2.1   乳腺肿瘤细胞MCF-7成球能力   为了研究PGC-1β与乳腺肿瘤干细胞形成及干性蛋白表达的相关性，观察了乳腺肿瘤MCF-7贴壁细胞与成球细胞的形态变化并检测了干性相关蛋白的表达。图1A显示，显微镜下观察MCF-7细胞经过复苏培养后的贴壁细胞形态，可见细胞排列紧密，呈多边形上皮样，生长良好的MCF-7细胞经干性培养基培养后可见折光度好、中间密度高的致密乳腺癌干细胞球体。图1B显示，Western blot检测乳腺癌MCF-7细胞与乳腺癌干细胞中干性相关蛋白ABCG2、ALDH1和OCT4 的表达，结果显示，与贴壁细胞相比，成球的乳腺癌干细胞中ABCG2、ALDH1、OCT4干性蛋白的表达有明显差异性(P < 0.05)。



2.2   PGC-1β慢病毒载体转染MCF-7细胞鉴定结果   为了验证PGC-1β对乳腺癌干细胞干性的影响及其机制，将慢病毒载体转入乳腺癌MCF-7细胞中，荧光显微镜下观察转染PGC-1β后的MCF-7细胞，见图2，细胞荧光显示转染效率均在60%以上。经过qRT-PCR验证，过表达组PGC-1β基因的表达明显高于未转染组和空载体组，而干扰组PGC-1β基因的表达则明显低于未转染组和空载体组，见图3A；经Western blot验证，过表达组PGC-1β蛋白的表达明显高于未转染组和空载体组，而干扰组PGC-1β的表达明显低于未转染组和空载体组，见图3B，C；表明慢病毒转染成功并在MCF-7细胞中稳定表达(P < 0.05)。







2.3   PGC-1β对维持乳腺癌干细胞干性的影响    成球实验在48 h后逐步可见细胞分裂，随后细胞球直径逐渐增大，成球细胞数目逐渐增多，至第9天可见折光度好、中间密度高的致密乳腺癌干细胞球体，发现PGC-1β过表达组细胞与未转染组和空载体组相比形成致密球体所需要的时间短，而干扰组形成球体的时间长，见图4A。第9天时各组球体形成的数目和直径，见图4B，C；与未转染组和空载体组相比，PGC-1β过表达后球体数目增多和直径增大；PGC-1β干扰后成球细胞数减少及球体直径减小。



2.4   PGC-1β对乳腺癌干细胞干性相关蛋白表达的影响   为了进一步阐明PGC-1β对乳腺癌干细胞干性的影响，通过Western blot 检测乳腺癌干细胞干性相关蛋白ABCG2、ALDH1、OCT4的表达，结果显示：与未转染组和空载体组通过相比，PGC-1β过表达组干性相关蛋白ABCG2、ALDH1、OCT4表达升高   (P < 0.05)，见图5A；相反，PGC-1β干扰组干性相关蛋白表达降低(P < 0.05)，见图5B。



2.5   PGC-1β对上皮-间充质转化相关蛋白表达的影响   为了进一步阐明PGC-1β对乳腺癌干细胞干性的影响机制，通过Western blot检测PGC-1β转染后乳腺癌干细胞上皮-间充质转化相关蛋白的表达。结果显示：与未转染组和空载体组相比，PGC-1β过表达组上皮标志物E-Cadherin表达降低，间质标志物N-Cadherin、Vimentin、Slug和 ZEB1表达升高(P < 0.05)，见图6A；而PGC-1β干扰组上皮-间充质转化相关蛋白的表达与过表达组结果相反(P < 0.05)，见图6B。



2.6   PGC-1β通过激活PI3K/AKT/mTOR通路调控乳腺癌干细胞干性表达   根据上述实验结果，PGC-1β能够通过影响上皮-间充质转化转换而影响乳腺癌干细胞的干性。进一步通过Western blot检测了PGC-1β转染后乳腺癌干细胞PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白的表达，结果显示，与未转染组和空载体组相比，PGC-1β过表达组PI3K、AKT、mTOR及相对应的磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达显著升高，见图7A。PGC-1β干扰组上述蛋白表达降低，见图7B。结果提示PGC-1β通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进乳腺癌干细胞的干性表达。

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乳腺癌是威胁女性健康的头号杀手，全世界大约有230万妇女被诊断出患有乳腺癌[1]，复发和转移是女性晚期乳腺癌死亡率升高的主要原因。晚期乳腺癌目前虽难以治愈，但可通过研发新药、探究新治疗方法来缓解患者的临床症状，改善患者的生活质量，进一步延长患者的生存时间[2]。

乳腺癌干细胞是一小部分存在于乳腺癌组织内部并且表达干细胞标记物的乳腺癌细胞，具有自我更新和分化的潜能及演变成恶性乳腺癌的高能力[3]。乳腺癌干细胞在乳腺癌的发生发展中起着关键作用，与肿瘤异质性、复发、耐药和治疗相关[4-5]。高比例的乳腺癌干细胞对化疗和放疗耐药，导致治疗失败和疾病复发[6]。因此，对乳腺癌干细胞干性相关分子机制的研究有助于发现乳腺癌治疗的新方向。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1beta，PGC-1β)是线粒体生物发生、氧化代谢以及抗氧防御的主要调控者，是能量代谢的正向调控者[7-8]。研究发现其与多种生物学过程相关并且参与了多种疾病的发生，诸如肝脂肪变性、糖尿病和心肌病等[9-13]。课题组前期研究中提出PGC-1β通过调节mTOR信号通路在乳腺癌细胞生长中起关键作用的假设，通过敲低PGC-1β的表达，检测mTOR相关基因在乳腺癌细胞中的表达，与其假设一致，AMP活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化、Thr1135、Raptor和S6蛋白上Rictor的磷酸化受到抑制，PGC-1β诱导乳腺癌细胞发生了凋亡[14]。此外，前期的研究还探讨了PGC-1β和FOXA2在乳腺癌发生发展中的分子机制，研究表明，干扰的PGC-1β转染MCF-7细胞后，PGC-1β、p-PI3K、p-AKT、PDK1、mTOR和Raptor的表达均下调，而FOXA2的表达增加，当干扰的PGC-1β和过表达的FOXA2共转染时，p-PI3K、p-AKT、PDK1、p-mTOR、p-S6K1和Raptor的表达均显著降低，证实了PGC-1β联合FOXA2可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控乳腺癌细胞增殖、迁移及诱导细胞凋亡[15]。该研究首先分别构建了PGC-1β过表达和干扰的慢病毒载体，进一步转入MCF-7细胞后验证其对乳腺癌干细胞干性的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   肿瘤细胞生物学实验；不同组间比较采用非参数T检验进行评估； 多组比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2021年3-11月在宁夏医科大学总医院生物芯片中心完成。
1.3   材料   MCF-7细胞购自中科院上海细胞库；DMEM/F12培养基、青链霉素混合液、胎牛血清、B27购自GIBCO公司；慢病毒载体、HitransG P感染增强液均购自上海吉凯基因有限公司；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子购自Pepro Tech公司；胰岛素购自Sigma-Aldrich公司；反转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自Takara公司；引物由上海生工合成，引物序列见表1；BCA全蛋白提取试剂盒购自Thermo公司；抗体信息见表2。

1.4   实验方法   
1.4.1   PGC-1β慢病毒载体转染MCF-7细胞   取96孔板摸索MCF-7细胞感染复数值，取24孔板按1×105/孔的细胞数进行铺板，置于恒温培养箱中，待第2天细胞密度达到30%-50%时，根据得到的MCF-7细胞感染复数值计算所需病毒量。将含基础培养基(DMEM培养基)、慢病毒原液和相应体积的HitransG P感染增强液的混合液混匀后加入孔中。继续培养24 h后更换为完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素混悬液的DMEM培养基)。感染约72 h后，荧光表达丰度较高，在普通显微镜和荧光显微镜下观察并拍照，评估慢病毒转染效率。 
1.4.2   qRT-PCR验证PGC-1β慢病毒转染效果   转染病毒72 h后用Trizol试剂提取总的mRNA，用Nanodrop分光光度计测定吸光度值。按照Takara反转录试剂盒说明书合成cDNA，反应条件为：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃ ∞。合成cDNA后，配制荧光定量反应液体系，依次为每孔TB Green 10 μL、PCR Forward/Reverse各0.8 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.4 μL，内参为GAPDH；随后经预变性，95 ℃ 30 s；PCR反应，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共经历40次循环，在LightCyder480仪器(Roche Diagnostics 公司，LightCyder®480SW1.5.1.62)上机操作。
1.4.3   Mammosphere实验培养乳腺癌干细胞   PGC-1β转染MCF-7细胞3 d后，收集细胞传至第2代，依次标记为未转染组、空载体组、PGC-1β过表达组、PGC-1β干扰组进行Mammosphere实验。为了获得乳腺癌干细胞，在DMEM/F12培养基中分别加入B27 (1∶50)、青链霉素混合液(1∶50)、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子以及5 μg/L胰岛素配制干性培养基；将上述4组细胞分别接种到超低黏附的6孔板中，1 000个细胞/孔，并在每孔中加入2 mL配制好的干性培养基，以后每隔3 d换液1次，每孔添加1 mL上述配制好的干性培养基，在低氧(体积分数为94%N2，5%CO2，1%O2)条件下培养9 d，显微镜下观察乳腺癌干细胞球的形成过程，计数球体数，测量球体直径并拍照。培养结束后收集细胞进行后续实验。
1.4.4   Western blot验证干性及mTOR相关蛋白表达   在低氧条件下培养9 d，收集细胞，选择BCA全蛋白提取试剂盒(KeyGen BioTECH)，根据说明书要求配制一定体积的裂解液，根据细胞沉淀量加入裂解液在冰上裂解各组细胞沉淀，经离心得到上清中的蛋白，按4∶1的比例加入5×loading buffer，100 ℃煮沸后使用。经过电泳、转膜后，用1×TBST溶液配制5%脱脂奶粉稀释液封闭1 h，再用一抗孵育，见表2，GAPDH作为内参，4 ℃冰箱过夜后用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液配制二抗，孵育1 h，最后通过化学发光成像仪(ChemiDoc MP，Image Lab)上机检测并分析。
1.5   主要观察指标   PGC-1β过表达与干扰后乳腺癌MCF-7细胞的成球能力及干性蛋白的表达，PGC-1β过表达与干扰后上皮-间充质转化相关蛋白、PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。
1.6   统计学分析   采用Graphpad 8统计学软件和SPSS 18.0进行分析，计量资料采用x±s表示，两组数据采用非参数T检验对比，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过宁夏医科大学统计学专家审核。

乳腺肿瘤是女性发病率最高的一种疾病，最新数据显示其发病率占24.5%，死亡率居女性死亡率之首，占总死亡率的15.5%[1]。近几十年的临床诊疗及研究中，乳腺癌的主要治疗手段是以手术为主，辅以化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗的综合治疗方法，并取得了良好的疗效。然而，乳腺癌的治疗仍面临着巨大的挑战，进展转移及耐药严重影响患者的治疗效果及预后[16-17]。

在肿瘤中有少数肿瘤干细胞群体，它们促进了肿瘤的生长[18]。肿瘤干细胞具有自我更新、无限增殖和分化潜能，乳腺癌干细胞则是导致恶性乳腺肿瘤复发、转移、耐药的罪魁祸首，但对其机制仍然知之甚少[4-19]。故寻找促使乳腺癌细胞复发和转移的因素及其作用机制显得尤为重要。

DENG等[20]研究通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路逆转上皮-间质转化和减少肿瘤干细胞标志物的表达来减轻卵巢癌的化疗耐药性，证明了PI3K/Akt/mTOR通路的激活参与了干性基因和蛋白的表达。在乳腺癌的研究中，BAHENA-OCAMPO等[21]在MCF-7细胞中通过稳定过表达miR-10b，证明了其能够促进乳腺癌干细胞干性和上皮-间充质转化标记物的表达，并且通过分析发现了几个潜在的miR-10b mRNA靶点，包括磷酸酶和紧张素同源物(phosphatase and tensin homologue，PTEN)、PI3K/AKT通路的关键调控因子，参与转移、细胞存活和自我更新，最终证明了miR-10b通过抑制PTEN和维持AKT通路激活，调控乳腺肿瘤干细胞表型的自我更新。作者通过实验发现，乳腺肿瘤干细胞干性蛋白的表达要显著高于其癌细胞，接着从影响乳腺癌干细胞干性入手，进一步研究能够调控乳腺肿瘤干细胞的因子并寻找其分子机制。

在肿瘤形成和转移过程中，代谢适应在促进肿瘤生长方面起着关键作用。然而，关于促进癌症进展的代谢变化尚不清楚[22-23]。肿瘤干细胞经研究也有着活跃的代谢程序[24]。在此过程中，PGC-1基因扮演重要作用。PGC-1广泛参与机体的体内代谢，其家族包括3个主要成员：PGC-1α，PGC-1β和PRC(PGC-1相关因子)[25]。PGC-1 起初发现于小鼠的棕色脂肪组织中，经研究证明它是细胞能量代谢的主要调控者[26-27]。PGC-1α可通过调节线粒体生物合成和能量代谢使ATP生成增加，研究表明，PGC-1α可促进肿瘤血管生成从而增加了肿瘤的侵袭性，使其更易增殖、转移，恶性程度增加[28]。而有关 PGC-1β的研究较少，PGC-1β与PGC-1α具有类似的生物学功能，参与了改善心律失常、调节脂质合成运输等[7]。研究表明，PGC-1β在线粒体生成中发挥重要作用，且对脂肪形成、运动肌肉损伤修复及调控血管增殖等方面有影响，近些年也有研究表明，PGC-1β影响着诸如乳腺癌[29]、肝癌及胶质瘤等肿瘤细胞的生长增殖[30-31]。但其在肿瘤干细胞中的调控作用机制研究较少，有待于进一步探索。

前期的研究初步明确PGC-1β具有促进MCF-7细胞生长、增殖及迁移的作用[14-15]。但是 PGC-1β对乳腺癌干细胞的影响及其机制还不清楚。课题组前期研究发现PGC-1β在乳腺癌细胞系中高表达，且其表达与乳腺癌增殖、转移密切相关[15]，该研究通过转染PGC-1β过表达的慢病毒载体，发现其能够明显促进乳腺癌干细胞球的形成，表现为形成致密球体所需要的时间缩短、球体数目增多、球体直径增大以及干性蛋白的表达明显上调；而PGC-1β干扰后的结果则相反，说明PGC-1β能够促进乳腺癌干细胞的形成。

上皮-间充质转化过程可以诱导正常和肿瘤上皮干细胞的形成，是多种肿瘤侵袭的标志[32]。上皮-间充质转化相关蛋白包括维持上皮细胞极性和黏附性的 E-cadherin，维持细胞间质特征的N-cadherin和Vimentin，参与转录调控基因Slug、Snail、ZEB1和Twist可以与E-Cadherin和N-cadherin的DNA序列结合，调节上皮和间质细胞的转录，从而促进细胞的上皮-间充质转化。上皮-间充质转化和乳腺肿瘤干细胞数量的升高被认为是乳腺癌转移、化疗耐药和肿瘤复发的基础[33]。有文献报道在乳腺癌的发展过程中，上皮-间充质转化促进癌细胞自我更新，进而加速乳腺癌干细胞的生成[34-35]。

该研究探讨了PGC-1β对乳腺癌干细胞上皮-间充质转化的影响。Western blot 检测PGC-1β诱导对上皮-间充质转化相关蛋白的影响，结果发现PGC-1β过表达组E-Cadherin下调，而N-Cadherin、Vimentin、Slug和ZEB1显著上调，而干扰组则相反。

该实验将PGC-1β转染MCF-7细胞，并确定其调控乳腺癌干细胞干性和上皮-间充质转化相关蛋白的表达。PGC-1β的表达诱导了干细胞标记物ABCG2、ALDH1和OCT4蛋白水平的表达，这些干性因子与形成肿瘤克隆球体的能力有关。另一方面，PGC-1β增加了N-cadherin、Vimentin、Slug和ZEB1的蛋白水平，该研究首次展示了PGC-1β在乳腺癌干细胞和上皮-间充质转化诱导方面的有效作用，结果证实了PGC-1β通过调控乳腺肿瘤细胞的上皮-间充质转化从而影响了乳腺肿瘤干细胞的干性。

PI3K/AKT/mTOR信号通路几乎在所有的恶性肿瘤中都出现异常表达，在乳腺癌细胞中也不例外，是最普遍的促进乳腺癌细胞增殖、生存、死亡的信号通路之一[36]，在过去已经研究了大量靶向这个关键途径的抑制剂，为乳腺癌治疗提供了更有效的临床方案。高达70%的乳腺癌都表现出了该通路的激活[36-37]。PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常激活与乳腺癌细胞上皮-间充质转化、转移、干细胞干性的维持和耐药等多个生物学过程密切相关[38]。

研究发现，通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路轴，PTEN通过调节转录、翻译、细胞周期进程、诱导细胞死亡、刺激血管生成和干细胞自我更新而发挥肿瘤抑制作用，从另一方面证明了激活PI3K/AKT/mTOR信号轴促进了肿瘤干细胞的自我更新[39]。JUNG等[40]研究发现PI3K/AKT/mTOR通路的激活增加了趋化因子受体4型(CXCR4)的表达，进而通过STAT通路维持了肿瘤细胞的干性。而RAS/MAPK通路、NOTCH1信号的激活以及PI3K/AKT/mTOR轴的激活均能够促进上皮-间充质转化过程而维持乳腺癌细胞的干性功能并促进肿瘤干细胞的自我更新[41]。

该研究通过Western blot在蛋白水平上检测 PI3K/AkT/mTOR 信号通路上蛋白的表达，验证 PGC-1β诱导后对PI3K/ AKT/mTOR信号通路的影响，结果显示，PGC-1β过表达诱导乳腺癌干细胞后PI3K/AKT/mTOR 相关蛋白及与其相关的磷酸化蛋白表达均显著升高，而干扰后显著下调，结果表明PGC-1β诱导乳腺癌干细胞后可激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。

该研究成功地从MCF-7细胞中分离和鉴定了乳腺癌干细胞。在MCF-7细胞中过表达PGC-1β后，促进上皮-间充质转化进程，并提高了干细胞的形成能力和干细胞标记物的表达。更重要的是，实验证明了PGC-1β可以激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。综上所述，该研究阐明了PGC-1β在维持乳腺癌干细胞干性方面的关键作用。过表达PGC-1β通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路而促进了乳腺癌干细胞上皮-间充质转化，从而维持干细胞的干性并促进了乳腺癌干细胞的增殖。此研究为乳腺癌今后靶向治疗奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β(PGC-1β)：过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1家族的3个主要成员(PGC-1α，PGC-1β和 PRC)在能量代谢调节、维持葡萄糖稳态和脂质代谢中发挥着关键作用，PGC-1β作为其成员的重要组成部分，是线粒体氧化能量代谢和抗氧化防御的主要调控因子。过去几年的研究表明，PGC-1β表达与癌症的进展有关，其在癌症中的表达与正常组织存在显著差异性。
上皮-间充质转化：是一种在胚胎发育、炎症、组织重建和伤口愈合过程中通过特定程序转化为具有间质表型的潜在细胞-生物学过程。上皮-间充质转化相关蛋白有E-cadherin、N-cadherin、Slug、Vimentin、ZEB1等。研究表明，上皮-间充质转化过程的激活与正常干细胞和肿瘤干细胞的形成密切相关，并且上皮-间充质转化作为肿瘤转移的关键机制，在癌细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用。
PI3K/AKT/mTOR信号通路：是驱动乳腺癌细胞生长、存活的最常见途径之一，几乎在所有的恶性肿瘤中都表现出异常表达，是一条对营养物质、激素和生长因子有反应的复杂的细胞内信号通路。对肿瘤干细胞维持和干性基因蛋白表达的调控作用，尚无明确研究结论。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

近年来，有关乳腺癌干细胞引起肿瘤耐药以及肿瘤复发已经成为研究的热点，因此，认识与乳腺癌干细胞干性有关的分子机制可以有效地发现新的治疗策略来克服乳腺癌的复发及耐药。通过探索新的表面标记物以及以信号通路为靶点而寻找治疗乳腺癌的方法也将成为未来的趋势。基于PGC-1β在能量代谢调节、维持葡萄糖稳态和脂质代谢中所发挥关键作用，越来越多的研究表明其促进了乳腺癌细胞的生长增殖，而PGC-1β能否通过维持乳腺癌干细胞的干性而促进了肿瘤的发生还尚未研究过，该研究首先探究了PGC-1β能否影响乳腺癌干细胞的干性，然后进一步研究了PGC-1β影响乳腺癌干细胞干性的机制，以PGC-1β为靶点寻找防止乳腺癌干细胞引起肿瘤耐药以及肿瘤复发的机制，将成为乳腺癌治疗新的突破口。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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