜(Hitachi，日本)；MILi-Qso型超纯水仪(Millipore，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   人髓核细胞和终板软骨细胞的体外培养   人髓核细胞取自术中腰椎手术患者，供者对实验知情同意，研究方案经中国中国医学科学院望京医院伦理委员会批准(WJEC-KT-2020-014-P001)。取腰椎间盘髓核组织，清除彻底终板及纤维环后，用PBS冲洗干净，以Ⅱ型胶原酶(0.5 g/L)在37 ℃下消化12 h，收集细胞悬液，加入等体积的完全培养基(体积分数10%胎牛血清+100 U/mL青-链霉素+DMEM/F-12培养基)，1 200 r/min离心6.5 min，再次加入5 mL完全培养基重悬细胞，接种于25 cm2透气培养瓶中[18-19]。

终板软骨细胞原代细胞购自上海名劲生物科技有限公司。将两种细胞分别置于37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中进行培养，3 d更换一次培养基，细胞密度达80%时传代。将细胞用培养基、培养皿、无菌PBS放置于超净台上预热，照射紫外30 min。取出细胞，用移液器去除原培养基，加入5 mL无菌PBS洗涤细胞一次，去除PBS；加入1 mL胰酶消化2-4 min，显微镜观察，待细胞完全从培养瓶中脱落后，加入5 mL培养基终止反应；吹打细胞数次，使形成单个悬浮细胞。将细胞悬浮液转移至15 mL CORNING无菌离心管中，1 000 ×g离心3 min。对管体进行表面消毒后，放入超净工作台中，倒入离心后的培养基上清，用10 mL上述完全培养基重悬浮细胞。将10 mL细胞悬浮液分成2份，转移至2个新的细胞培养瓶中，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。

1.4.2   髓核细胞循环牵张力加载   待细胞融合度达到80%-90%时，将髓核细胞铺板到Flexcell拉力板上，细胞铺板50%融合度，37 ℃培养过夜使细胞贴壁生长。实施应力前，将培养板里的培养基去除，补加2 mL对应无血清培养基。随后进行操作，应力条件参照相关文献采用FX-5000T仪器对细胞施加10%牵张力、1 Hz、24 h的力学刺激[14，20]；非应力条件则用同样的细胞板对髓核细胞在无牵张力的状态下培养24 h。
1.4.3   髓核细胞外泌体的分离及提纯   用移液器收集应力与非应力条件下髓核细胞培养基上清，利用外泌体提取试剂盒，采用磁珠法对髓核细胞外泌体进行分离提纯。

取550 µL细胞上清样品，4 ℃下3 000×g离心10 min，取500 µL上清液移到新1.5 mL离心管中备用。在预处理样本的1.5 mL离心管中，按照外泌体提取试剂盒使用说明，加入500 µL 结合缓冲液2(试剂盒提供)和100 µL磁珠悬液(使用前混匀磁珠)，混匀各离心管，室温静置15 min。将离心管置于合适的磁力架上，磁吸3 min，使磁珠完全沉淀上清透明后，弃掉上清。加入1 mL洗涤液WB，上下颠倒使磁珠重新悬浮，置于磁力架磁吸2 min，使磁珠完全沉淀上清透明后再次弃掉上清。加入50 µL洗脱液A EB-A，使磁珠重新悬浮，室温放置5 min后，置于磁力架上，磁吸3 min，使磁珠完全沉淀上清透明后备用。取新1.5 mL离心管加入450 µL洗脱液B EB-B，再将离心管中50 µL洗脱液A移到对应的洗脱液B离心管中，轻柔混匀。
1.4.4   外泌体形态学观察、染色鉴定和标志蛋白检测

外泌体形态学观察：吸取50 µL外泌体悬液滴在铜网上，室温静置 1 min，用滤纸从侧面吸干液体，使用2%磷钨酸溶液在室温下负染1 min，滤纸吸干染液，室温晾干，透射电镜下观察并拍照。

外泌体染色鉴定：取经过分离和提纯后混匀的外泌体悬液，200 µL/管，每管加入CFSE染色剂0.2 µL，37 ℃避光孵育10 min后，用Cytoflex S流式细胞仪检测，为检查流式细胞仪，空白对照管不加染料，上机检测。

外泌体标志蛋白检测：首先进行外泌体变性，在上述分离纯化获得的50 µL外泌体中加入12.5 µL的5×Loading buffer上样缓冲液，混匀后100 ℃水浴锅加热10 min。配置8%SDS-PAGE Gel，用移液器取20 µL变性后的外泌体样品加入SDS-PAGE Gel孔中，调整电泳仪电压为100 V稳压电泳1 h。直至样品进入分离胶，将电压调整到130 V，继续稳压电泳，直至Loading buffer染料到达胶底部。停止电泳，拆板，进行湿转转膜。转膜条件设定为：25 mmol/L Trisbase，192 mmol/L Glycine，20% methanol转膜液，设定在4 ℃、100 V稳压转膜60 min。

封闭结束后，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；封闭完成后膜用TBST洗涤3次，分别加入抗体CD63、Tsg101(稀释比1∶1 000)，4 ℃下水平摇床孵育过夜；再次洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(稀释比1∶1 000)共同孵育1 h，再次洗脱后，使用化学发光底物在凝胶成像仪曝光检测蛋白表达。
1.4.5   PKH67荧光标记外泌体   按照PKH67荧光染料试剂盒操作说明标记应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体。PKH67试剂静置至室温后，用稀释液将探针10倍稀释，再用PBS将PKH67母液25倍稀释，配制成染色工作液。将制备好的待标记外泌体用100 µL染色工作液重悬，于37 ℃孵育5 min，再于4 ℃孵育15 min，染色结束，补加400 µL的PBS。标记后的髓核细胞外泌体再次提纯，提纯方法同上。
1.4.6   外泌体与终板软骨细胞共培养   将应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体分别进行PKH67染色和纯化。将终板软骨细胞以1×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板内，分3组培养：应力组将500 µL应力条件下的髓核细胞外泌体与30%细胞密度的终板软骨细胞共培养24 h，非应力组将500 µL非应力条件下的髓核细胞外泌体与30%细胞密度的终板软骨细胞共培养24 h，对照组单独的细胞密度30%的正常终板软骨细胞在相同条件下培养24 h。

终板软骨细胞摄取外泌体情况：培养结束后，收集各组终板软骨细胞，经胰酶消化并用细胞培养基吹打成单细胞悬浮液。将细胞悬浮液直接涂片后在倒置荧光显微镜下进行荧光拍照。

终板软骨细胞凋亡检测：采用流式细胞术检测终板软骨细胞的凋亡情况。培养结束后，胰酶消化各组终板软骨细胞，300×g离心5 min后弃上清，用1 mL 1×Annexin V binding buffer洗涤一次，300×g离心5 min后弃上清；用100 µL 1×Annexin V binding buffer重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5µL/管，避光孵育10 min；每管加入10 µL PI和400 µL 1×Annexin V binding buffer继续避光孵育5 min，1 h内上机检测。

终板软骨细胞活性检测：采用CCK8法检测终板软骨细胞的活性情况。将各组细胞悬浮液等比例接种于96孔板内，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后，去除板中所有培养基，每孔加入10 µL CCK8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2 h。利用酶标仪在450 nm处测定吸光度值，检测细胞活性。

终板软骨细胞相关基因mRNA表达情况：培养结束后，采Trizol法提取各组终板软骨细胞的总 RNA，参照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成，用CFX96 Q-PCR型PCR仪进行Real-time PCR反应，PCR反应条件设定为：95 ℃预变性10 min；95 ℃延伸15 s，60 ℃退火1 min，45个循环，检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3、解聚蛋白样金属蛋白酶5、骨形态发生蛋白2、β-连环蛋白的mRNA表达量。引物序列(上海生工代工合成)见表1，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt算法得到各组基因mRNA的相对表达量[21]。 

1.5   主要观察指标   循环牵张力条件下髓核细胞外泌体的分泌情况，以及应力刺激髓核外泌体对终板软骨细胞的影响。
1.6   统计学分析   采用 SPSS 18.0 统计软件处理，实验数据以x±s表示，使用t检验比较两样本均数差异，使用单因素方差分析比较多样本均数差异，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经中国中医科学院望京医院统计方法学专家审核。

椎间盘是人体承受载荷的重要部位，具有缓冲冲击、分散外力、维持脊柱稳定性的作用，而异常应力是椎间盘退变的重要诱因[1-2]。作为椎间盘重要的力学传导结构，终板易受到异常应力损伤而导致退变。生理范围内的机械应力可刺激椎间盘细胞合成基质的生成，过高或过低的异常应力均会导致终板软骨细胞合成基质与基质降解失衡，引发终板营养弥散功能障碍。力学因素导致终板退变有着复杂且重要的影响，其中的机制还有待进一步探索。大量体外细胞应力加载实验证实，异常力学刺激通过多种信号通路及信号网络对终板软骨细胞凋亡、合成、细胞外基质降解和钙化产生影响[10]。作者前期研究观察了异常应力对体外培养兔脊柱运动节段终板的影响，发现随着终板压力退变进程，椎体终板内血管芽数量显著减少，造成椎间盘内部营养供应与代谢障碍，导致椎间盘退变发生[5]。除了对终板的直接损伤，异常应力所引发的椎间盘内微环境改变对终板软骨细胞的影响需要更多探究。

椎间盘作为体内最大的无血管组织，承载着持续的应力负荷，椎间盘内微环境受到缺氧、营养障碍、高渗、偏酸等众多因素的影响[22]。研究表明，髓核细胞通过自分泌和旁分泌造成的微环境改变被认为是椎间盘退变发生和发展的关键步骤[23-25]。已有报道，在退变环境中髓核细胞与终板软骨细胞共培养可导致椎间盘退变加重[26]。髓核细胞为了应对生物力学改变将进行细胞重塑，包括过度表达基质金属蛋白酶、转化胶原蛋白合成等[27-29]，该过程造成的微环境恶化，可能会诱导或加速终板软骨细胞退变[30]。而终板软骨细胞退变所导致的终板钙化将阻碍椎间盘的营养代谢，使得氧含量、营养物质、生长因子成分发生变化，进一步破坏了微环境稳态，促进髓核细胞凋亡[31-32]。在椎间盘微环境改变过程中，髓核细胞与终板软骨细胞间的交互作用值得关注[33-35]，阻断两者间的恶性循环或促进两者间的保护作用[36]，可能成为椎间盘内源性修复的有效策略。鉴于此，从椎间盘内应力环境角度出发，研究髓核细胞与终板软骨细胞间的交互作用，对椎间盘退变的发生机制与调控机制研究具有重要意义，而两者间的作用可通过外泌体进一步研究。

外泌体被认为是重要的局部微环境调控介质[10]，具有极强的靶向性和生物功能，通过保护并运输其内容物而介导细胞间的通讯，从而参与机体细胞新陈代谢，影响特定受体细胞的结构和功能[37]。外泌体已被证明在调节椎间盘退变中发挥重要作用[38]，比如在内源性修复方面，诸多研究证实干细胞可通过旁分泌外泌体作用调节椎间盘退变进展[39]，作为骨髓间充质干细胞[40]、终板软骨干细胞[36]、尿液干细胞等分泌的关键生物活性成分[41]，外泌体可作为以上干细胞治疗的替代方法干预椎间盘退变。然而，髓核细胞外泌体在椎间盘退变发展进程中的作用仍不明确。SUN等[12]研究表明，髓核脊索细胞来源的外泌体可抑制血管内皮细胞的迁移及血管形成，从而抑制椎间盘组织中异常血管再生，延缓退变的发生。但SONG等[42]发现不同退变程度的髓核细胞外泌体存在差异表达，高退变程度髓核细胞分泌的外泌体可促进细胞凋亡、抑制增殖。有研究发现，退行性椎间盘来源的髓核干细胞外泌体可通过抑制细胞增殖、迁移、基质合成和促进细胞凋亡来加剧纤维环变性。以上研究表明，在椎间盘退变发展过程中，椎间盘内部退变细胞通过自分泌或旁分泌外泌体途径进行的细胞间通讯可导致周边邻近组织细胞退变，该过程可能是导致椎间盘退变加重与进展的原因。此次实验希望通过观察应力条件下髓核细胞外泌体分泌的情况，以及该条件外泌体对终板软骨细胞活性的影响，从而探讨外泌体与椎间盘应力退变的关系。

此次实验采用循环牵张力刺激髓核细胞，相关研究已证明循环牵张力参与调节髓核与终板软骨细胞的复杂生物过程和信号传导途径[13-14，20，43]。YANG等[14]应用Flexcell张力系统比较了不同时长1 Hz循环牵张力对髓核细胞的影响，发现当拉伸超过6 h时，髓核细胞自噬的保护作用被抑制，循环牵张力作用24 h时髓核细胞凋亡出现显著增加。HE等[20]探索了伸长率为10%、频率为1 Hz的循环牵张力强度，对人髓核细胞分泌软骨层间蛋白的影响及其机制，结果表明该蛋白表达随着刺激时长的变化而不同，异常的机械负荷导致髓核细胞软骨层间蛋白的过度表达，促进椎间盘退变发展。针对终板软骨细胞的影响，XU等[13]比较了伸长率为10%的循环牵张力在不同频率与时间下的作用，发现在1 Hz、24 h的刺激强度下转化生长因子β1浓度最低，细胞重排现象显著。LI等[43]研究认为相较于椎间盘其他部位，髓核细胞在体内通常不暴露于牵张应力环境，10%伸长率1 Hz的循环牵张力对髓核细胞属非生理性机械刺激，循环牵张力刺激后24 h可诱导髓核细胞中金属蛋白酶组织抑制剂1表达显著升高，以及椎间盘基质中基质金属蛋白酶3表达升高，但并不会显著影响髓核细胞活性。基于此，根据以上循环牵张力对髓核细胞的相关研究，作者选择10%伸长率、1 Hz加载24 h的循环牵张力加载于髓核细胞。

细胞流式仪检测结果显示，循环牵张力刺激后的髓核细胞外泌体颗粒浓度明显高于非应力条件，而应力与非应力条件下的髓核外泌体均可被终板软骨细胞摄取。与无外泌体条件的对照组相比，终板软骨细胞在非应力髓核细胞外泌体条件下活性无下降(非应力组)；而加入循环牵张力刺激后，髓核细胞外泌体活性较对照组显著下降、凋亡率上升(应力组)，Ⅱ型胶原表达明显下降，解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3、骨形态发生蛋白2、β-连环蛋白表达升高。

实验结果表明，一定条件循环牵张力刺激下的髓核细胞外泌体可抑制终板软骨细胞活性，造成细胞基质合成Ⅱ型胶原能力下降，与基质分解相关的解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3表达升高，以及与软骨钙化相关的骨形态发生蛋白2表达升高，β-连环蛋白高表达提示退变可能与Wnt/β-catenin信号通路相关。椎间盘内部微环境复杂，此次实验初步观察了在一定应力条件下髓核外泌体与终板软骨细胞间的关系，而不同应力加载条件对微环境稳态的影响，以及椎间盘内部细胞间的相互作用关系还需要更多探讨。作者还将进一步明确应力条件下髓核外泌体中所包含的分子及其对椎间盘退变的调控机制，为椎间盘退变的防治与早期修复研究提供依据。
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文题释义：
外泌体：特指包含了复杂RNA和蛋白质的直径在40-100 nm的盘状囊泡，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等，其功能取决于其所来源的细胞类型，可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方面。有关椎间盘不同组织细胞外泌体的分泌、摄取及其内容物、“运载物”和相应的功能尚需深入研究。
软骨终板：是椎间盘组成的重要部分。椎体终板是椎体在生长发育过程中椎体上下面的骨骺板骨化停止后形成的骨板，呈轻度凹陷，即为骨性终板。椎体终板的中央仍为一薄层透明软骨覆盖，并终生存在，即为软骨终板，上下软骨终板与髓核和纤维环连接共同构成椎间盘，软骨终板的完整性与功能对维持椎间盘生理作用有重要意义。

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该文从椎间盘内应力微环境角度出发，以外泌体为切入点研究髓核细胞与终板软骨细胞间的交互作用，重点观察在循环牵张力刺激下髓核细胞外泌体的分泌情况，以及该应力条件下的髓核外泌体对终板软骨细胞活性与功能的影响。研究结果表明，一定条件的循环牵张力可促进髓核细胞外泌体分泌，且该条件下的外泌体可抑制终板软骨细胞活性，造成细胞基质合成与分解代谢紊乱。本研究初步明确了一定应力条件下髓核外泌体与终板软骨细胞间的关系。

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