挑选目的基因阳性克隆，送菌液pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-FNDC5-3xFLAG-WPRE测序，测序结果经 Chromas 比对显示测序结果与设计序列一致，表明FNDC5过表达慢病毒载体构建成功。 2.2   慢病毒包装并转染人脐静脉内皮细胞结果   将质粒pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-FNDC5-3xFLAG-WPRE转染293T细胞，48 h后倒置荧光显微镜下可见大量绿色荧光，表明质粒pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-FNDC5-3xFLAG-WPRE已成功导入293T细胞；收集细胞上清液，通过 RT-PCR 法定量测定上清液中的病毒滴度为2.67×108 TU/mL，证实病毒包装成功。然后将慢病毒包装的pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-FNDC5-3xFLAG-WPRE表达质粒分别按照感染复数值为20，40，80转染人脐静脉内皮细胞，得到最适感染复数值为40。然后以40的感染复数值转染人脐静脉内皮细胞，72 h后能观察到明显绿色荧光，再经嘌呤霉素筛选7 d后，可观测到成片的稳定表达的绿色荧光，见图2，得到FNDC5稳定过表达的人脐静脉内皮细胞系。



2.3   各组人脐静脉内皮细胞FNDC5 mRNA和蛋白表达    见图3。

实时RT-PCR 和Western blot 检测结果显示，实验组FNDC5蛋白表达量高于空白组、对照组(P < 0.001)，FNDC5 mRNA表达量高于空白组、对照组(P < 0.01)，空白组与对照组间FNDC5蛋白和mRNA表达量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。结果表明，在转染pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-FNDC5-3xFLAG-WPRE慢病毒后，体外培养的人脐静脉内皮细胞成功过表达FNDC5，得到FNDC5 稳定过表达的人脐静脉内皮细胞株。
2.4   各组人脐静脉内皮细胞活性检测结果   见图4。

加入氧化型低密度脂蛋白1，2 h后，实验组细胞活力高于空白组、对照组(P < 0.05)，空白组与对照组细胞活力比较差异无显著性意义(P > 0.05)；加入氧化型低密度脂蛋白1，4 h后，3组细胞活力比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明，FNDC5过表达能够改善氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞活性下降。
2.5   各组人脐静脉内皮细胞凋亡检测结果   流式细胞术检测结果显示，加入氧化型低密度脂蛋白24 h后，实验组早期及晚期凋亡细胞率均低于空白组、对照组(P < 0.05)，空白组与对照组早期及晚期凋亡细胞率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5A。

Hoechst 33342/PI双染检测结果显示，加入氧化型低密度脂蛋白24 h后，实验组凋亡细胞数量少于空白组、对照组，空白组与对照组凋亡细胞数量无明显差异，见图5B。凋亡细胞能够被PI试剂染色，发红色荧光，正常细胞只能发蓝色荧光，故过表达FNDC5可以抑制人脐静脉内皮细胞凋亡，这也与流式检测结果一致。

近年来，中国心血管疾病的发病率明显增加，已成为国人死亡和过早死亡的主要原因，占疾病死亡构成的40%以上[1]。动脉粥样硬化型心血管疾病占中国所有心血管疾病死亡率的首位，也是世界范围内导致死亡的主要原因，并逐年呈上升态势[2-3]。动脉粥样硬化是一种缓慢进行的血管炎症性疾病，与高龄、不良生活方式、肥胖、高血压、高脂血症及糖尿病等基础代谢疾病紧密相关，其发生发展涉及内皮损伤与血管壁功能紊乱、脂质代谢异常、炎性细胞黏附以及泡沫细胞形成等多因素共同参与的复杂病理过程[4-9]。血管内皮是人体的内分泌和旁分泌器官，能分泌多种血管活性物质，同时也是许多活性物质的靶器官。血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动环节，也是脂质沉积、单核细胞黏附和内膜增厚的先决条件，炎症、氧化应激、收缩与舒张功能异常及氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡均与动脉粥样硬化形成密切相关，而动脉粥样硬化又可加重血管内皮损伤[10-12]。因此，保护血管内皮细胞、维护血管内皮功能对抑制动脉粥样硬化的发生发展及保护心血管有重要作用。

体育锻炼有益于哺乳动物的心血管系统，能够降低心血管疾病的风险，这至少部分归功于肌肉因子的作用。Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain containing 5，FNDC5)是一种由运动诱导产生的肌肉因子，其本质是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，骨骼肌细胞及心肌细胞是其产生的主要来源[13]。鸢尾素是由FNDC5蛋白水解形成的一种多肽激素，由112个氨基酸构成，分子质量约12 kD，其在不同的物种间具有高度同源性[13]。鸢尾素可以上调棕色化相关基因，并通过p38 MAPK和ERK信号通路促进白色脂肪棕色化，燃烧脂肪增加能量代谢，减轻体质量及改善胰岛素抵抗[14-16]。血清内鸢尾素水平与2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、慢性肾病、牛皮癣、骨质疏松症、高血压、动脉粥样硬化和癌症等主要慢性疾病之间存在明显的关联[17-18]。种种迹象表明，通过调节脂质代谢、抗氧化应激、抑制炎症反应减轻内皮损伤，鸢尾素在一定程度上可以减轻或延缓动脉粥样硬化进程，这也与课题组前期研究相一致[19-23]。此外，鸢尾素可以减轻动脉粥样硬化病变、减少动脉粥样硬化病变中炎性细胞(如T淋巴细胞和巨噬细胞)的募集，并通过抑制ROS-P38 MAPK-NF-κB信号通路减少炎症因子的表达[24]。脂质在血管平滑肌细胞及巨噬细胞中蓄积可形成泡沫细胞，而泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发病机制的核心环节。FNDC5可通过抑制血管平滑肌细胞中NF-κB的活化和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)的上调，进而抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞源性泡沫细胞形成[25]，而其水解产物鸢尾素可通过上调PERK/eIF2a/CHOP/Bcl-2和激活转录因子6内质网应激的表达，抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞内脂质蓄积[26]。前期研究已证实，FNDC5过表达可减少氧化型低密度脂蛋白所诱导的巨噬细胞源泡沫细胞形成[27]，并可抑制平滑肌细胞的增殖与迁移[28]，从而延缓动脉粥样硬化进程。同时也启发作者过表达FNDC5能够成功转染血管内皮细胞，从而进一步验证FNDC5在动脉粥样硬化进程中的保护性作用，此次实验假设认为过表达FNDC5可以抑制血管内皮细胞的凋亡。

鉴于内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动环节，内皮细胞凋亡参与了动脉粥样硬化的进程，而鸢尾素可以改善内皮功能障碍并抑制内皮细胞凋亡[24，29-32]；人脐静脉内皮细胞因为其可以稳定传代，故此次实验拟选用人脐静脉内皮细胞作为细胞模型，通过构建FNDC5过表达载体稳转人脐静脉内皮细胞株，验证FNDC5对内皮细胞凋亡的影响，为后续进一步的探究奠定基础。
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1.1   设计   体外细胞学实验，组间比较使用单因素方差分析或Kruskal-Wallis 检验，两两比较采用t检验或秩和检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年4-11月在贵州医科大学分子重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   Stbl3感受态细胞、293T细胞购于美国ATCC生物资源中心，人脐静脉内皮细胞株(普诺赛)由贵州医科大学组织与细胞中心提供。
1.3.2   主要试剂和仪器   pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag慢病毒载体、EcoRⅠ和BamHⅠ限制性核酸内切酶、CPT高效转染试剂盒均购于上海和元生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京Takara有限公司；AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购于爱思进生物技术有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%Trypsin-EDTA及嘌呤霉素均购于美国Gibco有限公司；CCK-8试剂盒购于美国MCE有限公司；Hoechst 33342/PI试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物技术有限公司；Millex-HV 0.45 μm PVDF膜购于美国 Millipore 有限公司；FNDC5抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；β-actin抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；引物及测序均由上海生工有限公司完成。
1.4   实验方法   
1.4.1   细胞培养   293T细胞和人脐静脉内皮细胞分别使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM基础培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，镜下观察细胞密度达90%时进行传代；每25 cm2培养瓶中加入1 mL含EDTA的胰蛋白酶消化两三分钟，使贴壁细胞变圆、脱落，加入2 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM基础培养基终止消化；1 500 r/min离心5 min，弃上清液；加入6 mL新鲜培养基轻轻吹打重悬数十下，变成单细胞悬浮液后接种于2个25 cm2培养瓶中继续培养，传代至第3代后用于后续实验。
1.4.2   FNDC5慢病毒过表达载体的构建及鉴定   在Geen-bank中查找人FNDC5基因(NM-153756.2)上下游序列设计并合成引物，根据克隆所需在上下游经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切后回收小片段。取pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag载体，经双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳回收载体片段。将扩增后的目的基因FNDC5片段与酶切载体重组反应后，转入Stbl3感受态细胞，置于37 ℃培养箱中倒置恒温过夜。选取长出的转化子进行菌落PCR鉴定，对菌落鉴定得到的阳性克隆产物进行测序及比对分析，挑选测序结果与设计序列一致的产物用于后续实验。然后将构建成功的质粒pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-FNDC5-3xFLAG-WPRE与辅助包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装，最后进行滴度测定。滴度(TU/mL)=(C×N×1 000)/V，C为平均每基因组整合的病毒特定基因序列拷贝数，N为感染时细胞的数目，V为加入病毒的体积数。
1.4.3   FNDC5过表达慢病毒载体转染人脐静脉内皮细胞   取处于对数生长期人脐静脉内皮细胞，分3组培养：空白组不进行慢病毒转染，对照组转染不含FNDC5基因的空载体慢病毒，实验组转染FNDC5过表达慢病毒。提前1 d将细胞按3×105/孔密度接种于6孔板中，每孔加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液2 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养过夜。按照预实验感染复数=40加入含有慢病毒的培养基，培养12 h后更换培养液，继续培养72 h后，置于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。后加入嘌呤霉素(1 mg/L)对转染成功的细胞进行筛选，筛选7 d后得到稳转细胞株，进行后续实验。
1.4.4   慢病毒转染后的验证

RT-PCR检测FNDC5 mRNA表达：转染7 d后，收集6孔板中各组细胞，采用柱法提取总RNA，去DNA组后经反转录合成 cDNA，然后使用 SYBR Green Master Mix试剂盒进行实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)，用熔解曲线及扩增曲线分析排除非特异性扩增，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，进行40个循环。目的基因 FNDC5 上游引物序列：5'-GCT GGG ATG TTC TGG AGG AT-3'，下游引物序列：5'-TGG AGG CCA TCT TCT CAG C-3'；以 β-actin 作为内参基因， 上游引物序列5'-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3'，下游引物序列：5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3'。用 2-ΔΔCt 法计算目的基因相对表达水平：

∆Ct=实验组目的基因平均Ct值-空白组目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值。

Western blot检测FNDC5蛋白表达：转染7 d后，收集各组细胞，经PBS润洗后加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min；将裂解物转移至1.5 mL EP 管，于4 ℃下12 000 r/min 高速离心10 min，取上清液；加入4倍体积的5×Loading buffer，100 ℃条件下加热10 min，后采用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后恒流转膜至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶封闭目的条带，室温下封闭2 h，封闭结束后用 TBST溶液清洗3次。然后分别加入兔源FNDC5单克隆抗体(1︰1 000)、β-actin一抗(1︰6 000)，4 ℃孵育过夜；第2天用TBST洗膜3次，每次 15 min；之后加入羊抗兔IgG(1︰50 000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；洗膜后ECL显影用凝胶图像处理器分析图像，β-actin 作为内参照，目的蛋白与其灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。
1.4.5   氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡   根据相关文献及课题组的前期研究[27，33]，选用氧化低密度脂蛋白建立人脐静脉内皮细胞凋亡模型。取空白组、对照组、实验组细胞，提前1 d按3×105/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液2 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养过夜。第2天更换培养基，加入含氧化低密度脂蛋白(100 mg/L)的培养基2 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2 细胞培养箱中培养。

CCK-8 法检测细胞活性： 将空白组、对照组、实验组细胞接种于96孔板中，接种密度为5×103/孔，按照如上方法诱导细胞凋亡，置于37 ℃、体积分数5%CO2 细胞培养箱中培养。培养1，2，4 h后，每孔加入CCK-8试剂20 μL，采用酶标仪测定各孔吸光度值A450。各组细胞实验独立重复3次，取平均值。

Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡：加入氧化型低密度脂蛋白24 h后，使用PBS润洗各组细胞，依据Hoechst 33342/PI双染试剂盒说明书先后加入1 mL细胞染色缓冲液、5 μL Hoechst染色液、5 μL PI染色液，混匀后冰上孵育30 min，再用PBS洗涤1次，置于倒置荧光显微镜下检测荧光。

流式细胞技术检测细胞凋亡：加入氧化型低密度脂蛋白24 h后，PBS润洗各组洗细胞2次；用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，12 000 r/min 离心5 min，去掉上清液；用PBS重悬细胞，该过程重复1次；加入500 μL Binding buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin-V-FITC混匀后，加入5 μL PI染色液，室温下避光反应10 min，流式细胞仪上机检测。 
1.5   主要观察指标   各组细胞凋亡情况。
1.6   统计学分析   应用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，数据采用x±s表示。组间比较使用单因素方差分析或Kruskal-Wallis 检验，两两比较采用t检验或秩和检验。显著性水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

基因工程是在分子水平上将重组外源基因导入靶细胞，使目的基因在宿主内复制、转录、翻译的一项技术。生物工程重组病毒是将外源基因导入靶细胞的首选载体，可协助遗传信息进入细胞，并在被转染细胞中表达其基因组包。目前最常见的用于基因工程的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，相比于其他病毒载体，慢病毒载体具有转染效率高、转染细胞广泛、靶基因表达稳定且持久等优势，已经成为基因治疗应用和基础生物医学研究的常规基因载体[34-36]。慢病毒主要来源于HIV-1病毒，由3个质粒组成，可将目的基因整合到靶细胞染色体中，使靶细胞始终保持稳定的基因改变，从而筛选出稳定的细胞系，因此受到研究人员的关注，其使用的安全性也越来越高[37-38]。近年来，慢病毒被广泛应用于心血管疾病的机制探讨和基因治疗应用[38]。参考课题组前期研究，作者拟通过基因重组技术构建FNDC5过表达慢病毒载体pLenti-FNDC5-EGFP-3FLAG-PGK-Puro，并经过鉴定、包装导入人脐静脉内皮细胞，之后通过观察镜下绿色荧光、检测FNDC5 mRNA及蛋白表达确定FNDC5过表达人脐静脉内皮细胞株构建成功。氧化型低密度脂蛋白是诱导动脉粥样硬化形成的关键因素，参与了泡沫细胞及粥样斑块的形成。在动物实验及体外实验中，氧化型低密度脂蛋白常常被用作细胞凋亡模型的诱导剂，可诱导小鼠血管内皮出现凋亡，而巨噬细胞及平滑肌细胞在氧化型低密度脂蛋白作用下可发生凋亡及形成泡沫细胞。人脐静脉内皮细胞因其具有干细胞潜能，可进行多次传代，因此常被用作血管内皮实验的细胞模型。实验前期通过设置氧化型低密度脂蛋白浓度梯度，最终选择150 mg/L作为氧化型低密度脂蛋白的处理质量浓度，利用氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞构建内皮细胞凋亡模型。

此次实验利用基因工程原理，经基因剪切、基因重组及转染培养后成功构建了pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-FNDC5-3xFLAG-WPRE质粒，经包装后得到了高滴度的FNDC5过表达慢病毒载体。该载体携带绿色荧光蛋白，因此在转染人脐静脉内皮细胞后可通过荧光显微镜下观察绿色荧光强度及数量，以确定转染效率。在FNDC5过表达慢病毒载体转染人脐静脉内皮细胞72 h后，荧光显微镜下观察到绿色荧光，再经过嘌呤霉素筛选7 d后，看到成片稳定的绿色荧光，RT-PCR和Western blot检测结果也证实FNDC5稳定过表达的人脐静脉内皮细胞株构建成功。

FNDC5是一种新发现的肌肉因子，可由运动诱导释放，心肌或骨骼肌是其产生的主要来源。FNDC5经水解修饰后形成鸢尾素[13]，鸢尾素是一种对身体有益的保护性激素，目前越来越多的研究证实了FNDC5/鸢尾素具有抗动脉粥样硬化的作用[18-20，24]。脂肪组织是鸢尾素重要的靶器官，鸢尾素可促进白色脂肪组织棕色样变，上调脂解相关基因，从而减少脂肪细胞中脂质堆积，调节体脂代谢及改善胰岛素抵抗，降低动脉粥样硬化的发生风险[39-40]。鸢尾素具有抗氧化应激和抗炎症作用，可激活抗氧化物酶活性、上调抗炎因子水平、抑制炎症因子的释放，从而抑制氧化及炎症反应[41-42]。在氧化型低密度脂蛋白诱导的平滑肌细胞凋亡模型中发现，FNDC5可通过下调酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶1、上调ATP 结合盒转运子A1表达，减少胞浆内脂滴和胆固醇的累积以阻止泡沫细胞的形成[25]，前期实验也证实过表达FNDC5可以抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，抑制平滑肌细胞的增殖与迁移，减少血管内膜增厚[27-28]。细胞凋亡是常见的细胞程序性死亡，是维持身体发育和机体稳态等所必需的基本过程，同时也参与了多种疾病的病理过程，如神经退行性疾病、动脉粥样硬化等。多项研究表明血管细胞凋亡与动脉粥样硬化的发病机制有关，其中血管内皮细胞凋亡可吸引血小板和促凝因子的黏附，促进动脉粥样硬化病变的发展和并发症的产生[14，43]。

鉴于血管内皮细胞凋亡参与了动脉粥样硬化的发生发展及并发症的产生，因此积极寻找抑制血管内皮细胞凋亡的药物及方法对控制动脉粥样硬化治疗冠心病具有重要意义。此次实验在FNDC5稳定过表达人脐静脉内皮细胞株构建成功的基础上，利用氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡，同时检测过表达FNDC5对细胞活性及细胞凋亡的影响。结果显示，在加入氧化型低密度脂蛋白后，各组细胞均出现了凋亡，相比之下FNDC5过表达组细胞凋亡程度明显低于另外两组，细胞活性也高于其他两组，表明FNDC5过表达可以在一定程度上抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。基于此，作者合理推测FNDC5可通过抑制血管内皮细胞凋亡、维护血管内皮功能来抑制动脉粥样硬化。然而实验仅局限于体外细胞实验，即便在一定程度上能说明FNDC5可以抑制血管内皮细胞凋亡，从而对动脉粥样硬化有一定的抑制作用，但由于没有模拟体内环境，尚需要体内实验及临床数据对此次实验结果进行论证。此外，此次实验并未对FNDC5调控血管内皮细胞凋亡的分子途径进行探讨，因此还需要进行后续实验对具体的作用位点、下游作用分子进一步检测。

此次实验结果显示，FNDC5过表达可以抑制血管内皮细胞凋亡，从而抑制动脉粥样硬化的进程及并发症。然而其作用的分子机制尚未阐明，FNDC5是通过水解为鸢尾素发生作用还是可以直接抑制血管内皮细胞凋亡还有待验证；此外，体外细胞实验也不能完全模拟FNDC5对体内动脉粥样硬化病变的作用。作者下一步拟继续通过体外细胞实验探讨FNDC5调控血管内皮细胞凋亡的作用与分子机制，期待进一步明确FNDC5在抑制动脉粥样硬化及冠心病的治疗方面所扮演的角色，为FNDC5治疗心血管疾病提供新的理论依据。
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文题释义：
Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5：是一种由运动诱导产生的肌肉因子，其本质是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，骨骼肌细胞及心肌细胞是其产生的主要来源。Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5经蛋白水解酶作用后剪切修饰形成鸢尾素(Irisin)，鸢尾素可以调节糖脂代谢、抑制炎症反应，抑制动脉粥样硬化进程，此外其可通过不同途径抑制细胞凋亡。
鸢尾素：是由Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5蛋白水解形成的一种多肽激素，由112个氨基酸构成，分子质量约12 kD，其在不同的物种间具有高度同源性。鸢尾素可以上调棕色化相关基因，并通过p38 MAPK和ERK信号通路促进白色脂肪棕色化，燃烧脂肪增加能量代谢，减轻体质量及改善胰岛素抵抗。血清内鸢尾素水平与2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、慢性肾病、牛皮癣、骨质疏松症、高血压、动脉粥样硬化和癌症等主要慢性疾病之间存在明显的关联。

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此次课题思路主要通过参考课题组前期研究以及相关文献，得到Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5对动脉粥样硬化有抑制作用的结论。而血管内皮损伤是动脉粥样硬化的始动环节，血管内皮细胞凋亡参与了动脉粥样硬化的进程，故作者将Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5与血管内皮细胞凋亡联系起来，提出Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5可以通过抑制血管内皮细胞凋亡从而减缓动脉粥样硬化进程，然后通过诱导体外血管内皮细胞凋亡，以及设置对照组验证Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5抑制血管内皮细胞凋亡的作用。鉴于Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5在人体的低表达，此次实验运用基因工程原理，构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达的慢病毒质粒，再将该质粒转入人脐静脉内皮细胞，获得Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达的人脐静脉内皮细胞株，后续研究均围绕该细胞株展开。由于Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5的低表达，作者选择诱导细胞自身过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5而不是通过外源添加Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5进行试验，这可以减少外源途径可能出现的加样不均及最适浓度的选择上的错误，也让实验结果更具备说服力。

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