股骨头坏死用药规律及机制：数据挖掘和网络药理学分析

doi:10.12307/2021.217

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (32): 5148-5154.doi: 10.12307/2021.217

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股骨头坏死用药规律及机制：数据挖掘和网络药理学分析

王鼎1，林天烨2，陈伟坚3，陈坚锋1，欧会芝1，李虹竹4，杨鹏2，魏秋实5，何伟5，冯宗权1

1佛山市中医院，广东省佛山市 528000；2广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；3广州中医药大学附属广州市正骨医院，广东省广州市 510000；4广州中医药大学针灸康复临床医学院，广东省广州市 510405；5广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广东省广州市 510405

收稿日期:2020-08-05 修回日期:2020-08-11 接受日期:2020-09-11 出版日期:2021-11-18 发布日期:2021-07-26
通讯作者: 冯宗权，主任医师，佛山市中医院，广东省佛山市 528000
作者简介:王鼎，博士，主治医师，主要从事中西医结合治疗骨伤科疾病研究
基金资助:
国家自然科学基金(81873327)，课题负责人：何伟；广东省中医药局科研项目(21091116)，课题负责人：杨鹏

Medication rules and mechanism of femoral head necrosis: an analysis based on data mining and network pharmacology

Wang Ding1, Lin Tianye2, Chen Weijian3, Chen Jianfeng1, Ou Huizhi1, Li Hongzhu4, Yang Peng2, Wei Qiushi5, He Wei5, Feng Zongquan1

Received:2020-08-05 Revised:2020-08-11 Accepted:2020-09-11 Online:2021-11-18 Published:2021-07-26
Contact: Feng Zongquan, Chief physician, Foshan Traditional Chinese Medicine Hospital, Foshan 528000, Guangdong Province, China
About author:Wang Ding, MD, Attending physician, Foshan Traditional Chinese Medicine Hospital, Foshan 528000, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81873327 (to HW); Scientific Research Project of Traditional Chinese Medicine Bureau of Guangdong Province, No. 21091116 (to YP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
数据挖掘：通常与计算机科学有关，并通过统计、分析处理、机器学习、专家系统和模式识别等诸多方法来实现上述目标。
网络药理学：是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。网络药理学强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用。
背景：中医药物治疗股骨头坏死常作为辅助手段，然而其用药规律、组方原则及作用机制尚不清楚。
目的：挖掘并分析广州中医药大学第一附属医院三骨科保髋病区治疗股骨头坏死的中药组方用药规律，并探讨潜在新方组合的作用机制。
方法：收集2017年1月至2019年12月广州中医药大学第一附属医院三骨科保髋病区治疗股骨头坏死处方，通过中医传承辅助平台(V2.5)进行数据挖掘，分析处方药物的用药频次、药物关联，并得出潜在中药新方组合。运用TCMSP、String及KEGG数据库对“新处方”中药物靶标间相互作用关系进行分析，并分析所得的相关通路。
结果与结论：①共筛选出126首处方，包含84味中药，演化得到4个潜在新方组合(处方1：桃仁-黄芪-牛膝-当归-独活；处方2：川芎-白芍-续断-白术；处方3：三七-茯苓-熟地-丹参-杜仲；处方4：红花-秦艽-补骨脂-党参)；②筛选出潜在新方组合1(“新处方”)的主要化学成分有74种(如谷甾醇α1和赤霉素17等)；③预测到“新处方”活性成分的作用靶标202个，映射后得出“新处方”治疗股骨头坏死121个潜在靶标(如JUN、AKT1、MAPK1、RELA和白细胞介素6等)；④文章中的中药-疾病靶标涉及的KEGG通路主要包括MAPK信号通路、Toll样受体、核转录因子κB信号通路及缺氧诱导因子1信号通路；⑤通过上述数据分析得出，中医药治疗股骨头坏死用药以活血化瘀、滋肝益肾、补益气血为主，辅以通经络、祛风湿等药，“新处方”中药组合显示了多成分、多靶点的药物作用特点，其机制可能是通过参与促进血管生成和调节骨代谢等途径来调控股骨头坏死的发展。

https://orcid.org/0000-0001-5857-4611 (王鼎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨；股骨；股骨头坏死；髋；中药；数据挖掘；网络药理学；分子机制；信号通路 ,

Abstract: BACKGROUND: Traditional Chinese medicine is often used as an auxiliary method in the treatment of femoral head necrosis. However, its medication rules, prescription principles, and mechanism of action are still unclear.
OBJECTIVE: To explore the rules of prescriptions for the treatment of femoral head necrosis in the hip-protecting ward of the Third Orthopedics Department of the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine using data mining, and to explore the mechanism of action of potential new prescription combinations.
METHODS: From January 2017 to December 2019, the prescriptions for the treatment of femoral head necrosis in the Third Orthopedics Department of the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine were collected. Data mining was conducted through the TCM inheritance auxiliary platform (V2.5), and prescription drugs were analyzed with respect to the frequency of medication uses, drug associations, and potential new prescription combinations. TCMSP, String and KEGG databases were used to analyze the interaction relationship between drug targets in the “new prescription” and to analyze the related pathways obtained.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 126 prescriptions were screened, containing 84 Chinese herbs, and 4 potential new prescription combinations were evolved (prescription 1: peach kernel-astragalus-achyranthes bidentata-angelica-duhuo; prescription 2: Chuanxiong-white peony-dipsacus- atractylodes; prescription 3: Panax notoginseng-poria-rehmannia-salvia-eucommia; prescription 4: safflower-gentiana-psoralen-codonopsis). There were 74 main chemical components (sitosterol α1, gibberellin 17, etc.) of potential new prescription combination 1 (“new prescription”). This study predicted that there were 202 targets for the active ingredients of the “new prescription,” and 121 potential targets for the treatment of femoral head necrosis were obtained after mapping, such as JUN, AKT1, MAPK1, RELA, interleukin-6, etc. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway involved in Chinese medicine-disease targets mainly included the MAPK signaling pathway, Toll-like receptors, nuclear factor-κB signaling pathway and hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway. The results confirmed that traditional Chinese medicine for the treatment of femoral head necrosis is mainly based on promoting blood circulation to remove blood stasis, nourishing liver and kidney, replenishing qi and blood, supplemented by drugs that clear meridians and dispel rheumatism. The “new prescription” is characterized by multiple components and multiple targets (JUN, AKT1, MAPK1, RELA, interleukin-6, etc.), and its mechanism may be through involvement in promoting angiogenesis, regulating bone metabolism, etc. to regulate the development of femoral head necrosis.

Key words: bone, femur, femoral head necrosis, hip, traditional Chinese medicine, data mining, network pharmacology, molecular mechanism, signaling pathway

中图分类号:

王鼎, 林天烨, 陈伟坚, 陈坚锋, 欧会芝, 李虹竹, 杨鹏, 魏秋实, 何伟, 冯宗权. 股骨头坏死用药规律及机制：数据挖掘和网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5148-5154.

Wang Ding, Lin Tianye, Chen Weijian, Chen Jianfeng, Ou Huizhi, Li Hongzhu, Yang Peng, Wei Qiushi, He Wei, Feng Zongquan. Medication rules and mechanism of femoral head necrosis: an analysis based on data mining and network pharmacology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(32): 5148-5154.

图/表（结果） 11

2.1 处方中药用药频次分析经收集、筛选得到126首治疗股骨头坏死的处方，共84味中药；对所得的药物进行“频次统计”，发现使用频次超过30的中药有20味，见表1。

2.2 基于关联规则的组方规律分析应用关联规则分析方法，使用软件“数据分析”模块的“组方规律”功能，对数据进行预读后，设置支持度个数为20，得到常用药组合，见表2。依据同现关系的原理，把各药物的相关联系规律展示于网络视图，由图中间可见，该院保髋病区临床较多用于治疗股骨头坏死的常用药为当归、川芎、牛膝和桃仁等，见图1。

2.3 基于改进互信息法的药物间关联度分析根据处方总数，对不同参数提取的数据进行预读，把相关度设定为8，惩罚度设定为2，然后进一步进行聚类分析，得到处方中两药物间关联度，列出关联系数大于0.016的药对[18]，见表3。

2.4 基于复杂系统熵聚类的潜在新方组合分析按照相关度与惩罚度相互约束原理，基于复杂系统熵聚类的聚类分析，演化出潜在新方组合4个，具体组合见表4。

2.5 新处方的主要成分及潜在靶点 TCMSP平台共收录新处方(桃仁-黄芪-牛膝-当归-独活)化学成分共553个，依据筛选条件：口服利用度≥30%、类药性≥0.18的标椎，筛选出新处方的主要化学成分有74种，去除重复并通过Uniprot数据库标椎基因名转换后，共得到202个作用人类的基因靶点。通过Genecards和OMIM数据库共检索到与股骨头坏死相关基因2 652个，相匹配映射得到新处方治疗股骨头坏死靶点共121个，见图2。

2.6 “新处方-活性成分-基因靶点-疾病”网络构建将新处方活性成分、靶点基因和疾病导入Cytoscape软件，构建新处方-活性成分-靶点基因-疾病可视化网络，节点图形大小与连接度值呈正相关，见图3。

2.7 PPI及Hub蛋白确定将股骨头坏死相关靶点基因导入string在线数据库，设置隐藏未连接的靶点，得到蛋白互作PPI网络，见图4。

蛋白靶点用节点表示，靶点间作用关系用边表示，共包含节点121个，边452条，连接度值平均为7.47。经“Network Analyzer”工具计算得出各作用靶标的连接度，见图5，图中连接度最高的5个靶标分别为Jun原癌基因(Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit，JUN)、丝氨酸/苏氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶1(Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、RELA和白细胞介素6。因此，文章认为上述5 个靶标在新处方治疗股骨头坏死中发挥了重要作用，为潜在核心靶标。结合图3亦可看出，上述5 个作用靶标可影响多个靶标，进一步证实了“新处方”治疗股骨头坏死不仅是通过作用于多个靶标而发挥多种效果，还通过靶标之间的相互作用产生了复杂的网络调节效果。

2.8 GO 功能富集分析 GO功能富集分析结果显示“新处方”治疗股骨头坏死的核心基因的GO功能主要涉及类固醇激素受体活性、核受体活性、转录因子活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、血红素结合、核激素受体结合和RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合等，见图6。

2.9 KEGG通路富集分析通过运用KEGG通路富集分析结果，获得相关通路114条(P < 0.001)。“新处方”治疗股骨头坏死的核心基因的KEGG 通路主要涉及：AGE-RAGE信号通路、核转录因子κB信号通路、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、低氧诱导因子1信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体、内分泌抵抗通路、乙型肝炎信号通路和小细胞肺癌信号通路等，见图7。

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引言

股骨头坏死的致病因素繁多且尚不完全明确，目前因高致残率不断升高而越来越被重视。股骨头坏死可能会导致渐进性的塌陷，随后是髋关节退行性关节炎[1]。由于在器官移植抑制排斥反应和白血病及其他骨髓性疾病的辅助治疗中越来越多地使用激素，股骨头坏死的发病率越来越高[2-3]。研究表明中国新发的股骨头坏死患者为15万-20万/年，以青壮年(30-50岁)为主要患病群体[4-5]。关节置换无疑是一种有效消除疼痛、恢复关节功能的治疗股骨头坏死的方法，然而对于年轻和活跃的股骨头坏死患者而言，行关节置换意味着将面临假体松动、下沉等问题而导致的髋关节翻修，因此研究者一直在致力于探究安全、有效的保髋方法[6-7]。
股骨头坏死的病因、病理机制复杂，对其干预时机、干预方法及疗效评价目前无统一标准。中医药物治疗股骨头坏死常作为辅助手段且治疗方法过于单一，不能从整体进行辨证论治，从而偏离了中医“辨证论治、辨证与辨病”相结合的治疗原则[8]。广州中医药大学第一附属医院三骨科何伟教授曾师从中国著名中西医结合骨伤科专家、股骨头坏死诊疗专家袁浩教授，是全国中医髋关节病重点专科学术带头人，从事股骨头坏死的临床、科研工作达40余年，在研究和治疗股骨头坏死方面作出了许多卓有成效的开拓性工作，从诊断、保髋治疗(保留患者自身髋关节的治疗)康复等方面，提出了一系列新理论、新观点与新方法，如提出股骨头坏死“围塌陷期”的新概念、诊断标准，以及针对“围塌陷期”设计的微创病灶清除、打压和支撑植骨等系列保髋治疗新方法，取得了满意的临床疗效[9]。近几年来，在充分发挥中医药优势下，临床上对股骨头坏死的治疗已取得较好的效果[10]。
文章收集整理广州中医药大学第一附属医院三骨科保髋病区治疗股骨头坏死的有效处方，建立处方数据库，进而通过中医传承辅助平台(V2.5)软件的数据挖掘方法，研究处方中药物的使用频次及配伍关系，总结保髋病区治疗股骨头坏死的用药规律。并通过网络药理学的方法，研究处方中药物的有效成分、作用靶点和相关的通路，为治疗股骨头坏死发现新靶点及新通路，为股骨头坏死的临床治疗提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 处方资料来源由第一作者收集2017-01-01/2019-12-31在广州中医药大学第一附属医院三骨科保髋病区住院部治疗股骨头坏死患者的中药处方，共筛选出处方加减126首(如桃红四物汤和独活寄生汤等)。该方案经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，批准号：NO.Y.[2019]118。
1.2 纳入和排除标准
1.2.1 纳入标准 ①住院患者符合股骨头坏死诊断标准[11]，ARCO分期为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲa期[12]；②治疗期间未行相关保髋手术；③单纯治疗股骨头坏死的住院处方。
1.2.2 排除标准 ①诊断不属于股骨头坏死或ARCO分期属于Ⅲb或Ⅳ期的患者；②患者在接受中医药治疗的同时行相关保髋手术者；③住院期间患者其他内科疾病(如感冒、腹泻等)需要使用中药调理。
1.3 数据挖掘将收集得到的有效处方录入中国中医科学院中药研究所中医传承辅助平台软件(V2.5)，并由另外一位研究者对录入的方药进行核对。操控软件进行“数据分析”，探究处方使用中药的规律。并进一步进行“频次统计”“组方规律”“新方分析”，最后挖掘潜在新方组合[13-14]。
1.4 新处方有效成分及靶点收集将上述数据挖掘所得的“新方组合1”(下称“新处方”)，打开中药药理学系统数据(TCMSP：traditional Chinese medicine
system pharmacology；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) ，输入新处方的中药组成“桃仁-黄芪-牛膝-当归-独活”，按特定条件[口服利用度(OB)≥30及类药性(DL)≥0.18]进行筛选有效成
分[15-17]，并把所得的有效成分在TCMSP数据库收集相关作用蛋白靶点。将所得所有蛋白靶点名导入UniProt数据库(https://www.uniprot.org)，设置物种为人类(Human)，筛选作用人类蛋白靶点名并转换成标椎的基因名。
1.5 疾病靶点获取通过GeneCards (https://www.genecards.org)及OMIM在线数据库(https://www.omim.org)，输入“Osteonecrosis of Femoral Head”和“Femoral Head Necrosis”进行搜索与股骨头坏死相关的基因，设置关联分数(Relevance score)≥10，结果导出为Excel文件。
1.6 治疗股骨头坏死活性成分筛选将人类靶点的基因名与疾病相关基因名进行对比匹配处理，共同靶标结果就是新处方治疗股骨头坏死的关键靶点基因，反向筛选出抗股骨头坏死潜在活性成分，并使用R软件(Version R x64 3.5.1)绘制维恩图，主要观察新处方靶点与股骨头坏死靶点集合。
1.7 药物-活性成分-基因靶点-疾病网络构建通过Cytoscope 3.7.0软件，把上述所得的药物活性成分及基本相关的基因靶点导入，建立可视化网络(活性成分-靶点基因-疾病)，节点(node)代表疾病、靶点基因及活性成分；边(edge)用来连接疾病与基因、基因与活性成分、活性成分与药物的关系，节点的大小与连接度值呈正相关关系。
1.8 蛋白靶点互作(PPI)网络建立将新处方治疗股骨头坏死关键靶点基因输入String数据库(http:// string-db.org/cgi/input.pl，Version 11.0)，设置物种为人类(Homo spaiens)进行构建，设置可信度为中等可信(medium confidence)，隐藏未连接的节点，其他参数数据库保持系统推荐设置，进行蛋白互作分析，获取蛋白互作关系网络。
1.9 GO生物过程(gene ontology-biological process，GO-BP)与KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析及通路建立利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp；Version 6.8)，把上述所得疾病、药物的相关靶点输入其中，并选择物种为人类进行GO生物过程分析和KEGG信号通路富集，以
P < 0.05进行靶基因筛选，分析“新处方”发挥药理作用的生物过程及主要信号通路；并通过R语言软件(Version R x64 3.5.1)建立通路图。
1.10 主要观察指标用药频次、组方规律、药物间关联度、潜在靶点、Hub蛋白及核心基因。

讨论

中医古籍中将股骨头坏死归属于“骨蚀”“骨萎”等范畴，其病区有内因与外因之分，前者多为肝肾不足和气血亏虚，后者多为跌打挫伤、酗酒不节和寒湿外侵等，引起髋周痰瘀闭阻经脉，气血不通，而导致髋关节失于濡养，终成“骨蚀”，其病机为标实本虚，虚实夹杂[19-20]。文章分析、总结保髋病区处方用药规律后发现，股骨头坏死的处方在用药频次上主要有活血化瘀药、补虚药为主。其中活血化瘀药多用桃仁、川芎、三七和牛膝等；补血药多使用当归、熟地黄和白芍等；黄芪、白术和党参等作为补气药被广泛使用；基于补阳药，主要常用续断、骨碎补和杜仲等；此外部分药物具有补肝肾、强筋骨和通经络等功效，如桑寄生和独活等；从药物使用频次可以看出，处方中既有活血化瘀通络之药物以治股骨头坏死的痰湿阻络，又调补阴阳之药物以滋补股骨头坏死的本虚，这与祖国医学对本病病因病机的认识相符。
经数据挖掘显示常用的药物组合有川芎、牛膝，当归、川芎和牛膝等；常用的药对有独活、桑寄生，黄芪和白术等。研究显示药对并不是简单的药物随机组合，也不是相同功效药物的叠加，是医家临床经验的升华[21-22]，如川芎与当归配伍，川芎行气活血止痛治疗股骨头坏死不通则痛之标，当归活血补血，以滋补失于濡养的股骨头，两药合用使得活血不伤正，补血不滋腻。药物潜在新方组合有桃仁-黄芪-牛膝-当归-独活，川芎-白芍-续断-白术，三七-茯苓-熟地-丹参-杜仲等。新处方(桃仁-黄芪-牛膝-当归-独活) 以活血化瘀、补肝肾和补气血的方药为主，故可用于治疗虚实夹杂的股骨头坏死。潜在的新方组合高度聚集了治疗股骨头坏死的有效处方组合，配伍合理；为了更好揭示新处方的作用机制，文章经过TCMSP网站数据库的筛选，共收集到74种三七的活性成分，筛选到121个作用靶标与股骨头坏死有关，表明多成分和多靶标是新处方治疗股骨头坏死机制的特点之一。
由KEGG通路富集结果可知“新处方”可以作用于多条信号通路，其中MAPK信号通路、Toll样受体、核转录因子κB信号通路及缺氧坏死因子1信号通路与股骨头坏死关系非常密切。研究显示可以通过调节MAPK通路而对骨代谢产生影响，MAPK参与骨细胞生成的调节，还可以调节合成和分解代谢通路的平衡[23-24]。Toll样受体是一类蛋白质分子，也是参与非特异性免疫的重要组成成分。Toll样受体是非特异性与特异性免疫之间的桥梁，参与该受体的信号通路和炎性或免疫疾病密切相关[25]。作为Toll样受体类的一种，Toll样受体4主要通过参与单核与树突细胞病原分子模式的识别，作用于免疫识别与应答[26]。有研究发现Toll样受体4在骨组织上亦有表达，主要通过Toll样受体影响破骨细胞的代谢，调控破骨细胞的分化。MYD88在Toll样受体4 的信号传递中是必不可少的，Toll样受体4 信号通路下游的核转录因子κB可被MYD88激活并表达，进而活化破骨细胞，核转录因子κB是一种重要的转录信号分子[27]。有研究发现核转录因子κB信号通路是一条非常重要的信号通路[28]，既可以加快破骨细胞前体细胞的成熟，又可以使破骨细胞被激活。核转录因子κB可以使单核细胞或者巨噬细胞数量增多，进而分化为破骨细胞。研究表明缺氧坏死因子1信号通路是低氧反应通路之一[29-30]，人体细胞对缺氧作出适应性反应的主要因子之一是缺氧坏死因子1。有研究通过成年雄性新西兰大白兔股骨头坏死的研究发现药物可以通过提高缺氧坏死因子1和血管内皮生长因子的表达来改善坏死组织的血液供应及促进骨修复。股骨头坏死的修复可以通过缺氧坏死因子1α信号通路下低氧状态下完成，主要是通过该通路促进核转录因子的表达进而促进血管生成而实现的，故可以预测“新处方”治疗股骨头坏死主要是通过改善坏死组织血液供应、促进骨修复及维持骨量平衡等方面来实现的。
综上所述，广州中医药大学第一附属医院三骨科保髋病区治疗股骨头坏死用药以活血化瘀、滋肝益肾、补益气血为主，辅以通经络和祛风湿等药。文章利用数据挖掘通过频数统计、药物关联的分析，发现并整理中医药治疗股骨头坏死的中药处方用药规律。通过网络药理学发现“新处方”治疗股骨头坏死的作用特点是多成分、多靶点的，其主要通路参与促进血管生成、调节骨代谢等调控股骨头坏死的发展。文章仅从理论层面研究了“新处方”治疗股骨头坏死的作用机制，但在未来的实际应用中还需要更多的相关细胞和分子实验等对文章结论进行验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

股骨头坏死用药规律及机制：数据挖掘和网络药理学分析

Medication rules and mechanism of femoral head necrosis: an analysis based on data mining and network pharmacology

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