2.1   实验动物数量分析   实验期间，因糖尿病导致部分小鼠死亡及运动干预意外，最终各组纳入 9只样本统计。
2.2   不同方式运动对2型糖尿病小鼠肾功能的影响   干预8周后，与正常对照组相比，模型对照组血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平均显著升高(P < 0.05或P < 0.01)。与模型对照组相比，高强度间歇训练组血肌酐水平显著下降(P < 0.05)，24 h尿蛋白、尿素氮水平下降但差异无显著性意义(P > 0.05)；下坡跑组血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平均显著下降(P < 0.05或P < 0.01)。与高强度间歇训练组相比，下坡跑组血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平均显著下降(P < 0.05)，见图1。



2.3   不同方式运动对2型糖尿病小鼠肾组织微细结构的影响    干预8周后，与正常对照组相比，模型对照组小鼠肾盂扩张，肾实质变窄，肾小管数量减少、分界不清，间质大量结缔组织增生，肾小球充血扩张，部分肾小管上皮细胞空泡、坏死、萎缩脱落，肾小管间质和血管周围可见炎性细胞浸润。与模型对照组相比，高强度间歇训练组肾脏病变被改善，肾小管结构、间质和血管周围炎性病变较轻，肾小球充血较轻；下坡跑组肾脏病变被显著改善，肾小管结构、间质和血管周围炎性病变较轻，肾小球充血较轻。与高强度间歇训练组相比，下坡跑组肾盂、肾小管、肾小球等结构病变被显著改善，见图2。



2.4   不同方式运动对2型糖尿病小鼠肾间质纤维化的影响   干预8周后，与正常对照组相比，模型对照组胶原面积百分比显著升高(P < 0.01)，肾间质纤维化程度严重。与模型对照组相比，高强度间歇训练组胶原面积百分比呈降低趋势但差异无显著性意义(P > 0.05)，肾间质纤维化改善不明显；下坡跑组胶原面积百分比显著降低(P < 0.05)，肾间质纤维化被显著改善。与高强度间歇训练组相比，下坡跑组胶原面积百分比显著降低(P < 0.05)，肾间质纤维化显著改善，见图3，4。







2.5   不同方式运动对2型糖尿病小鼠肾组织中相关因子mRNA表达的影响   干预8周后，与正常对照组相比，模型对照组Klotho mRNA表达水平显著下调(P < 0.01)，转化生长因子β1、Smad3、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 mRNA表达水平显著上调(P < 0.05或P < 0.01)。与模型对照组相比，高强度间歇训练组Klotho mRNA表达水平显著上调(P < 0.05)，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 mRNA表达水平显著下调(P < 0.05)，而转化生长因子β1和Smad3 mRNA表达水平下调但差异无显著性意义(P > 0.05)；下坡跑组Klotho mRNA表达水平显著上调(P < 0.01)，转化生长因子β1、Smad3、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 mRNA表达水平显著下调(P < 0.05或P < 0.01)。与高强度间歇训练组相比，下坡跑组Klotho mRNA表达水平显著上调(P < 0.05)，转化生长因子β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 mRNA表达水平均显著下调(P < 0.05)，Smad3 mRNA表达水平下调但差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。



2.6   不同方式运动对2型糖尿病小鼠肾组织中相关因子蛋白表达的影响   干预8周后，与正常对照组相比，Klotho蛋白表达水平显著下调(P < 0.01)，转化生长因子β1、p-Smad3、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达水平均显著上调(P < 0.05或P < 0.01)。与模型对照组相比， 高强度间歇训练组Klotho蛋白表达水平上调但差异无显著性意义(P > 0.05)，转化生长因子β1、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达水平均显著下调(P < 0.05)，p-Smad3、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达水平下调但差异无显著性意义(P > 0.05)；下坡跑组Klotho蛋白的蛋白表达水平上调(P < 0.05)，转化生长因子β1、p-Smad3、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达水平均显著下调(P < 0.05或P < 0.01)。与高强度间歇训练组相比，下坡跑组Klotho蛋白表达水平显著上调(P < 0.05)，转化生长因子β1、p-Smad3、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达水平均显著下调(P < 0.05)，见图6，7。







2.7   不同方式运动对2型糖尿病小鼠肾组织中Ⅰ型胶原蛋白表达的影响   干预8周后，与正常对照组相比，模型对照组Ⅰ型胶原蛋白表达的阳性面积百分比显著升高(P < 0.01)。与模型对照组相比，高强度间歇训练组Ⅰ型胶原蛋白表达的阳性面积百分比下降但差异无显著性意义(P > 0.05)，下坡跑组Ⅰ型胶原蛋白蛋白表达的阳性面积百分比显著下降(P < 0.01)。与高强度间歇训练组相比，下坡跑组Ⅰ型胶原蛋白表达的阳性面积百分比显著下降(P < 0.05)，见图8，9。

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肾小管间质纤维化作为一种严重的微血管并发症，是导致终末期肾病和2型糖尿病肾病的主因[1]。2型糖尿病的高血糖引起血液动力学和血液流变性改变，导致肾小球高灌注、高滤过，毛细血管袢内皮细胞增生、系膜基质积累，肾小管间质纤维化加剧[2]；然而，肾小球滤过功能下降甚至丧失，引发尿蛋白、血肌酐、尿素氮等持续升高，肾功能下降[3]。Klotho作为关键衰老基因，其基因缺陷导致肾间质纤维化、2型糖尿病能量代谢紊乱、炎症反应等，进而引发慢性肾脏病[4]。2型糖尿病肾组织中Klotho蛋白表达下调，抑制其N端信号序列SP3信号结合位点与转化生长因子β1基因的5'侧翼区反应原件结合，从而激活转化生长因子β1表达，促进Smad3磷酸化、入核，调控间质细胞基质蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达、沉积，导致肾间质纤维化发生[5-6]。Klotho蛋白和转化生长因子β1/Smad3途径分别在肾间质纤维化发生、发展及2型糖尿病伴发肾间质纤维化中扮演关键调控作用[7-8]，但Klotho介导转化生长因子β1/Smad3途调控2型糖尿病肾间质纤维化的相关研究尚鲜有报道。

运动改善肾间质纤维化，且在改善2型糖尿病肾间质纤维化上也具有重要作用[9-10]，其机制与运动抑制转化生长因子β1/Smad3途径或结缔组织生长因子、基质金属蛋白酶14等关键因子表达，进而抑制基质蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达密切相关[11-13]。另有研究发现，8周耐力和抗阻运动均可显著改善肾间质纤维化，且抗阻运动效果更佳，其机制与耐力运动上调基质金属蛋白酶1、下调基质金属蛋白酶抑制剂1蛋白表达，及抗阻运动下调转化生长因子β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达密切相关[14]。高强度间歇性训练和下坡跑均可改善2型糖尿病能量代谢[15-17]，亦在改善肾间质纤维化上扮演关键角色[18-19]。并且研究发现，Klotho和转化生长因子β1/Smad3途径均可分别调控运动改善2型糖尿病肾间质纤维化，且Klotho可密切介导转化生长因子β1/Smad3途径[20-21]。但对比高强度间歇性运动和下坡跑在改善2型糖尿病肾间质纤维化作用及Klotho介导转化生长因子β1/Smad3途径调控此过程的相关研究尚鲜有报道。基于以上，此次研究利用高脂膳食和一次注射链脲佐菌素法进行2型糖尿病小鼠造模，并利用高强度间歇性运动和下坡跑分别对其进行运动干预，结束后利用苏木精-伊红染色、Masson染色、实时定量PCR、Western-blotting、免疫组织化学染色等方法，从肾组织形态结构、mRNA表达、蛋白表达等多个层面上探究不同方式运动对2型糖尿病小鼠肾间质纤维化的作用及Klotho介导转化生长因子β1/Smad3途径在此过程中的调控机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，多组间均数比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。
1.2   时间及地点   实验于2019年4-10月在扬州大学体育学院运动生理实验室完成。
1.3   材料   44只4周龄C57BL/6雄性小鼠，初始体质量(16.87±0.58) g，购自扬州大学转化医学院，生产许可证号：SCXK(苏)2017-0007。1周适应性喂养后，按照体质量均衡原则分为正常对照组(n=12)和2型糖尿病造模组(n=32)，分别进行8周普通饲料(D12450J)和高脂饲料喂养(D12492)，均购自江苏协同医药生物工程有限公司，见表1。8周喂养结束且空腹12 h，2型糖尿病造模组按110 mg/kg标准进行链脲佐菌素(Sigma)腹腔注射，正常对照组按同等标准注射柠檬酸/柠檬酸钠溶液。注射链脲佐菌素结束1周后空腹12 h，检测小鼠尾静脉血糖浓度，血糖≥16.7 mmol/L视为2型糖尿病小鼠造模成功[22]。30只小鼠造模成功，按随机数字表法分为模型对照组、高强度间歇训练组和下坡跑组(n=10)。正常对照组小鼠始终喂以普通饲料，2型糖尿病小鼠继续喂以高脂膳食，均自由饮水，昼夜比为1∶1。

实验方案经扬州大学动物实验伦理委员会批准，批准号为YZU-TYXY-0031。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

1.4   方法   
1.4.1   运动方案   高强度间歇训练组和下坡跑组进行8周(6 d/周)的高强度间歇性运动和下坡跑训练。第1周进行3 d的适应性训练后测量最大速度(Vmax)，第2周正式训练40 min/d，坡度为-10°。高强度间歇性运动：10 m/min×5 min+(21 m/min×2 min+11.3 m/min×3 min)×6+10 m/min×5 min；下坡跑：9.6 m/min×5 min+14.4 m/min×30 min+ 9.6 m/min×5 min[23]。
1.4.2   实验动物取材   小鼠处死前一天，放入特制的笼子内，尿便分离漏斗采集小鼠处死前24 h内的尿液并记录尿量，离心后取上清以备用来检测24 h 尿蛋白含量。于最后一次训练结束12-24 h内，腹腔注射1.2%三溴乙醇麻醉(0.01 mL/g)，摘除小鼠眼球取血，4 ℃静置过夜后按4 000 r/min×10 min标准进行4 ℃低温离心，取上清保存于-80 ℃冰箱中以备血肌酐和尿素氮检测；取小鼠双侧肾脏，去除软组织且PBS清洗后保存于-80 ℃超低温冰箱中以备相关指标检测。
1.4.3   肾功能生化指标检测   利用邻苯三酚红钼法检测尿蛋白含量，并按照尿蛋白×24 h尿量来计算24 h尿蛋白；利用氧化酶法来计算血肌酐浓度；利用二乙酰一肟法检测尿素氮浓度。
1.4.4   苏木精-伊红染色检测肾组织结构   取左肾，40 g/L多聚甲醛于4 ℃下固定24 h后脱水、透化、浸蜡、包埋，6 μm组织切片。石蜡切片经2次二甲苯脱蜡后，依次进行体积分数100%，100%，95%，85%，75%，50%的乙醇和双蒸水复水，各3 min。结束后，苏木精染色8 min，清洗后于0.1%的氨水中重复五六次直至颜色变暗，随后伊红染色1 min后进行乙醇梯度脱水(体积分数85%，95%，95%，100%，100%)，各2 min；二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ 5 min；最后中性树胶封固，利用光学显微镜拍照并观察肾组织微细结构变化[24]。
1.4.5   Masson染色检测肾间质纤维化   肾组织前期处理和石蜡包埋切片同苏木精-伊红染色步骤，取已切好的6 μm肾组织切片，经脱蜡、水化后按照Masson染色标准步骤进行染色[25]，结束后中性树胶封固。利用HPIAS-2000影像分析软件分析肾间质纤维化程度，以胶原面积百分比进行表示。
1.4.6   实时定量PCR检测相关因子mRNA表达   采用Trizol法提取肾组织中的RNA，并测定其浓度与纯度，利用Takara反转录试剂盒将RNA反转为cDNA。利用Takara定量试剂盒对Klotho/转化生长因子β1/Smad3途径中相关基因扩增记录Ct值进行检测，利用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量，以Primer premer软件进行引物序列设计，见表2，并由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.7   Western-blotting检测相关因子蛋白表达   取右肾60 g，组织研磨后依据BCA蛋白浓度测定法检测蛋白浓度，利用PBS将蛋白浓度调到一致，加入Loading buffer进行变性。利用雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒进行配胶，然后加入样本进行电泳、转膜、丽春红染色和一抗(Klotho、转化生长因子β1、Smad3、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和β-actin一抗，购置于CST和Sigma，稀释比例均为1∶1 000)、二抗(稀释比例为1∶4 000)孵育。结束后，利用Alpha凝胶成像系统对PVDF膜进行显影、拍照并利用FluorChemFC2软件进行数据分析。

1.4.8   免疫组织化学染色检测肾中Ⅰ型胶原蛋白表达   取于4 ℃下40 g/L多聚甲醛固定24 h后的肾组织进行乙醇梯度脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透化后依次进行浸蜡、包埋、切片和脱蜡。脱蜡后，清洗切片，用纸吸干周围水分滴加体积分数3%的H2O2室温孵育13 min；倒入柠檬酸钠修复液进行抗原修复；加脱脂奶粉37 ℃孵育40 min封闭，一抗4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育30 min。结束后，利用PBS进行清洗，DAB进行显色8 min；双蒸水清洗后，苏木精复染8 min；体积分数1%盐酸、70%乙醇分化，反蓝，脱水，透明，中性树胶封固。利用Olympus荧光倒置显微镜进行拍照并利用Image J软件对阳性区域进行定量检测[24]。
1.5   主要观察指标   ①运动干预8周后各组小鼠肾功能指标——血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白情况；②小鼠肾组织微细结构变化；③小鼠肾组织形态学变化；④小鼠肾中Klotho、转化生长因子β1、Smad3、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白和mRNA表达。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经扬州大学生物统计学专家审核。利用Excel和SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，正常对照组和模型对照组进行独立样本t检验，模型对照组、高强度间歇训练组和下坡跑组进行单因素方差分析，P < 0.05和P < 0.01分别表示差异有显著性和非常显著性意义。

3.1   2型糖尿病肾中Klotho/转化生长因子β1途径及间质纤维化变化   2型糖尿病肾间质纤维化引起的肾病是2型糖尿病最常见、最严重的微血管并发症[26]，其病因与非酶糖基化产生大量晚期糖基化终末产物、多元醇通路加速和蛋白激酶C激活密切相关[27-29]。肾间质成纤维细胞增生、过多以及细胞外基质沉积导致2型糖尿病肾间质纤维化，并伴有肾功能受损，直至终末期出现肾功能衰竭[30]。有研究发现，2型糖尿病小鼠肾功能相关指标：24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平显著升高，肾脏肾小球系膜增生、基底膜增厚、系膜基质相对面积增加[31]。此次研究中，与正常对照组相比，模型对照组血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平均显著升高，表明2型糖尿病小鼠肾功能显著受损，这与前人研究相一致。这与此次研究苏木精-伊红染色结果发现的肾盂扩张、肾实质变窄、肾小管数量减少、分界不清、间质大量结缔组织增生、肾小球充血扩张等病理变化密切相关。XU等[32]研究发现，当肾组织微细结构病变会导致肾小球滤过性和肾小管重吸收作用显著下降，血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平显著增加，肾功能受损。YI等[33]在研究2型糖尿病小鼠肾组织微细损伤发生原因时，发现肾间质纤维化发生导致肾盂、肾小球、肾小管等结构受损、病变。并且此次研究Masson染色发现胶原面积百分比显著升高，说明2型糖尿病小鼠肾间质发生严重的纤维化；分析原因可能是2型糖尿病小鼠肾组织中LncRNA SNHG7/miR-34-5p/ROCK1、microRNA-214-5p/转化生长因子β/Smad2等信号途径或Atg5、Sirt1等关键因子表达变化，从而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等基质蛋白在肾间质中大量表达、沉积[34-36]。

Klotho在肾脏远曲小管上皮细胞的高表达，增强肾脏抵抗损伤能力[37]；Klotho表达下调会激活转化生长因子β1/Smad3途径，导致肾损伤及肾功能受损[38-39]。有研究发现，2型糖尿病小鼠肾脏中Klotho表达下调后激活转化生长因子β1/Smad3途径，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白分泌并诱导成肌纤维细胞分化来促进肾间质的纤维化[40]。体外研究中，Klotho抑制肾间质成纤维细胞中高糖诱导的Ⅱ型转化生长因子β1受体表达和Smad3磷酸化及入核，进而减少Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等基质蛋白沉积[41]，这是Klotho调控2型糖尿病肾间质纤维化的关键机制。因此，阻断Klotho介导的转化生长因子β1/Smad3途径可有效改善2型糖尿病肾间质纤维化并保持肾功能。此次研究中，模型对照组小鼠肾中Klotho mRNA和蛋白表达水平显著下调，转化生长因子β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，Smad3 mRNA和p-Smad3蛋白表达上调，并且Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达阳性区域显著增大。提示2型糖尿病小鼠肾中Klotho表达下调后激活转化生长因子β1/Smad3途径，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肾间质中沉积，另外这也揭示了此次研究2型糖尿病小鼠肾间质纤维化发生的原因，可能是2型糖尿病小鼠肾组织中microRNA-34a/FGF21、NEAT1-ERK1/2、P2X7等信号途径或关键因子表达变化，进而下调Klotho并激活转化生长因子β1/Smad3途径，减少肾间质基质蛋白(Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等)沉积，改善肾间质纤维化[42-44]。
3.2   Klotho/转化生长因子β1途径在不同运动改善2型糖尿病肾间质纤维化中的作用机制   运动是改善2型糖尿病肾功能的有效手段，8周跑台训练可显著改善2型糖尿病大鼠受损的肾功能，并且运动方式不同对2型糖尿病受损肾功能产生的影响亦不同。研究发现，下坡跑和游泳运动均可显著改善2型糖尿病小鼠的受损肾功能，显著降低24 h 尿蛋白、血肌酐、尿素氮、肾脏肥大指数等指标，但下坡跑作用效果更好[45-46]。高强度间歇性运动作为改善2型糖尿病能量代谢的重要手段，在改善肾间质纤维化上也具有重要作用。但是，对比研究高强度间歇性运动与下坡跑运动改善2型糖尿病肾功能的相关研究尚未见报道。

此次实验结果显示，经过8周运动干预后，高强度间歇训练组血肌酐和24 h尿蛋白水平均呈上升趋势但差异无显著性意义，尿素氮水平下降但不显著；下坡跑组血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平均显著下降；并且与高强度间歇训练组相比，下坡跑组血肌酐、尿素氮和24 h 尿蛋白水平均显著下降。提示与高强度间歇性训练相比，8周下坡跑可显著改善2型糖尿病小鼠的受损肾功能，这可能由于高强度间歇性运动的强度较大，导致肾缺血再灌注加剧氧自由基生成，损害肾功能；而中等强度的下坡跑运动可显著改善2型糖尿病小鼠肾小球滤过功能和肾小球硬化，改善肾功能[47]。肾功能与肾组织微细结构密切相关，运动可通过改善2型糖尿病肾组织微细结构病变进而改善受损的肾功能[48]，此次研究中肾组织苏木精-伊红染色发现，高强度间歇训练组小鼠的肾小管结构、间质和血管周围炎性病变改善不明显；下坡跑组小鼠的肾脏病变被显著改善，肾小管结构、间质和血管周围炎性病变较轻，肾小球充血较轻；并且与高强度间歇训练组相比，下坡跑组肾盂、肾小管、肾小球等结构病变被显著改善。提示高强度间歇性运动因为运动强度大，其改善2型糖尿病小鼠肾组织微细结构病变的作用不显著，而下坡跑可显著改善2型糖尿病小鼠的肾组织微细结构病变，这也解释了此次研究中2个运动组在改善2型糖尿病小鼠肾功能上的差异。为了揭示两种运动在改善2型糖尿病小鼠肾组织微细结构病变上的差异原因，此次研究利用Masson染色对2型糖尿病小鼠肾间质纤维化水平进行检测，发现高强度间歇训练组胶原面积百分比降低不显著，而下坡跑组胶原面积百分比显著降低；与高强度间歇训练组相比，下坡跑组胶原面积百分比显著降低，提示下坡跑可显著改善2型糖尿病小鼠肾间质纤维化，而高强度间歇性运动效果不显著。分析其机制，高强度运动通过增强氧化应激导致胰岛素受体破坏，进而导致胰岛素耐受增强，引起肾脏结构功能的损伤，加重肾脏细胞凋亡和纤维化[49-50]。然而，中等强度的下坡跑可显著抑制白细胞介素6、环氧化酶2等关键因子和促进转化生长因子β/Smad2、PPARα介导的脂肪酸氧化等途径，从而减少肾间质中细胞外基质沉积，改善肾间质纤维化、肾组织微细结构病变和肾功能[51-52]。

Klotho作为调控肾功能及肾间质纤维化的关键蛋白，可通过抑制转化生长因子β1介导的纤维化途径改善2型糖尿病大鼠肾间质纤维化[53]。而转化生长因子β1/Smad3途径通过抑制2型糖尿病肾间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等基质蛋白沉积，改善其纤维化[54]。运动改善2型糖尿病肾间质纤维化，其机制与激活的Klotho及被抑制转化生长因子β1/Smad3途径密切相关[55-56]。在运动强度上，中低强度的有氧运动改善效果优于高强度运动[57]。高强度间歇运动是近来研究热点，但是有关对比不同方式运动改善2型糖尿病肾间质纤维化以及探究Klotho介导转化生长因子β1/Smad3途径调控该过程的相关研究鲜有报道。此次研究中，与模型对照组相比，高强度间歇训练组Klothom RNA表达上调，但其生物活性形式Klotho蛋白表达不显著，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，但是转化生长因子β1 mRNA、蛋白表达和该途径的关键基因p-Smad3、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达不显著；并且Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达阳性区域减小变化亦不显著。提示高强度间歇性训练不能上调Klotho进而抑制转化生长因子β1/Smad3途径，而Ⅲ型胶原蛋白的激活可能还存在其他信号途径调控。下坡跑组Klotho mRNA和蛋白表达水平显著上调，转化生长因子β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 mRNA和蛋白表达水平显著下调，Smad3 mRNA和p-Smad3蛋白表达水平均下调。免疫组化染色结果也发现，Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达阳性区域显著减小。并且与高强度间歇训练组相比，下坡跑组Klotho mRNA和蛋白表达水平显著上调，转化生长因子β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA和蛋白表达水平均显著下调，Smad3 mRNA表达变化不显著但p-Smad3蛋白水平显著下调，这是因为Smad3发挥作用是在其磷酸化水平上[58]。而Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达阳性区域显著减小，说明下坡跑可显著激活Klotho并抑制转化生长因子β1/Smad3途径，而高强度间歇性运动却不能，但是高强度间歇训练组Ⅲ型胶原蛋白的激活可能存在其他的信号调控途径。分析其原因，这与高强度间歇性运动的运动强度较大有关，而中等强度运动可显著改善2型糖尿病小鼠肾中miR-21a-5p启动子或IRF-1表达，从而激活C/EBP-β并直接结合于Klotho启动子区(-1 039至-1 029)上调其转录、翻译[59]；相较于高强度间歇性运动，下坡跑可显著激活Lnc RNA-SNHG29并结合miR-200b-3p使其表达下调，促进β-GP与Klotho结合并活化[60]；并且在抑制2型糖尿病小鼠肾组织炎症反应上，中等强度间歇性运动的作用效果显著优于高强度间歇性运动[61]。2型糖尿病小鼠肾中白细胞介素6、白细胞介素37表达下调后可调节Klotho表达上调[62]，再者还与运动改善2型糖尿病小鼠的表观遗传有关[63]。当Klotho表达上调后抑制转化生长因子β1/Smad3途径及靶基因Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达，减少基质蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肾间质的沉积，降低其纤维化程度，进而改善肾组织微细结构病变和受损肾功能。
3.3   结论   此次实验结果提示，2型糖尿病小鼠肾间质发生纤维化；高强度间歇性训练和下坡跑均能通过上调Klotho并抑制转化生长因子β1/Smad3途径进而改善2型糖尿病小鼠肾间质纤维化，且下坡跑作用更明显。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
肾间质纤维化：肾小管间质纤维化作为一种严重的微血管并发症，是导致终末期肾病和2型糖尿病肾病的主因。2型糖尿病的高血糖引起血液动力学和血液流变性改变，导致肾小球高灌注、高滤过，毛细血管袢内皮细胞增生、系膜基质积累，肾小管间质纤维化加剧。

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肾小管间质纤维化作为一种严重的微血管并发症，是导致终末期肾病和2型糖尿病肾病的主因。2型糖尿病的高血糖引起血液动力学和血液流变性改变，导致肾小球高灌注、高滤过，毛细血管袢内皮细胞增生、系膜基质积累，肾小管间质纤维化加剧；然而，肾小球滤过功能下降、甚至丧失，引发尿蛋白、血肌酐、尿素氮等持续升高，肾功能下降。Klotho作为关键衰老基因，其基因缺陷导致肾间质纤维化、2型糖尿病能量代谢紊乱、炎症反应等，进而引发慢性肾脏病。

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