补肾健脾活血方含药血清干预过表达、沉默Beclin-1基因的MC-3T3-E1细胞增殖及碱性磷酸酶活性

doi:10.12307/2021.164

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (29): 4650-4655.doi: 10.12307/2021.164

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

补肾健脾活血方含药血清干预过表达、沉默Beclin-1基因的MC-3T3-E1细胞增殖及碱性磷酸酶活性

郑维蓬1，胡伟坚2，赵国源2，魏合伟1，刘治军1，万雷1，陈胜1，廖志浩1

1广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510375；2广州中医药大学，广东省广州市 510006

收稿日期:2020-10-15 修回日期:2020-10-17 接受日期:2020-11-26 出版日期:2021-10-18 发布日期:2021-06-02
通讯作者: 魏合伟，博士，主任医师，广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510375
作者简介:郑维蓬，男，1986年生，2014年广州中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨关节运动损伤疾病相关研究。
基金资助:
广东省中医药局科研项目(20191178)，项目负责人：郑维蓬；广东省中医药局科研项目(20203011)，项目负责人：魏合伟

Effects of Bushen Jianpi Huoxue Recipe on cell proliferation and alkaline phosphatase activity in Beclin-1 overexpressing and silencing MC-3T3-E1 cells

Zheng Weipeng1, Hu Weijian2, Zhao Guoyuan2, Wei Hewei1, Liu Zhijun1, Wan Lei1, Chen Sheng1, Liao Zhihao1

1The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510375, Guangdong Province, China; 2Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2020-10-15 Revised:2020-10-17 Accepted:2020-11-26 Online:2021-10-18 Published:2021-06-02
Contact: Wei Hewei, MD, Chief physician, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510375, Guangdong Province, China
About author:Zheng Weipeng, Master, Attending physician, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510375, Guangdong Province, China
Supported by:
the Scientific Research Projects of Guangdong Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 20191178 (to ZWP) and 20203011 (to WHW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨质疏松症：是以骨量减少、骨组织显微结构改变和骨折危险频度增加为特征的一种全身性骨骼系统疾病，是中老年人的常见病和多发病之一。骨质疏松的具体发病机制并不完全清楚，但实为骨形成和骨吸收失衡导致。骨代谢动态平衡的维持由成骨细胞与破骨细胞精细调节，两种细胞功能异常在骨质疏松症发病中极其重要。
Beclin-1基因：是细胞自噬关键的正调控因子，也称BECN1基因，是酵母ATG6的同系物。Beclin-1蛋白CCD区能与Vps34稳定结合，形成Beclin-1-Vps34复合体，诱导自噬体双层膜结构形成，促进自噬。研究发现，自噬基因Beclin-1敲除导致成骨细胞分化和矿化能力下降，提示Beclin-1在骨代谢中也具有重要作用。

背景：成骨细胞是参与骨代谢动态平衡精细调节的重要细胞之一，其功能异常在骨质疏松症发病中极其重要。研究发现自噬基因Beclin-1敲除导致成骨细胞分化和矿化能力下降，提示Beclin-1在骨代谢中具有重要调控作用。
目的：补肾健脾活血方含药血清对过表达、沉默Beclin-1基因的MC-3T3-E1细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响。
方法：构建Beclin-1过表达及沉默重组慢病毒载体，制备补肾健脾活血方含药血清。将MC-3T3-E1成骨细胞分成6组，分别为空白血清+空病毒组、空白血清+Beclin-1过表达组、空白血清+Beclin-1沉默组、含药血清+空病毒组、含药血清+Beclin-1过表达组、含药血清+Beclin-1沉默组；根据组别不同进行干预，CCK-8法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期，碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。
结果与结论：①与空白血清+空病毒组比较，含药血清+空病毒组、空白血清+Beclin-1过表达组及含药血清+Beclin-1过表达组的细胞增殖能力和碱性磷酸酶活性均显著增强，空白血清+Beclin-1沉默组、含药血清+ Beclin-1沉默组的细胞增殖能力和碱性磷酸酶活性均降低，其中含药血清+Beclin-1过表达组、空白血清+Beclin-1沉默组的变化最明显；②空白血清+Beclin-1过表达组和含药血清+Beclin-1过表达组处于G2/M期的细胞比例较高；空白血清+空病毒组、空白血清+Beclin-1沉默组和含药血清+ Beclin-1沉默组处于G0/G1期的细胞比例较高；空白血清+ Beclin-1过表达组和含药血清+空病毒组处于S期的细胞比例较高；③结果表明，过表达Beclin-1、补肾健脾活血方含药血清可提高MC-3T3-E1细胞增殖能力及碱性磷酸酶活性，尤其二者同时干预时作用最强，而沉默Beclin-1则降低MC-3T3-E1细胞增殖能力及碱性磷酸酶活性，补肾健脾方含药血清在某种程度上可抑制Beclin-1沉默的不良影响。

https://orcid.org/0000-0001-7257-4482 (郑维蓬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: MC-3T3-E1细胞, 慢病毒, 转染, Beclin-1, 自噬, 中药, 碱性磷酸酶

Abstract: BACKGROUND: Osteoblasts are one of the important cells involved in the fine regulation of the dynamic balance of bone metabolism, and their dysfunction is extremely essential for the pathogenesis of osteoporosis. Studies have found that knockout of Beclin-1, an autophagy gene, leads to a decrease in osteoblast differentiation and mineralization, suggesting that Beclin-1 has an important regulatory role in bone metabolism.
OBJECTIVE: To explore the effects of Bushen Jianpi Huoxue Recipe on cell proliferation and alkaline phosphatase activity in Beclin-1 overexpressing and silencing MC-3T3-E1 cells
METHODS: Recombinant lentiviral vectors overexpression and silencing Beclin-1 were constructed, and drug-containing serum of Bushen Jianpi Huoxue Recipe was prepared. MC-3T3-E1 cells were divided into six groups: blank serum + blank virus group, blank serum + Beclin-1 overexpression group, blank serum + Beclin-1 silence group, drug serum + blank virus group, drug serum + Beclin-1 overexpression group, AND drug serum + Beclin-1 silence group. Interventions in each group were accordingly carried out. Cell proliferation was detected using cell counting kit-8, cell cycle was determined using flow cytometry, and alkaline phosphatase activity was measured using an alkaline phosphatase kit.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank serum + blank virus group, the cell proliferation and alkaline phosphatase activity were significantly increased in the drug serum + blank virus group, blank serum + Beclin-1 overexpression group, and drug serum + Beclin-1 overexpression group, and significantly decreased in the blank serum + Beclin-1 silence group and drug serum + Beclin-1 silence group. The most obvious changes were found in the drug serum + Beclin-1 overexpression group and blank serum + Beclin-1 silence group. From the perspective of cell cycle in each group, the proportion of cells in G2/M phase was relatively higher in the blank serum + Beclin-1 overexpression group and drug serum + Beclin-1 overexpression group; the proportion of cells in G0/G1 phase was relatively higher in the blank serum + blank virus group, blank serum + Beclin-1 silence group and drug serum + Beclin-1 silence group; the proportion of cells in S phase was relatively higher in the blank serum + Beclin-1 overexpression group and drug serum + blank virus group. To conclude, overexpression of Beclin-1 and serum containing Bushen Jianpi Huoxue Recipe, especially their combination, can improve the proliferation and alkaline phosphatase activity of MC-3T3-E1 cells. Whereas, silence of Beclin-1 can reduce the proliferation and alkaline phosphatase activity of MC-3T3-E1 cells, and serum containing Bushen Jianpi Huoxue Recipe can inhibit the adverse effects of Beclin-1 silence to some extent.

Key words: MC-3T3-E1 cells, lentivirus, transfection, Beclin-1, autophagy, traditional Chinese medicine, alkaline phosphatase

中图分类号:

郑维蓬, 胡伟坚, 赵国源, 魏合伟, 刘治军, 万雷, 陈胜, 廖志浩. 补肾健脾活血方含药血清干预过表达、沉默Beclin-1基因的MC-3T3-E1细胞增殖及碱性磷酸酶活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4650-4655.

Zheng Weipeng, Hu Weijian, Zhao Guoyuan, Wei Hewei, Liu Zhijun, Wan Lei, Chen Sheng, Liao Zhihao. Effects of Bushen Jianpi Huoxue Recipe on cell proliferation and alkaline phosphatase activity in Beclin-1 overexpressing and silencing MC-3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(29): 4650-4655.

图/表（结果） 6

参考文献

[1] 张智海,张智若,刘忠厚,等.中国大陆地区以-2.0SD 为诊断标准的骨质疏松症发病率回顾性研究[J].中国骨质疏松杂志,2016, 22(1):1-8.
[2] 夏维波,章振林,林华,等.原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(3):281-309.
[3] 贾英民,李瑞玉,武密山,等.补肾方药有效成分不同比例配伍对成骨细胞增殖和分化的影响[J].中国组织工程研究,2015,19(24): 3773-3777.
[4] NOLLET M, SANTUCCI-DARMANIN S, BREUIL V, et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 2014;10(11):1965-1977.
[5] 乔荣勤,魏合伟,刘庆思.骨康口服液治疗骨质疏松症疗效观察[J].新中医,2011,43(12):61-72.
[6] 万雷,黄宏兴,蔡桦,等.补肾健脾活血方对老年女性骨质疏松患者疼痛和血清β-CTx、N-MID、T-PINP的影响[J].辽宁中医杂志, 2015,42(9):1690-1692.
[7] 万雷,黄宏兴,黄红,等.补肾健脾活血方含药血清提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性[J].中国组织工程研究, 2018,22(16):2461-2466.
[8] 董冰子,孙晓方.骨质疏松症治疗新进展:从分子机制到药物靶点[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2018,11(6):620-627.
[9] 王凯,宋敏,文皓楠,等.从OPG/RANK/RANKL信号转导系统探讨老年性骨质疏松的发病机制[J].中国骨质疏松杂志,2020,26(6): 910-914.
[10] QIN L, YANG Z, ZHANG W, et al. Metabolic syndrome and osteoporotic fracture: a population-based study in China. BMC Endocr Disord. 2016; 16(1):27.
[11] 韩林静,吴克亮,王宏波, 等.基于网络药理学探讨黄芪治疗骨质疏松症的分子机制[J].中国骨质疏松杂志,2020,26(8):1119-1125.
[12] 李琦,杨鸫祥,于冬冬,等.改良五禽戏处方对肝肾亏虚型绝经后骨质疏松症疗效观察[J].辽宁中医药大学学报,2020,22(3):154-157.
[13] 赵继荣,马同,邓强, 等.基于“脾主肌肉”理论探讨脾-肌肉-骨骼-骨质疏松性骨折间相关性[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(1): 127-131.
[14] 曾国勇,万雷,王凡,等.黄宏兴教授辨治骨质疏松症经验介绍[J].四川中医,2016,34(6):10-12.
[15] 乔荣勤.刘庆思教授从多虚多瘀论治骨质疏松症学术思想简介[J].新中医,2011,43(6):160-161.
[16] 曲崇正,刘庆思.刘庆思教授防治原发性骨质疏松症经验概述[J].中医临床研究,2015,7(27):3-5.
[17] 柴生颋,谢平金,方鸿星,等.补肾中药补肾健脾活血方治疗肾阳虚型绝经后骨质疏松症疗效及对E2、OPG及IGF-1影响[J].辽宁中医药大学学报,2018,20(7):170-173.
[18] 魏合伟,李钊,庄洪,等.中药骨康含药血清对TNF-α致大鼠成骨细胞凋亡的影响[J].中医正骨,2005,17(3):6-8.
[19] 林一峰,魏合伟,黄宏兴,等.骨康含药血清对新生大鼠成骨细胞增殖影响的研究[J].中医药学刊,2003,21(7):1116-1117.
[20] 曹亚飞,黄宏兴,刘红敏,等.中药骨康对破骨细胞活性及凋亡的影响[J].中医正骨,2004,16(6):3-5.
[21] 魏合伟,李钊,张志海,等.骨康含药血清对新生大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响[J].中医药学刊,2005,23(1):77-78.
[22] 魏合伟,林一峰,曲崇正,等.中药骨康含药血清对骨质疏松性骨折愈合过程中血小板衍生生长因子表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(37):7290-7293.
[23] 柴生颋,万雷,魏合伟,等.补肾中药对绝经后骨质疏松症患者骨密度和细胞因子OPG及RANKL影响的研究[J].新中医,2009,41(8): 57-58.
[24] 柴爽,黄佳纯,王吉利,等.补肾健脾活血方对大鼠绝经后骨质疏松症的防治作用[J].中成药,2019,41(9):2213-2216.
[25] HOCKING LJ, WHITEHOUSE C, HELFRICH MH. Autophagy: a new player in skeletal maintenance? J Bone Miner Res. 2012;27(7):1439-1447.
[26] NUSCHKE A, RODRIGUES M, STOLZ DB, et al. Human mesenchymal stem cells/multipotent stromal cells consume accumulated autophagosomes early in differentiation. Stem Cell Res Ther. 2014;5(6):140.
[27] CHANG KH, SENGUPTA A, NAYAK RC, et al. p62 is required for stem cell/progenitor retention through inhibition of IKK/NF-κB/Ccl4 signaling at the bone marrow macrophage-osteoblast niche. Cell Rep. 2014;9(6):2084-2097.
[28] WHITEHOUSE CA, WATERS S, MARCHBANK K, et al. Neighbor of Brca1 gene (Nbr1) functions as a negative regulator of postnatal osteoblastic bone formation and p38 MAPK activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010; 107(29):12913-12918.
[29] 孔莹,高伟,林春盛,等.针刺百会穴对阿尔茨海默病模型大鼠自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的影响[J].中医药导报,2020,26(5): 31-34.
[30] 彭泽琳,李旻俊,张良清.N6-甲基腺苷调控细胞自噬在心肌缺血再灌注损伤机制中作用的研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2020,34(11):1185-1188.
[31] MALAVIYA R, LASKIN JD, LASKIN DL. Oxidative stress-induced autophagy: role in pulmonary toxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2014; 275(2):145-151.
[32] CHIANG WC, WEI Y, KUO YC, et al. High-Throughput Screens To Identify Autophagy Inducers That Function by Disrupting Beclin 1/Bcl-2 Binding. ACS Chem Biol. 2018;13(8):2247-2260.
[33] DJAVAHERI-MERGNY M, MAIURI MC, KROEMER G. Cross talk between apoptosis and autophagy by caspase-mediated cleavage of Beclin 1. Oncogene. 2010;29(12):1717-1719.
[34] KANG R, ZEH HJ, LOTZE MT, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis. Cell Death Differ. 2011;18(4):571-580.
[35] 丁实,赵学荣,李宝群,等.基于Bcl-2/Beclin-1复合体探讨黄连素对脑缺血再灌注损伤大鼠模型的保护作用[J].中国实验动物学报, 2019,27(5):651-657.
[36] 徐庆,陈旭,李建军.自噬调控成骨细胞矿化的研究进展[J].山东医药,2019,59(17):106-108.
[37] 余守和,洪岸.Runx2通过抑制细胞巨自噬以诱导C2C12细胞向成骨细胞分化[J].中国病理生理杂志,2013,29(3):481-487.
[38] 胡祥华,郑瑞武.自噬基因Beclin1过表达骨肉瘤中Ki-67和P53的表达及相关性[J].解剖学研究,2020,42(1):72-75.
[39] 吴爱国,王梦川,王日玮,等.beclin 1过表达对三阴性乳腺癌BT-549细胞生长抑制作用观察[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(15): 1148-1152.
[40] KUSHWAHA P, KHEDGIKAR V, HALDAR S, et al. Azadirachta indica triterpenoids promote osteoblast differentiation and mineralization in vitro and in vivo. Bioorg Med Chem Lett. 2016;26(15):3719-3724.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验，单因素方差分析和LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2019年5月至2020年8月在广州中医药大学第三附属医院实验室以及广州中医药大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及细胞 4月龄SD雌性大鼠10只，体质量180-250 g，用于制备含药血清，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2018-0001；MC-3T3-E1细胞由上海中乔新舟生物科技有限公司细胞库提供。
1.3.2 实验药物补肾健脾活血方药(淫阳藿10 g、肉苁蓉10 g、大枣10 g、熟地黄10 g、当归10 g、丹参10 g、菟丝子10 g、补骨脂10 g、黄芪10 g、白芍10 g)，在广州中医药大学第三附属医院制剂室常规水煎制、浓缩，生药含量为 1.43 g/mL，生产批号：1912001。
1.3.3 实验试剂和仪器 α-MEM培养基(Gibco，No.C12571500BT)；胎牛血清(Gibco，No.10099141)；胰酶(Gibco，No.25200-056)；CCK-8染液(Dojindo，No.CK04)；超净工作台(Biobase公司，SWCJ1D)；离心机(Thermo Fisher公司，ST16)；倒置显微镜(Nikon公司，TE2000-S)；CO2细胞培养箱(Thermo Fisher公司，Heracell 150i)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(Beyotime Biotechnology，Cat.No.C3206)；荧光倒置显微镜(奥林巴斯，IX83)；正置显微镜(奥林巴斯，CX23)；台式高速离心机(Eppendorf，Centrifuge 5424)；电热水浴恒温箱(YIPIEN仪器，YP-HW-225L)；酶标仪(Molecular Devices，CMax Plus)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备含药血清选用健康4月龄SD雌性大鼠10只，普通喂养，其中6只给予补肾健脾活血方煎剂(广州中医药大学附属骨伤科医院制剂中心提供，含生药量1.43 g/mL)灌胃给药，每次按照17.5 mL/kg剂量灌胃，2次/d，间隔5 h，连续灌胃7 d，最后一次灌胃后1 h腹主动脉取血，离心获取血清，抽滤除菌，置于-20 ℃保存备用。另外4只按以上相同程序，以等体积生理盐水灌胃，所取血清为对照血清。
1.4.2 目的基因重组慢病毒载体构建
(1)Beclin-1过表达基因载体构建：在NCBI数据库找到Beclin-1序列，采用CE Design V1.03软件设计重组引物及合成；以重组质粒为测序模板，采用通用测序引物，取部分保种的菌液进行阳性克隆序列验证测序。测序结果表明，构建至PLV.01载体上的Beclin-1序列与NCBI数据库序列完全一致，载体构建成功。转染psPAX2+pMD2.G和PLV.01-Beclin-1到293T细胞来产生慢病毒。
(2)Beclin-1沉默基因载体构建：根据RNA干扰设计序列的原理，使用SH设计程序完成构建，并设计针对Beclin-1基因序列的RNA干扰靶序列；PCR方法获取目的基因；将PLV.01载体用EcoRⅠ和AgeⅠ酶切成线性，1%琼脂糖凝胶电泳后回收；通过同源重组链接双链DNA，并转化为感受态DH5α细胞；在阳性克隆序列验证后，通过转染psPAX2+ pMD2.G和PLV.01-sh-Beclin-1到293T细胞来产生慢病毒。
1.4.3 MC-3T3-E1成骨细胞培养收集对数生长期MC-3T3-E1细胞并计数，用α-MEM完全培养基重悬，调整至细胞浓度为1×108 L-1，接种于96孔板，每孔0.1 mL，在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱孵育过夜，待长至80%左右融合，消化、收集细胞，以1∶3比例进行传代。
1.4.4 慢病毒感染细胞构建稳定表达细胞系取第3代对数生长的MC-3T3-E1细胞，待其达80%融合度时进行病毒感染，感染24 h后换成α-MEM完全培养基，4 h后荧光显微镜观察以及流式细胞仪检测感染效率，嘌呤霉素筛选1周，所得的细胞即为Beclin-1过表达及沉默稳转细胞系。
1.4.5 含药血清干预将上述筛选好的稳转株进行细胞增殖实验，分别使用补肾健脾活血方含药血清和空白血清干预，分为6组：空白血清+空病毒组、空白血清+Beclin-1过表达组、空白血清+Beclin-1沉默组、含药血清+空病毒组、含药血清+Beclin-1过表达组、含药血清+Beclin-1沉默组。调整 MC-3T3-E1细胞浓度为1×108 L-1，分别接种于96孔板和6孔板，每孔0.1 mL和0.5 mL，根据分组情况添加含体积分数为10%空白血清或含药血清的α-MEM完全培养基，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱孵育。
1.4.6 细胞增殖检测各组细胞分别用含药血清或空白血清干预24，48，72 h后，吸去培养液，每孔加入100 μL含CCK-8的α-MEM完全培养基，放于37 ℃，体积分数为5%CO2条件下继续孵育3 h，转移至酶标板，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。
1.4.7 细胞周期检测各组细胞分别用含药血清或空白血清干预72 h后，消化收集细胞，PBS清洗2次，无水乙醇于 4 ℃固定30 min，PBS再清洗1次，加入50 mg/L的PI溶液室温下避光染色30 min，样品上机，流式细胞仪在激发波长488 nm处检测红色荧光，采用Flowjo软件分析。
1.4.8 碱性磷酸酶活性检测各组细胞分别用含药血清或空白血清干预72 h后，采用碱性磷酸酶活性试剂盒检测各组细胞的碱性磷酸酶活性，计算公式如下：碱性磷酸酶活性(金氏单位/g)=(样品管吸光度值-标准管吸光度值/2)/(标准管吸光度值-标准管吸光度值/2)×0.1/样品管蛋白浓度× 1 000。
1.5 主要观察指标各组细胞增殖情况、细胞周期、碱性磷酸酶活性。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计学处理，数据以x±s表示，两组间比较用配对t检验，多组间比较若资料符合正态分布且方差齐用单因素方差分析，否则用非参数Kruskal-Wallis秩和检验，两两组间比较用LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松症是一种全身性骨骼系统代谢失衡的疾病[8]。随着年龄增长，出现骨量丢失和骨强度下降，骨微结构破坏，导致疼痛和易于骨折[9]。2008年由国际骨质疏松症基金会与中国健康促进基金会共同发布的《骨质疏松症防治中国白皮书》显示，中国至少有6 944万人患有骨质疏松症，约2.1亿人口骨量低于正常的标准。当前中国60岁及以上人口占总人口的比例为14.3%，预计到2040年，65岁及以上老年人口占总人口的比例将超过20%[10]。因此，如何提高对骨质疏松症的防治水平在国民经济和社会发展中具有重要意义。
中医学认为骨质疏松症属于“骨痿”范畴[11]。肾藏精，主骨生髓，为先天之本[12]；脾主肌，为后天之本，气血生化之源[13]。《脾胃论》曰：“饮食入胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精……合于四时五脏阴阳……”脾胃化生气血，充养五脏六腑，归于肾者，后天充养先天则骨骼强健；反之，后天之精无以充养，则骨髓空虚[14]。脾肾互为先后天之本，相资相生，气血精液生化有源，是人体各个系统正常活动的前提。“骨痿”的发生主要与肾虚、脾虚、血瘀有关，其中肾虚是主要病因，“多虚多瘀”是其病机特征[15]。根据骨质疏松症的病因病机特点，系统提出了骨质疏松症的中医治则，即“补肾壮骨、健脾益气、活血通络”，并据此筛选出淫阳藿、肉苁蓉、大枣、熟地黄、当归、丹参、菟丝子、补骨脂、黄芪、白芍等中药组成的治疗骨质疏松症的补肾健脾活血方[16-17]。作者所在团队前期研究显示：补肾健脾活血方能促进成骨细胞增殖和矿化，并能促进成骨细胞分泌Ⅰ型胶原；对肿瘤坏死因子α诱导的成骨细胞凋亡具有保护作用；能明显增强成骨细胞的血小板衍生生长因子AA和血小板衍生生长因子α受体mRNA表达；能提高体内雌激素水平，从而使破骨细胞活性下降并且诱导了破骨细胞的凋亡；能抑制体外培养破骨细胞的功能，使骨磨片上的骨吸收陷窝数量明显减少；能调控OPG/RANK/RANKL细胞因子系统，提高血清OPG水平和降低RANKL水平，从而抑制破骨细胞形成；补肾健脾活血方通过调控Wnt/β-catenin信号通路和OPN的表达对大鼠绝经后骨质疏松症有一定的防治作用[18-24]。在前期研究已经证明补肾健脾活血方对骨质疏松病理状态有显著改善作用的基础上，作者进一步研究其防治骨质疏松症的分子机制及作用靶点。
自噬在骨形成中的作用逐渐被认识[25]。研究表明，骨髓间充质干细胞在成骨诱导分化过程中自噬水平明显增加[26]；自噬负调控NF-κB信号通路，促进骨髓间充质干细胞成骨分化[27]；自噬激活成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路，增强成骨细胞增殖、分化和矿化能力，促进骨形成[28]。Beclin-1是细胞自噬的调控因子，也称BECN1基因，是酵母ATG6的同系物[29-30]。研究表明[31-34]：①活性氧能诱导Beclin-1从抗凋亡蛋白Bcl-2上分离形成Beclin1-VPS34-Atg14复合体，使得膜分离及自噬体成核，从而启动自噬；②通过上调Beclin-1在细胞中的表达能够刺激自噬的发生；③Beclin-1可调节细胞自噬与凋亡之间的平衡：当凋亡刺激持续存在时，Beclin-1被凋亡蛋白裂解而不能诱导自噬，细胞最终走向凋亡；自噬又可通过Beclin-1阻止凋亡蛋白Bcl-2激活而抑制凋亡，保护细胞存活[35]。另外，自噬调控关键基因Beclin-1敲除，会引起成骨细胞分化及矿化能力下降[36-37]，提示Beclin-1在骨代谢中亦发挥着重要的作用[38-39]。由此可见，Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路调控成骨细胞增殖分化过程，Beclin-1可能是互反馈作用的交汇点。
该研究运用慢病毒过表达和沉默转染细胞技术研究自噬调控关键基因Beclin-1在MC-3T3-E1成骨细胞增殖中的作用，并探索补肾健脾活血方对Beclin-1及碱性磷酸酶活性的影响，旨在从细胞分子学角度探讨补肾健脾活血方防治骨质疏松症的作用机制。碱性磷酸酶是早期成骨分化的特异指标，其活性改变对成骨细胞增殖的程度有预示性作用[40]。实验结果显示：①与空白血清+空病毒组比较，空白血清+ Beclin-1过表达组的细胞增殖水平、碱性磷酸酶活性均显著升高(P < 0.05)，而空白血清+Beclin-1沉默组的细胞增殖水平、碱性磷酸酶活性降低(P < 0.05)，这说明沉默Beclin-1在成骨细胞增殖分化过程中起负调控因子作用，影响骨代谢；②空白血清+空病毒组、空白血清+Beclin-1过表达组、空白血清+Beclin-1沉默组分别与含药血清+空病毒组、含药血清+ Beclin-1过表达组、含药血清+Beclin-1沉默组对比，后者的细胞增殖水平、碱性磷酸酶活性均显著升高(P < 0.05)，这说明补肾健脾活血方能够调节Beclin-1而影响成骨细胞代谢，增强细胞增殖能力；③过表达的Beclin-1、补肾健脾活血方均可提高MC-3T3-E1成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性，且两者同时作用效果最显著。另外，流式检测结果显示：①空白血清+Beclin-1过表达组和含药血清+Beclin-1过表达组处于G2/M期的细胞比例较高，分别为44.36%和41.60%；空白血清+Beclin-1过表达组和含药血清+空病毒组处于S期的细胞比例较高，分别为28.57%和27.48%；从细胞周期的角度分析，空白血清+Beclin-1过表达组、含药血清+Beclin-1过表达组细胞较多处于DNA合成后期和细胞分裂期，而空白血清+ Beclin-1过表达组、含药血清+空病毒组的细胞较多处于细胞DNA合成期，说明这3组的细胞增殖能力相对较强，含药血清、过表达的Beclin-1是正性调节因子；②空白血清+ 空病毒组、空白血清+Beclin-1沉默组和含药血清+Beclin-1沉默组处于G0/G1期的细胞比例较高，分别为41.75%，46.64%和44.43%，说明这3组的细胞较多数处于DNA合成前期，细胞增殖能力相对较弱。
综上所述，作者推测自噬重要调控基因Beclin-1参与细胞凋亡的调控，而过表达Beclin-1可能导致Beclin-1/Bcl-2复合物的破坏，引起自噬在一定程度上调，促进细胞增殖分化。补肾健脾方促进MC-3T3-E1细胞增殖及提高碱性磷酸酶活性，不仅仅作用于Beclin-1这一靶点，可能作用于自噬多靶点调控。中医用药讲究配伍和“君、臣、佐、使”，用现代医药的观点来看是多种药物联合作用，具有多靶点协同作用的功效。补肾健脾活血方具体通过哪种信号通路对成骨细胞的骨代谢产生影响，在下一阶段将继续深入研究细胞分子机制，为补肾健脾活血方防治骨质疏松症方向提供新的有力的科学依据及实验方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补肾健脾活血方含药血清干预过表达、沉默Beclin-1基因的MC-3T3-E1细胞增殖及碱性磷酸酶活性

Effects of Bushen Jianpi Huoxue Recipe on cell proliferation and alkaline phosphatase activity in Beclin-1 overexpressing and silencing MC-3T3-E1 cells

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[1]	袁家威, 张海涛, 揭珂, 曹厚然, 曾意荣. 基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1428-1433.
[2]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[3]	王晗月, 李富荣, 杨晓菲, 胡巢凤. 高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1056-1063.
[4]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[5]	谢阳, 张淑江, 刘梦兰, 罗映, 杨洋, 李作孝. 雷帕霉素保护实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓神经元的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 695-700.
[6]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[7]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[8]	王向, 韦朝俊, 王尧, 潘裕佳, 刘大男. 构建过表达FNDC5慢病毒载体抑制平滑肌细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5670-5675.
[9]	石淑娟, 李诚, 乔凌燕, 杨槟伊, 李堂. 构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5682-5687.
[10]	孙明帅, 范重山, 李凯杰, 高瑞永, 王煜东, 申瑞雪, 汪利合. 骨关节炎中软骨细胞自噬的作用及其靶向治疗[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5688-5693.
[11]	张群辉, 李一梅, 张得钧. 低氧诱导因子与冠心病：拮抗与保护[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5729-5734.
[12]	李辰凯, 秦文, 刘纯, 陈文扬, 赵红斌. 3D电喷印法制备凹凸棒石/聚己内酯支架及体外成骨诱导性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5459-5464.
[13]	王鼎, 林天烨, 陈伟坚, 陈坚锋, 欧会芝, 李虹竹, 杨鹏, 魏秋实, 何伟, 冯宗权. 股骨头坏死用药规律及机制：数据挖掘和网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5148-5154.
[14]	黄慈辉, 刘家玥, 黄英杰, 庄泽钦, 林云鑫, 李丹, 郑谅. 小针刀联合中药治疗膝骨关节炎疗效的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5240-5248.
[15]	赵千增, 赵振群, 刘万林. 激素性股骨头缺血坏死过程中内质网应激调控自噬与凋亡的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4685-4690.