2.1   实验动物数量分析   实验选用SD大鼠30只，分为3组，全部进入结果分析。
2.2   跑台运动改善糖尿病大鼠的认知能力   为了评估跑台运动对SD大鼠脑损伤的作用，选用了Morris水迷宫法检测SD大鼠空间定位的学习能力。相较于对照组，模型组大鼠在定位航行实验中逃避潜伏期明显延长，在空间探索测试中穿越平台的次数也明显减少，游行轨迹也更加复杂，表明糖尿病模型大鼠出现空间记忆受损，认知出现损伤。然而，经过8周跑台运动干预后，相较于模型组，运动组大鼠的逃避潜伏期显著缩短，穿越平台次数明显增加，行为学轨迹更加简单。以上结果提示，跑台运动可能是改善糖尿病大鼠的空间学习障碍和记忆缺陷的有效途径，见图1。



2.3   跑台运动减轻糖尿病大鼠海马神经元的损伤    海马神经元的损伤是糖尿病的重要病理表现，因此利用尼氏染色观察海马组织神经元结构变化。对照组大鼠的海马各区尼氏体大而且数量多，胞体未出现皱缩情况，神经元胞核明显，突触清晰，排列整齐；但链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠海马各区尼氏体较小，数量减少，胞体皱缩，胞核缩小，排列疏松，表明链脲佐菌素造成SD大鼠海马神经元结构改变。与模型组相比，运动组大鼠海马尼氏体增大，数目显著增加，形态结构趋向正常，表明跑台运动干预在一定程度上有助于防治和延缓链脲佐菌素引起的海马神经元的损伤，见图2。



2.4    跑台运动增加糖尿病大鼠脑源性神经营养因子的表达    为了探讨跑台运动对神经营养因子分泌情况的影响，利用Western blot分别检测了各组海马组织脑源性神经营养因子和CREB的蛋白表达水平。与对照组相比，模型组p-CREB/CREB比值和脑源性神经营养因子表达显著下调(P < 0.05，P < 0.001)，表明在糖尿病病理进程中CREB和脑源性神经营养因子表达受阻。然而，相较于模型组，经过8周运动干预后，运动组CREB和脑源性神经营养因子蛋白表达水平都有明显的恢复(P < 0.01，P < 0.001)，表明跑台运动可以提高CREB磷酸化，促进脑源性神经营养因子的表达，见图3。



2.5   跑台运动降低糖尿病大鼠海马组织细胞周期和凋亡相关蛋白的表达    为了探讨跑台运动干预对SD大鼠海马组织细胞周期和神经细胞凋亡的保护作用，使用NeuN染色观察海马神经元形态结构改变和特异性数目变化，并通过Western blot实验进一步检测细胞周期相关蛋白CDK5、cyclin D1和凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。
2.5.1   NeuN染色结果   对照组大鼠海马各区NeuN特异性标记的细胞数量多、胞核清晰、核仁明显、排列有序；相较于对照组，模型组糖尿病大鼠海马组织NeuN标记的细胞数量显著减少、核固缩、结构松散、排列紊乱。而相较于模型组，运动组大鼠海马组织NeuN标记细胞数量增多，细胞形态结构趋向正常，且排列更加紧密。说明跑台运动可有效减轻神经元损伤，见图4A。
2.5.2   Western blot结果   相较于对照组，模型组CDK5、cyclin D1和Caspase-3蛋白的表达明显上调(P < 0.05，P < 0.001)；而8周跑台运动减少了细胞周期蛋白和促凋亡蛋白Caspase-3的表达(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，结果说明8周跑台运动干预可以调节链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠细胞周期，并抑制海马神经元凋亡，见图4B。



2.6    跑台运动降低糖尿病大鼠衰老相关蛋白的表达    利用Western blot检测进一步探讨跑台运动对糖尿病大鼠海马内衰老相关蛋白表达的影响。实验数据显示，模型组糖尿病大鼠海马中的p53和p16蛋白水平明显高于对照组(P < 0.05，P < 0.001)，另外，与对照组相比，发现模型组大鼠海马中Sirt1表达显著下降(P < 0.001)，经过8周跑台运动干预，运动组大鼠海马中的p53和p16显著下调(P < 0.01)，并恢复了抗衰老蛋白Sirt1的表达(P < 0.001)，说明8周跑台运动减轻了糖尿病大鼠的脑衰老，见图5。



2.7   跑台运动激活糖尿病大鼠Wnt/β-catenin信号通路   为了进一步探讨8周跑台运动改善糖尿病大鼠认知功能是否依赖Wnt/β-catenin信号通路，进行了Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白的检测。结果显示：与对照组相比，糖尿病模型组海马组织中DKK-1和Axin1的表达增多(P < 0.01)，并伴随着β-catenin磷酸化在Ser33、Ser37、Thr41位点高表达；而运动干预降低了DKK-1、Axin1及下游β-catenin的表达(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，见图6。

综上，糖尿病大鼠中DKK-1蛋白表达增多，导致Wnt/β-catenin信号通路的启动受到抑制，因此使海马中的β-catenin磷酸化和Axin1增加抑制Wnt转录，而运动激活了Wnt/β-catenin信号通路，表明跑台运动改善糖尿病大鼠的认知功能可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来实现的，因此调节糖尿病脑内的Wnt/β-catenin信号通路可能为减缓糖尿病病理进程提供可能。

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糖尿病是一种无法治愈且进行性发展的代谢性疾病，主要由胰岛素抵抗和自身免疫性β细胞破坏所引起，慢性的高血糖与机体不同组织结构的改变和功能衰竭密切相关，尤其是视觉感受器、泌尿系统、神经系统、心血管系统等[1]。糖尿病最常见的并发症之一就是糖尿病中枢神经系统病变，主要表现为记忆力减退、注意力不集中、学习能力下降，随着疾病进行性加重，后期可表现为严重痴呆，导致患者的执行功能障碍[2-3]。随着经济高速健康发展，人均寿命的延长加上久坐的生活习惯致使全球糖尿病的患病率逐年增长，国际糖尿病联合会(IDF)报道指出2019年全球糖尿病人数为4.63亿，2045年后可能会上升到7亿[4]。据报道，中国成人糖尿病患病率为11.6%[5]，其中有60%-70%的糖尿病患者会逐渐出现不同程度的认知障碍[6]。但现在临床上传统的降血糖治疗并不能终止或逆转糖尿病所致的认知障碍进程，因此，急需找到有效治疗糖尿病所致认知障碍的方法。

Wnt信号传导是一种保守的细胞传导通路，在组织的发育、维持机体的稳态以及众多疾病中起关键作用[7-10]。INESTROSA等[11]指出Wnt/β-catenin信号传导阻断是导致 β-淀粉样蛋白产生和聚集的原因之一，是阿尔茨海默病的触发因素。GARCIA-VELAZQUEZ和AGHAIZU等[12-13]在研究中指出Wnt/β-catenin信号在阿尔茨海默病患者脑组织中表达下调。作者所在团队最新的研究表明不同形式的运动干预可以激活自然衰老大鼠海马Wnt/β-catenin信号通路，调节突触可塑性，改善脑衰老[14]。MENET等[15]研究也发现，Wnt拮抗剂DKK-1能够抑制Wnt/β-catenin信号传导，导致神经原纤维缠结、淀粉样蛋白沉积，从而使突触损伤甚至神经元死亡。以上研究提示，Wnt/β-catenin信号通路在认知功能中发挥重要作用，Wnt/β-catenin信号通路的下调或者阻断可能介导糖尿病的病理改变，导致认知功能障碍，而运动可以激活Wnt/β-catenin信号通路。

目前由于糖尿病所致认知障碍发病的确切机制尚不清楚，临床缺乏治疗糖尿病所致认知障碍的特效药物，而细胞周期和神经凋亡以及细胞衰老参与糖尿病所致认知障碍的发生与发展[16-21]。运动领域的研究发现，运动干预能够改善阿尔茨海默病患者和阿尔茨海默病动物模型的认知功能[22-24]。并有研究数据显示运动对糖尿病所致的认知障碍也有积极的影 响[25-26]。且越来越多的证据表明Wnt/β-catenin信号下调与认知障碍性疾病的发病机制存在着密切联系[27-30]，但是，现有文献中关于运动介导Wnt/β-catenin信号与细胞周期和神经凋亡以及细胞衰老关系的研究报道较少。所以，此研究探索跑台运动是否能够激活Wnt/β-catenin信号通路来调控细胞周期和神经凋亡，抑制神经细胞衰老，改善糖尿病所致的认知障碍，为神经退行性疾病的防治提供有效的方法和思路，更为倡导体育运动这一种较低成本的、非药物手段干预老年慢性疾病提供有效的理论参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，组间比较使用单因素方差分析和t检验。
1.2   时间及地点   实验于2018年3-9月在武汉体育学院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   选用30只2月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量为250-350 g，均为SPF级，由湖北省疾病预防控制中心提供，生产许可证编号：SYXK(鄂)2016-0087。所有大鼠在温度(22±2)℃、湿度50%-70%、明暗周期12 h∶12 h的环境中饲养。实验方案经湖北省实验动物伦理委员会批准(批准号为00271517)，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。在动物实验过程中尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   高脂饮食   高脂饲料购于武汉市武昌区春之龙实验动物饲料有限公司(66.5%维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+1%胆酸钠)。
1.3.3   实验主要仪器和试剂   电泳仪(北京市六一仪器厂)；转膜电泳仪(海天能科技有限公司)；发光仪(上海勤翔)；酶标仪(Thermo赛默飞)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；样品快速处理系统(上海净信实验设备)；大鼠恒温游泳池(上海继德教学实验器械厂)；离心机(Eppendorf艾本德)；制冰机(广州市广坤电器制造有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司三洋科研医疗设备)；超纯水制造系统(程度超纯科技有限公司)；微量移液器(北京大龙公司)；抗NeuN抗体(Abcam)；一抗抗体[环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)、脑源性神经营养因子、CDK5、cyclin D1、Sirt1、Caspase-3、p53、p16、DKK-1、Axin1、β-catenin]；二抗抗体(Cell Signaling Technology)；ECL 化学发光超敏显色试剂盒(联科生物)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；SDS-PAGE 凝胶试剂盒(谷歌生物)；分装蛋白 Marker(Fermentas)；细胞裂解液(谷歌生物)。
1.4   实验方法   
1.4.1   动物分组和运动干预方案   购买的实验大鼠先适应性喂养1周，所有大鼠采用随机数字表分组方式随机分为2组，对照组10只，模型组20只。模型组大鼠4周高脂饲养结束后，利用高脂饮食联合链脲佐菌素(25 mg/kg)构建糖尿病模型，将链脲佐菌素溶解于浓度为0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲液，配置成pH为4.5的溶液，低温避光，现配现用，大鼠称质量后腹腔给药，并继续给予高脂饮食。28 d后尾静脉采血检测随机血糖，以血糖≥16.7 mmol/L视为成功建立糖尿病模型。对照组大鼠给予相同体积的柠檬酸钠缓冲液。随机选取10只糖尿病大鼠作为糖尿病运动组。运动方式采取无坡度的跑台运动，12 m/min，40 min/次，5次/周，持续8周，干预时间固定为每天20：00。

1.4.2   Morris水迷宫测试   Morris水迷宫由一个直径150 cm、深度为50 cm的开放型圆形水池组成。将充满水的圆形水池等分为4个象限，在4个象限中确认不同的起始位置并做标记，与水池同样颜色的圆形平台被淹没在其中一个象限的水下2 cm处，大鼠需在水池中探索并尽可能找到目标平台。

8周运动干预后，对大鼠进行Morris水迷宫测试。正式的行为测试前进行5次预实验，将各组大鼠提起头朝下并面向池壁，分别从4个不同的起始位置放入圆形游泳池适应性游泳，大鼠一放入水中立即启动计算机跟踪程序，2 min内未找到目标平台的大鼠引导到平台并停留15 s。正式测试时从池中取出平台，具体操作同预实验。记录各组SD大鼠的逃避潜伏期、游行轨迹和穿越平台的次数，检测大鼠空间定位的学习能力。
1.4.3   样品采集   Morris水迷宫测试结束后进行取材。将含有乙醚的纱布放在大烧杯中，随后将SD大鼠放入，待动物兴奋性抑制后取出断头，在冰块上迅速提取SD大鼠的全脑和海马组织，每组任意选取3个全脑放入组织固定液中固定，将其余组织放置到提前标记好组别的无菌冻存管中，暂时保存于干冰中，随后转移到-80 ℃冰箱保存，供后续测试使用。
1.4.4   尼氏染色   各组大鼠海马组织置于40 g/L的多聚甲醛中浸泡30 min，取出放入蔗糖溶液数分钟后，将下沉到蔗糖溶液的海马组织取出，用不同浓度梯度的乙醇浸泡，二甲苯中浸泡透明，最后中性树脂胶固封。在荧光显微镜下观察尼氏体的形态、结构和数量，并拍照保存。
1.4.5   NeuN免疫荧光染色   从冰箱中取出脑片，置于室温中复温；然后接种到载玻片上，再进行NeuN的免疫细胞化学染色。简单步骤如下：PBS 清洗(3次×5 min)，将切片放入体积分数5%的正常山羊血清中室温下孵育1 h，然后孵育抗NeuN抗体4 ℃过夜(1∶400)，PBS清洗(3次×5 min)，加入二抗工作液室温孵育1 h，PBS再次清洗(3次×5 min)，随后在表面均匀涂抹DAB显色，观察海马神经元形态结构改变和特异性数目变化。
1.4.6   Western blot 实验   将海马组织加入到裂解混合液(PMSF和细胞裂解液按1∶100的比例配制而成)，匀浆机进行组织匀浆3次，然后超声裂解细胞，离心提取上清，BCA试剂盒测浓度，随后加入loading buffer，煮样10 min使蛋白变性，冷却后放入-20 ℃冰箱保存。制备分离胶和浓缩胶，孔中加入相应的蛋白样品，并加入Marker做标记，当溴酚蓝到凝胶底部，停止电泳，将凝胶分离的蛋白转移到PVDF膜上(90 min)，转膜结束后将PVDF膜置于室温摇床上封闭1 h，TBST缓冲液清洗(3次×15 min)，根据目的蛋白的分子质量大小剪取所需条带，放入按照1∶1 000的浓度稀释的一抗溶液，并放置在4 ℃摇床上孵育过夜，TBST缓冲液清洗(3次×15 min)，再将条带放入1∶10 000的浓度稀释的二抗溶液，并置于室温摇床上孵育1 h，TBST缓冲液清洗(3次×15 min)，ECL工作液显影曝光(1∶1混合)，曝光采集图片，所有图片密度通过Image J软件量化，获得相应条带的灰度值。Western blot检测海马组织脑源性神经营养因子和CREB蛋白表达，细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达，衰老相关蛋白表达及Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白(DKK-1、Axin1、p-β-catenin及β-catenin)的表达水平。
1.5   主要观察指标   ①大鼠的认知能力；②海马神经元的损伤；③海马组织脑源性神经营养因子和CREB蛋白的表达水平；④海马组织细胞周期和凋亡相关蛋白的表达水平；⑤衰老相关蛋白的表达水平；⑥Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白的表达水平。
1.6   统计学分析   所有实验数据均利用EXCEL 2013版录入，并采用SPSS 26.0统计分析，使用单因素方差分析和t检验，随后将分析所得的各组数据输入Graphpad Prism 8.0绘制统计图。文章统计学方法经过武汉体育学院统计学专家审核。

研究表明，在中枢神经系统退行性改变的病理进程中，认知障碍程度会进行性加重。因此，预防是降低神经系统退行性疾病死亡率很重要的方式，但是久坐不动的生活方式加上人均寿命的延长，糖尿病患者日益增多，加之人口老龄化进程的加快更易引起认知障碍，导致糖尿病相应病理改变和行为症状出现。比如，持续的高血糖引起细胞周期的异常导致神经元结构改变，胞外β-淀粉样蛋白生成和凝聚增加，胞内tau蛋白异常磷酸化，从而增强其神经毒性作用并导致神经功能异常，同时此病理改变会激活细胞凋亡相关信号通路，但细胞凋亡通路的过度激活，不仅会清除错误折叠的蛋白质和受损的细胞器，还会导致大量正常神经元丢失，加速衰老和认知障碍进程[31]。因而，在调节细胞周期的同时，还需要提高正常神经细胞抵抗凋亡和衰老的能力。此次研究结果显示，细胞周期和神经凋亡以及衰老相关蛋白在糖尿病模型中的表达明显增加，研究需要在此基础上验证8周跑台运动干预是否能下调细胞周期和神经凋亡以及衰老相关蛋白表达？运动干预下调细胞周期和神经凋亡以及衰老相关蛋白后是否对糖尿病大鼠空间学习记忆能力和海马区神经元的丢失相关分子表达产生影响，并探讨运动是否可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路改善糖尿病大鼠认知功能障碍。

空间记忆缺陷是糖尿病脑内病理进程中出现的典型临床表现,因此,此次研究先通过水迷宫测试检测了SD大鼠的空间学习和记忆功能。水迷宫的实验数据显示：与对照组相比，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，游泳轨迹更加复杂，并且穿越靶平台的次数减少，难以找到目标平台，说明糖尿病大鼠出现了空间记忆障碍；其次，通过尼氏染色的形态学结果分析发现，与对照组相比，模型组海马组织中尼氏体较小，数量减少，尼氏体模糊，胞体皱缩，胞核缩小，排列紊乱，表明糖尿病大鼠海马神经元结构被破坏，符合糖尿病神经元形态结构变化，提示SD大鼠海马神经元结构存在损伤并表现出空间记忆障碍，证明糖尿病模型创建成功。

细胞周期蛋白cyclin D1是神经细胞从静止期进入到G1期的关键调节分子，正常情况之下cyclin D1一般均匀表达使神经细胞迅速进入到G1期，并在S期发生DNA复制从而使神经细胞进入G2期。但当cyclin D1出现过表达时，神经细胞可以越过静止期直接进入到G1期，并在S期进行DNA复制，甚至能够进入到G2期。但是这种细胞周期的调控不是一种正常的细胞周期过程，随后启动的细胞周期程序也是不完整的，导致细胞无法完成分裂从而转向凋亡[32]。此次研究结果显示：与正常大鼠相比，糖尿病大鼠模型中cyclin D1蛋白表达明显增加(P < 0.001)，而8周跑台运动明显降低了cyclin D1的表达(P < 0.01)，从而抑制了异常细胞周期的进程，对神经细胞起到了保护作用。

CDK5是丝氨酸-苏氨酸激酶家族的一员，在中枢神经系统中起关键作用，可以调节神经的再生、突触可塑性以及参与整个神经的发生发展过程。但CDK5的异常激活或者数量上的改变会促进tau蛋白的过度磷酸化，加速神经原纤维缠结的形成，从而导致细胞支架形成异常和神经退行性改变[33]。ZHOU等[34]在EFAD-Tg小鼠模型中观察到CDK5的过度激活和tau蛋白的异常磷酸化，说明CDK5的异常激活导致模型小鼠神经细胞结构改变，从而引起认知功能损害。这与此次研究在糖尿病大鼠模型中检测到CDK5的表达增多结果是一致的(P < 0.001)，运动干预降低了CDK5蛋白表达水平(P < 0.05)，说明运动可以抑制CDK5的表达调节细胞周期。细胞周期的异常是诱导细胞转向凋亡的原因之一。CDK5等细胞周期蛋白是神经元凋亡的关键调节因子，可通过调节胞内磷脂酰肌醇激酶3 (PI3K)和Akt活性维持细胞正常生理功能，也可以通过调节JNK3通路介导神经元凋亡[35]。细胞凋亡是一个高度调节的细胞程序性死亡的过程，与神经的发育、细胞的更新、内环境的稳定以及疾病的病理进展密切相关。在5XFAD小鼠模型研究中发现，Caspase-3和NeuN双染检测到神经元出现丢失[36]，说明模型小鼠在神经退行性改变的进程中出现神经元凋亡。此次研究发现跑台运动抑制了细胞凋亡。NeuN染色是鉴别神经元是否成熟和观察成熟神经元数量变化的常用方法。根据NeuN染色结果：模型组大鼠海马神经元丢失且存在结构损伤，而经过8周跑台运动干预后明显改善，提示跑台运动可以减少糖尿病大鼠神经元丢失，改善神经元结构。Caspase-3是细胞凋亡的主要执行蛋白，作为细胞凋亡的关键标志，在神经退行性疾病、认知障碍性疾病中发挥重要的作用；与对照组相比，模型组Caspase-3表达水平上调(P < 0.05)，而经过8周跑台运动干预后均能显著性降低糖尿病大鼠神经凋亡蛋白Caspase-3的表达(P < 0.001)。上述实验数据说明，海马组织中神经细胞的过度凋亡可能是导致糖尿病大鼠认知功能障碍的原因之一，而8周跑台运动干预可以抑制细胞凋亡，减少神经细胞丢失，改善认知功能障碍。

细胞周期的停滞是导致机体出现衰老的直接原因。端粒的受损是导致端粒酶活性缺乏的重要因素，而端粒酶活性缺乏将会导致细胞周期停滞。AIN等[37]在25-27个月的C57小鼠模型的大脑皮质神经元中发现，G0 /G1和 G2 /M期皮质神经细胞的端粒长度减少，说明皮质神经元随着年龄的增长而发生端粒缩短，表明在小鼠衰老进程中出现细胞周期停滞。为了探讨在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中脑衰老的变化，此次研究检测了衰老相关蛋白Sirt1、p53以及p16的表达水平。Sirt1是乙酰化酶的同系物，是一种长寿因子，也是p53的底物，p53和p16是细胞衰老的负性调节因子，与细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老、DNA结合和转录、细胞增殖分化、线粒体功能障碍等重要的生物学功能密切相关，p53和p16的激活可以诱导细胞衰老，可作为细胞衰老的生物学标志[38]。数据显示，Sirt1在模型组大鼠海马中下降(P < 0.001)，p53和p16表达上调(P < 0.001，P < 0.05)，说明糖尿病大鼠出现衰老，而8周跑台运动干预后，促衰老蛋白p53和p16蛋白表达下降(P < 0.01)，抗衰老蛋白Sirt1水平明显增加(P < 0.001)，提示8周跑台运动可以调节Sirt1和p53以及p16的表达，延缓糖尿病大鼠的脑衰老。

MODI等[39]在APP/PS1双转基因小鼠模型研究中指出， cyclin D1和cleaved Caspase-3表达显著增加，免疫荧光染色也发现神经元数量减少，在β-淀粉样蛋白42处理的原代皮质神经元和SH-SY5Y细胞中也得到一致的结论，说明在模型小鼠中细胞周期停滞并出现细胞凋亡。CHAUHAN等[40]在SD大鼠皮质神经元中孵育β-淀粉样蛋白 42发现细胞周期相关蛋白PCNA和细胞凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3表达增加，说明β-淀粉样蛋白 42导致细胞周期异常并诱导细胞凋亡。SAH等[41]发现在脑衰老中，细胞周期停滞，并激活了凋亡相关通路诱导神经细胞凋亡。综上所述，细胞周期的停滞可以导致细胞过度凋亡，诱导细胞衰老。即使在有利的生长条件下，衰老细胞也不能产生应答，无法重新进入细胞周期，反之，细胞出现衰老又会阻碍组织的修复和组织的再生，破坏组织的稳态，从而阻止细胞周期进程，表明细胞周期停滞与细胞衰老之间可能形成恶性循环，然而此次研究发现跑台运动可以调节神经细胞的周期而抑制神经细胞凋亡，同时减缓细胞的衰老进程。SOLTANIAN等[42]在β-淀粉样蛋白 1-42诱导的星形胶质细胞研究中发现，CDK5不管是在蛋白水平还是基因水平表达都升高，通过流式细胞检测分析和Hoechst染色发现细胞周期停滞，并出现细胞凋亡，增加了tau蛋白磷酸化，当抑制CDK5时，出现相反的结果，说明抑制CDK5可以减少tau蛋白磷酸化，对神经元的结构和功能具有保护作用。此次研究也显示运动可以降低CDK5的表达，对改善认知功能有积极的作用。KIM等[43]在SD大鼠侧脑室立体定位注入β-淀粉样蛋白诱导阿尔茨海默病模型的研究中发现，8 m/min，30 min/次，7次/周，持续4周的跑台运动后TUNEL阳性细胞和Caspase-3阳性细胞的数量明显减少，细胞凋亡被抑制。FARIOLI-VECCHIOLI等[44]也指出有氧运动训练可通过调节细胞周期、抑制细胞凋亡，从而预防或减缓神经退行性疾病进程。BIANCHI 等[45]在nfkb1 -/-小鼠研究中指出，3个月的跑台运动干预减轻了衰老。上述结果与此次实验在糖尿病大鼠模型中得到的研究结果是一致的，此次研究中采取跑台运动调节细胞周期和神经凋亡及衰老，根据NueN染色可以发现海马中阳性细胞的数量明显增加，并通过Western blot相应蛋白检测进一步验证了海马细胞周期蛋白的调节以及神经凋亡的抑制对海马组织的保护作用。说明运动可以调节细胞周期，提高神经细胞抗凋亡和抗衰老的能力，延缓成熟神经细胞的丢失，从而影响空间学习记忆能力，改善认知功能。

为了探讨运动干预改善链脲佐菌素大鼠认知功能的机制，此次实验接下来对Wnt/β-catenin信号通路进行了研究。Wnt/β-catenin信号传导包括两个蛋白复合物的形成：在没有Wnt配体的情况下，转录因子β-catenin被支架蛋白Axin、APC蛋白和糖原合成酶激酶3β组成的复合物降解；Wnt配体与寡聚化蛋白复合物Frizzled-LRP5/6 结合并阻断β-catenin的磷酸化和降解，在细胞质中积累的β-catenin将转移到细胞核。β-catenin一旦进入细胞核，将与T细胞因子/淋巴增强因子(LEF/TCF)转录因子结合，启动Wnt转录。因此在此次实验中用Western blot检测了通路关键蛋白(DKK1、Axin1、β-catenin)的表达。结果显示，糖尿病大鼠中DKK-1和Axin1的表达增多(P < 0.001，P < 0.01)，并发现β-catenin在Ser33、Ser37、Thr41位点磷酸化明显增加(P < 0.001)，这表明在糖尿病进程中Wnt信号受到抑制，这可能是由于病理样蛋白沉积使DKK1表达增加所导致[29，46-47]。然而运动干预抑制了DKK-1和Axin1以及p-β-catenin和Ative β-catenin的表达(P < 0.05)，说明运动降低了DKK-1蛋白的表达，抑制了破坏复合体的形成，激活了Wnt/β-catenin信号通路。 BAYOD等[48]在SAMP8小鼠研究中发现Wnt/β-catenin信号通路下调。JIN等[49]在3xTg-AD转基因小鼠研究中发现，转基因小鼠脑内海马Wnt/β-catenin信号传导抑制，阿尔茨海默病模型小鼠出现β-淀粉样蛋白生成增多，tau蛋白过度磷酸化。同时WANG等[50]研究也发现，在PC12细胞模型中激活Wnt/β-catenin信号通路可减少β-淀粉样蛋白 25-35产生和聚合，当Wnt/β-catenin信号通路被抑制时则产生相反的作用，表明激活Wnt/β-catenin信号通路可以抑制β-淀粉样蛋白 25-35对PC12细胞的神经毒性作用。NING等[51]研究发现，在β-淀粉样蛋白诱导阿尔茨海默病模型中，大鼠脑内海马组织出现Wnt/β-catenin信号通路抑制，并出现空间学习和记忆障碍。除此之外，张楠等[52]的研究发现运动干预能够调控阿尔茨海默病模型小鼠认知功能障碍。虽然上述研究与此研究的动物模型不一样，但是研究结果均发现在认知障碍进程中Wnt/β-catenin信号通路下调，此次研究结果还显示8周跑台运动可以激活Wnt/β-catenin信号通路。因而，研究得到如下结论：跑台运动可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路调节细胞周期、减少神经细胞凋亡从而改善糖尿病大鼠的衰老和认知功能。除此之外，CREB是神经元损伤后修复的关键调节因子，研究数据表明，在糖尿病状态下，神经营养因子表达减少，表现为CREB磷酸化和其下游蛋白脑源性神经营养因子的表达下降(P < 0.01，P < 0.05)，而跑台运动介入后恢复了CREB磷酸化和脑源性神经营养因子的表达(P < 0.01，P < 0.05)，表明运动可能是促进神经营养因子的分泌、保护神经细胞的有效方式。 

结论：糖尿病伴随着认知功能的减退，后期甚至严重影响患者的日常生活，给患者带来诸多不变，虽然糖尿病认知功能障碍的进程无法终止和逆转，但延缓认知功能障碍的进程是值得奋斗的目标。此次研究中发现跑台运动是一种有效改善认知功能障碍的干预方式，其作用的实现可能是通过上调Wnt/β-catenin信号通路，调节细胞周期相关蛋白的表达，抑制神经细胞凋亡和衰老，促进神经营养因子分泌。研究正向的验证了激活Wnt/β-catenin信号通路后对糖尿病大鼠细胞周期和神经凋亡蛋白的影响，若敲除或者抑制Wnt/β-catenin信号通路，运动是否依旧对细胞周期和凋亡的进程起作用尚待后续进一步探讨。随着糖尿病患者日益增多，也必将增加患糖尿病所致认知障碍的概率，所以对糖尿病所致认知障碍的发病机制和应对方式的研究有一定社会必要性。而运动作为一种有效防治糖尿病的康复手段，将会是改善糖尿病所致的认知功能障碍、提高患者的日常生活活动能力的方式。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
糖尿病认知功能障碍：由于机体长期高血糖而引起脑内脉管系统结构和相应功能改变，主要表现为记忆力减退、注意力不集中、学习能力下降，随着疾病进行性加重，后期可表现为严重痴呆，导致患者的执行功能障碍，严重降低患者的生活质量，糖尿病中枢神经系统病变所致的认知功能障碍是糖尿病最常见的并发症之一。
Wnt/β-catenin信号通路：其激活依赖于Wnt配体，Wnt配体又可以促进Frizzled-LRP5/6复合物的形成，而Frizzled-LRP5/6复合物又可以阻断β-catenin磷酸化；Wnt配体缺失则导致破坏复合物形成，并出现相反的作用。Wnt通路组成成分的表达在衰老脑中受到影响。Wnt信号的失调可能是导致神经系统退行性改变和认知功能障碍的重要因素之一，而运动可以激活Wnt/β-catenin信号通路。

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目前由于糖尿病所致认知障碍发病的确切机制尚不清楚，临床缺乏治疗糖尿病所致认知障碍的特效药物，考虑到细胞周期和神经凋亡以及细胞衰老参与糖尿病所致认知障碍的发生与发展。运动领域的研究发现，运动干预能够改善阿尔茨海默病患者和阿尔茨海默病动物模型的认知功能，运动对糖尿病所致的认知障碍也有积极的影响。有证据表明Wnt/β-catenin信号下调与认知障碍性疾病的发病机制存在着密切联系。但是，现有文献中关于运动介导Wnt/β-catenin信号与细胞周期和神经凋亡以及细胞衰老关系的研究报道较少。

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