构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖

doi:10.12307/2021.300

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (35): 5682-5687.doi: 10.12307/2021.300

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖

石淑娟1，李诚2，乔凌燕2，杨槟伊1，李堂2

1青岛大学，山东省青岛市 266000；2青岛大学附属青岛妇女儿童医院内分泌代谢科，山东省青岛市 266000

收稿日期:2020-11-21 修回日期:2020-11-27 接受日期:2021-01-27 出版日期:2021-12-18 发布日期:2021-08-05
通讯作者: 李堂，博士，教授，主任医师，青岛大学附属青岛妇女儿童医院内分泌代谢科，山东省青岛市 266000
作者简介:石淑娟，女，1994年生，湖南省湘西自治州吉首市人，苗族，青岛大学在读硕士，主要从事儿科内分泌代谢研究
基金资助:
金磊儿科内分泌中青年医师成长科研基金(PEGRF201708007)，项目负责人：李诚；山东省医药卫生科技发展计划项目(2017WS011)，项目负责人：乔凌燕

Construction of human SMARCAL11 gene over-expressed lentiviral vector and its effect on proliferation of embryonic kidney cells

Shi Shujuan1, Li Cheng2, Qiao Lingyan2, Yang Binyi1, Li Tang2

1Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China; 2Department of Endocrinology and Metabolism, Qingdao Women and Children's Hospital Affiliated to Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Received:2020-11-21 Revised:2020-11-27 Accepted:2021-01-27 Online:2021-12-18 Published:2021-08-05
Contact: Li Tang, MD, Professor, Chief physician, Department of Endocrinology and Metabolism, Qingdao Women and Children's Hospital Affiliated to Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Shi Shujuan, Master candidate, Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
Supported by:
Young and Middle-aged Physician Growth Research Fund of Jinlei Pediatric Endocrinology, No. PEGRF201708007 (to LC); Shandong Provincial Medicine and Health Technology Development Plan, No. 2017WS011 (to QLY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
SMARCAL1：又称为HepA相关蛋白，是一种ATP驱动的退火解旋酶，属于SNF2蛋白家族，参与着DNA修复、损伤以及一些基因的转录调控。在肾脏发育过程中SMARCAL1表现为空间和时间选择性表达模式来参与其发育与成熟。
Wnt通路：是由复杂的蛋白网络组成的信号通路，包含50余种蛋白以及相关基因。Wnt信号蛋白与细胞膜上的受体结合后激活胞内信号通路，调节靶基因的表达，在胚胎发育过程中对细胞的增殖、分化、迁徙、极性和凋亡均起到重要的作用。
背景：研究发现SMARCAL1在人类发育和成熟肾脏的多种细胞类型中选择性表达，表明其在肾脏发育过程中发挥着重要的功能作用。
目的：探讨SMARCAL1过表达对于胚肾细胞增殖功能的影响。
方法：取293T细胞和HEK293细胞的第3代细胞用于实验。选用pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体，转染293T细胞包装慢病毒。实验分为3组：空白组为无处理的HEK293细胞；阴性对照组为转染空载病毒的HEK293细胞；SMARCAL1过表达组为转染SMARCAL1过表达病毒的HEK293细胞。对SMARCAL1过表达慢病毒转染后用嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。通过观察转染率来检测病毒滴度；荧光定量PCR和Western印迹法验证稳转细胞株；CCK-8和EdU染色法检测细胞增殖情况；进一步通过荧光定量PCR探讨对Wnt通路的影响。
结果与结论：①SMARCAL1过表达质粒基因序列与目的基因一致，经慢病毒包装后测得SMARCAL1过表达慢病毒滴度为1×108 TU/mL，空载慢病毒滴度为3×108 TU/mL；②与空白组和阴性对照组比较，SMARCAL1过表达慢病毒转染后细胞中SMARCAL1 mRNA和蛋白水平显著升高 (P < 0.05)，细胞增殖活力明显下降(P < 0.05)，Wnt通路中CTNNB1和WNT4基因表达水平降低(P < 0.05)；③实验结果表明，SMARCAL1过表达慢病毒载体构建成功并能够在细胞中顺利表达；SMARCAL1基因可能通过Wnt通信号通路参与调节胚肾细胞增殖，进而影响肾脏发育。

https://orcid.org/0000-0003-0057-7443 (李堂)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 慢病毒载体, SMARCAL1, 人胚肾细胞HEK293, Wnt通路, 细胞增殖

Abstract: BACKGROUND: Studies have found that SMARCAL1 is selectively expressed in a variety of cells in human developing and mature kidneys, indicating that it plays an important role in kidney development.
OBJECTIVE: To investigate the effect of SMARCAL1 overexpression on the proliferation of embryonic kidney cells.
METHODS: 293T and HEK293 cells at passage 3 were selected. pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO vector was used to construct lentiviral vector carrying human SMARCAL1 gene. The human SMARCAL1 gene was over-expressed using lentiviral vector and transfected into 293T cells. There were three groups: blank group untreated HEK293 cells; negative control group, in which HEK293 cells were transfected with empty virus; SMARCAL1 overexpression group, in which HEK293 cells were transfected with SMARCAL1 overexpressing virus. Stably transfected cell lines were screened using puromycin. Virus titer was determined based on the transfection rate. The stable transfection of SMARCAL1 into embryonic kidney cells was verified by quantitative real-time PCR and western blot. The effect of SMARCAL1 overexpression on the proliferation of HEK293 cells was assessed by cell counting kit-8 and EdU assays. Fluorogenic quantitative PCR was further used to evaluate the effect of SMARCAL1 overexpression on Wnt pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: The overexpressed SMARCAL1 plasmid gene sequence was consistent with the target gene. The titer of the SMARCAL1 overexpressed lentivirus was 1×108 TU/mL and 3×108 TU/mL for the control lentivirus. The mRNA and protein levels of SMARCAL1 in HEK293 cells were significantly increased after transfection with SMARCAL1 overexpressed lentivirus (P < 0.05). Up-regulation of SMARCAL1 expression gradually inhibited the proliferation of HEK293 cells (P < 0.05). The mRNA expression levels of CTNNB1 and WNT4 genes in the Wnt pathway were also decreased (P < 0.05). The SMARCAL1 overexpressed lentiviral vector is successfully constructed and expressed in HEK293 cells. The SMARCAL1 gene may be involved in regulating the proliferation of embryonic kidney cells through the Wnt signaling pathway and may affect the development of kidney.

Key words: lentivirus vector, SMARCAL1, HEK293 cells, Wnt signaling pathway, cell proliferation

中图分类号:

石淑娟, 李诚, 乔凌燕, 杨槟伊, 李堂. 构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5682-5687.

Shi Shujuan, Li Cheng, Qiao Lingyan, Yang Binyi, Li Tang. Construction of human SMARCAL11 gene over-expressed lentiviral vector and its effect on proliferation of embryonic kidney cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(35): 5682-5687.

图/表（结果） 8

2.1 SMARCAL1过表达目的质粒测序 SMARCAL1过表达目的质粒测序比对结果表明，测序结果与目的序列一致，提示目的质粒构建成功。
2.2 SMARCAL1过表达慢病毒滴度检测结果选取加入病毒原液为0.033 μL的转染组观察荧光表达情况(图1)并根据公式[滴度(TU/mL)= 细胞数×荧光表达百分比×MOI×病毒稀释倍数×103 ]计算病毒滴度。293T细胞转染72 h后，在荧光显微镜下可观察到在293T细胞中大量绿色荧光蛋白表达，提示慢病毒包装成功，并得出SMARCAL1过表达慢病毒平均滴度为1×108 TU/mL，空载慢病毒平均滴度为3×108 TU/mL。

2.3 过表达SMARCAL1的HEK293细胞系的建立半体积转染法(MOI值=1，2，3，4，5)转染HEK293细胞24 h后对细胞进行抗嘌呤霉素筛选，筛选48 h后观察细胞荧光表达情况(图2)，MOI值为3的情况下HEK293细胞转染72 h后荧光表达率可达80%-90%，提示SMARCAL1过表达慢病毒感染HKE293细胞的最佳病毒感染复数为3 MOI。

2.4 qPCR和Western印迹法检测SMARCAL1过表达效果对SMARCAL1过表达慢病毒转染后嘌呤霉素筛选获得的稳定转染细胞株进行验证，qPCR结果显示SMARCAL1过表达组细胞内SMARCAL1 mRNA的表达量明显高于两组对照组细胞的表达量(P < 0.05)，空白组和阴性对照组的SMARCAL1 mRNA表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)(图3)。

于此类似，Western blot实验发现SMARCAL1过表达慢病毒转染后，用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析显示细胞内SMARCAL1蛋白表达量显著增加(P < 0.05)，空白对照组和阴性对照组的SMARCAL1蛋白表达量无显著差异(P > 0.05)(图4)。上述结果说明，成功获得可诱导SMARCAL1过表达的HEK293细胞株。

2.5 SMARCAL1过表达抑制胚肾细胞增殖通过CCK-8技术比较组间第24，48，72及96小时的吸光度值，结果表明SMARCAL1过表达慢病毒组细胞中各时间点的光吸收值均低于空白组和阴性对照组(P < 0.05)，空白组和阴性对照组的细胞增殖差异性不显著(P > 0.05)(图5)。以上结果表明，SMARCAL1过表达可抑制胚肾细胞的增殖。

EdU染色法比较3组细胞在细胞数定量后同等条件下继续培养3 d，观察细胞的增殖情况(图6，7)。SMARCAL1过表达组的细胞相对于空白组和阴性对照组而言，增殖率(EdU红色荧光标记与蓝色荧光比值)和细胞增殖数量(Hoechst蓝色荧光标记)显著降低(P < 0.05)。

2.6 SMARCAL1过表达对于胚肾细胞中Wnt信号通路的影响 SMARCAL1过表达细胞株增殖缓慢，通过qPCR检测Wnt信号通路中的相关基因表达情况，发现SMARCAL1过表达细胞中CTNNB1和WNT4 mRNA水平均显著下降(P < 0.05)，空白组和阴性对照组该两种基因mRNA的表达量无明显改变(P > 0.05)(图8)，推断SMARCAL1基因上调可能通过改变Wnt通路来影响细胞增殖。

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引言

SMARCAL1又称为HARP(HepA相关蛋白)，是一种ATP驱动的退火解旋酶，属于SNF2蛋白家族。SMARCAL1基因的表达参与肾脏的发育和成熟，研究发现SMARCAL1在人类发育和成熟肾脏的多种细胞类型中选择性表达。SMARCAL1特异的空间和时间表达模式表明其在肾脏发育过程中发挥着重要的功能作用，参与基因亚群的调控[1]。目前关于SMARCAL1基因在肾脏发育方面的基础研究相对较少，通过构建SMARCAL1过表达慢病毒载体，提高转染效率且获得稳定表达的细胞株，更利于在肾脏方面对SMARCAL1的功能进行探索研究。
Wnt信号通路是由复杂的蛋白网络组成的信号通路，包含50余种蛋白以及相关基因。大量研究表明Wnt通路参与肾脏的发育和成熟，规范的Wnt信号通路在胚胎发育模式中起着至关重要的作用。Wnt经典信号通路在整个肾管和输尿管芽早期都有明显的表达活性，这是肾脏正常分枝形态形成所必需的[2-3]，但在出生后肾脏的肾小球中检测不到[4]。在肾小球病变中Wnt通路会出现表达异常升高，这被认为是足细胞功能障碍的原因之一[5-6]。Wnt通路参与了局灶节段性肾小球硬化疾病的发展[7]，Wnt/β-Catenin信号通路被激活，足细胞骨架出现损伤，导致足细胞功能障碍[8-9]。
研究发现SMARCAL1基因的缺失导致患者肾脏发育障碍而表现为局灶节段性肾小球硬化疾病[10]，并发现肾脏细胞的Wnt信号通路相关基因WNT2B、WNT4、WNT6和MYC等表达上调，提出Wnt通路的表达可能与SMARCAL1存在一定相关性[11]。因此作者通过SMARCAL1过表达去进一步探讨SMARCAL1基因的表达与Wnt通路的是否存在一定相关性，以及对胚肾细胞的增殖影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，与空白和阴性对照组比较，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。
1.2 时间和地点实验于2019年10月至2020年10月在青岛大学附属第一医院儿研所及中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 试剂和仪器 DNA聚合酶(诺唯赞生物科技)；BamH I和EcoRI限制性核酸内切酶(赛默飞世尔科技)；HB-infusionTM无缝克隆试剂盒和LipofiterTM转染试剂(汉恒生物科技)；凝胶DNA纯化试剂盒和DNA ladder(捷瑞生物工程)；质粒DNA纯化试剂盒(MACHEREY-NAGEL)；质粒DNA小、大量抽提试剂盒(天根生化科技)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基和PBS(普诺赛)；兔抗人SMARCAL1抗体(Abcam)；兔抗人GAPDH抗体和山羊抗兔IgG抗体、ECL显色试剂盒(Elabscience)；qPCR试剂盒(诺唯赞)；CCK-8试剂(MedChem Express)，EdU试剂盒(碧云天)；PCR仪(BIO-Rad)；PCR仪-384孔(上海启步)；荧光定量PCR仪(Roche)；37 ℃恒温培养箱(精宏)；紫外成像仪、核酸电泳仪、水平电泳槽(天能)；细胞培养箱(WIGGENS)；倒置生物显微镜(奥林巴斯)；蛋白印迹显影(Fusion)；酶标仪(TECAN)。
1.3.2 细胞、质粒和模板目的片段来源于正常人的体细胞；选择来源于人胚肾细胞，能稳定传代的HEK293细胞(普诺赛)，DH5α感受态细胞(天根)，293T细胞(普诺赛)；shRNA质粒、psPAX2载体和pMD2G载体(汉恒)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养购买的293T细胞和HEK293细胞分别用含体积分数10%胎牛血清的MEM新鲜培养基，于37 ℃，体积分数5%CO2恒温培养箱中培养，镜下观察细胞密度达90%时进行传代，每25 cm2培养瓶中加入0.5 mL胰蛋白酶消化四五分钟，使贴壁细胞变圆、脱落，加入3 mL含体积分数10%胎牛血清的MEM新鲜培养基终止消化，以1 000 r/min的转速离心5 min，弃上清液，加入8 mL新鲜完全培养基轻轻吹打重悬数十下变成单细胞悬浮液后接种于2个25 cm2培养瓶中继续培养，传代至第3代后用于后续实验。

1.4.2 SMARCAL1基因过表达慢病毒质粒载体的构建选择在体外哺乳细胞内表达能力较强的CMV启动子，以最常用的puromycin小分子药物标记和ZsGreen荧光蛋白标记作为双重标记用于稳定转染细胞株的筛选，即pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体，用BamH I和EcoRI限制性内切酶进行酶切载体(反应体系：1 μL载体DNA，4 μL 10×buffer，1.5 μL EcoRI，1.5 μL BamHI，32 μL ddH2O)37 ℃水浴锅中反应1.5 h；酶切后通过琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体，PCR扩增SMARCAL1目的片段。用无缝克隆试剂盒使目的片段与载体连接，50 ℃反应30 min后置于冰上5 min，立即进行转化DH5α感受态细胞；将菌液均匀涂布到嘌呤霉素抗性的固体平板上，平板倒放于37 ℃恒温箱培养14 h。筛选阳性克隆扩增后进行测序，测序成功后进行质粒抽提纯化。

1.4.3 实验分组实验分为3组：空白组(无处理的HEK293细胞)、SMARCAL1过表达组(转染SMARCAL1过表达病毒的HEK293细胞)、阴性对照组(转染空载病毒的HEK293细胞)。
1.4.4 慢病毒包装及病毒滴度检测选择呈对数生长的293T细胞用于转染，于37 ℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养，观察细胞密度达到70%-80%的汇合率时进行转染。配置脂转反应体(10 μg psPAX2，5 μg pMD2G，10 μg目的质粒， 75 μL LipofiterTM)，混匀后室温下温育15 min后缓慢滴加至293T细胞中，于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中继续培养；转染16 h后更换含体积分数10%胎牛血清的新鲜完全培养基；转染后48 h和72 h分别收集2次病毒上清于离心管；上清液进行4 ℃，2 000×g，离心10 min，去除细胞碎片；收集上清再次置于超速离心管中，4 ℃，82 700×g，离心120 min，弃上清，用完全培养基重悬病毒沉淀，最后分装到灭菌管中，长期保存于-80 ℃。将293T细胞铺入96孔板内，第1孔加入10 μL病毒液，做3倍梯度稀释，共6个稀释度，观察转染率来检测病毒滴度。
1.4.5 过表达慢病毒稳转细胞株HEK293的获得胰蛋白酶消化收集细胞，重悬细胞沉淀后用细胞培养液将细胞浓度调至5×108 L-1，接种于6孔板中培养。依据前期预实验摸索HEK293转染最适条件(MOI值为3，polybrene质量浓度为 5 mg/L)采用半体积法转染，向含有polybrene的完全培养基中加入适量体积的病毒原液混匀后转染4 h后，再加等体积的同浓度polybrene完全培养基继续转染20 h，转染后通过抗嘌呤霉素药性，用含有2 mg/L嘌呤霉素的新鲜完全培养基筛选获得稳转细胞株。
1.4.6 荧光定量PCR和Western印迹法检测SMARCAL1过表达效果及其对Wnt信号通路的影响将3组生长良好的细胞取出用PBS清洗后，加入Trizol提取细胞总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。根据反转录试剂盒说明步骤操作获得cDNA，再用SYBR Prime ScriptTMRT-PCR在荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR(qPCR)(反应体系：1 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Mix，上下游引物各为0.5 μL，加水至20 μL)，重复3次。内参选用GAPDH，目标基因相对表达量通过2-∆∆Ct法计算，各基因引物序列见表1。

收集3组细胞，每1×106个细胞加入200 μL细胞裂解液提取总蛋白质，用标准品蛋白浓度试剂盒测量样本蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，80 V电泳2 min后，改为120 V电泳2 h；300 mA电转2 h。PVDF膜于5%脱脂奶粉中封闭2 h，TBST洗3遍，每次10 min；一抗(1∶1 000稀释) 4 ℃孵育过夜，TBST洗3遍，每次10 min；二抗(1∶50 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗3遍，每次10 min，ECL显影，重复3次。
1.4.7 CCK-8检测HEK293细胞增殖活力选取3组HEK293细胞配置密度为2×107 L-1单细胞悬液，于96孔板中每孔加入100 μL单细胞悬液，每孔细胞数为2 000个，每组设5个复孔，空白组加入等量的培养基。于37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养，分别在培养0，24，48，72及96 h时每孔加入10 μL CCK-8溶液后继续孵育2 h，将96孔板置于酶标仪上用450 nm波长检测吸光度(A值)，重复3次。以时间为横轴，吸光度为纵轴，绘制各组细胞生长曲线。
1.4.8 EdU染色法检测HEK293细胞增殖情况选取3组HEK293细胞配置浓度为1×108 L-1单细胞悬液，于6孔板中每孔加入2 mL单细胞悬液，每孔细胞数为2×105个。于37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养3 d后，去掉每孔中1 mL培养基，换为1 mL含有10 μmol/L EdU的新鲜培养基继续培养2.0-3.0 h；去掉6孔板中的培养基，加入适量免疫染色固定液，室温固定15 min；免疫染色封闭液洗3遍，每次4 min；加入适量免疫染色通透液，室温下孵育15 min；免疫染色封闭液洗2遍，每次4 min；配制Click反应液(1 720 μL Click Reaction Buffer，80 μL CuSO4，4 μL Azide594，200 μL Click Additive Solution)加入6孔板，室温避光孵育30 min；免疫染色封闭液洗3遍，每次4 min；配制1×Hoechst33342试剂 (5 994 μL PBS，6 μL 1000×Hoechst33342)加入孔板，室温避光孵育10 min；免疫染色封闭液洗3遍，每次4 min；置于倒置荧光显微镜下观察拍照，并进行荧光定量分析。
1.5 主要观察指标 ①SMARCAL1过表达目的质粒测序结果；②SMARCAL1过表达慢病毒滴度检测结果；③过表达SMARCAL1的HEK293细胞系的建立情况；④qPCR和Western印迹法检测SMARCAL1过表达效果；⑤SMARCAL1过表达抑制胚肾细胞增殖情况；⑥SMARCAL1过表达对于胚肾细胞中Wnt信号通路的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，数据以x±s表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肾脏是体内重要的组织器官，参与维持机体水分平衡、酸碱度平衡以及代谢产物排出的生命活动。肾脏来源于胚胎时期输尿管芽及周围基质细胞的分化而形成肾小球和肾小管等结构，最终发育为成熟的肾脏[12]。SMARCAL1编码的蛋白质与染色质重构因子SNF2家族同源，是一种ATP驱动的退火解旋酶，表达于输尿管上皮、间质、后肾间质以及肾元发育的所有阶段，包括成熟的肾小球[1，13]。SMARCAL1可作为一个转录调控因子参与基因的表达[14-16]，在胚胎肾脏的多种细胞中SMARCAL1表现为不同的空间和时间表达模式，当SMARCAL1基因表达模式发生改变时会影响细胞中一些基因组的完整性[17-18]，其中包括Wnt通路相关的一些基因表达[11，19]。Wnt通路参与着肾脏的发育与成熟，Wnt家族蛋白是分泌型的糖蛋白，通过自分泌或旁分泌作用与细胞膜上的受体相结合，激活胞内信号通路，调节靶基因的表达，在胚胎发育过程中对细胞的增殖、分化、迁徙、极性和凋亡均起到重要的作用[20]。Wnt通路包括经典Wnt信号通路(Anonical Wnt signal pathway)，又称为Wnt/β-catenin信号，包括Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b等；非经典Wnt通路(Noncanonical Wnt signal pathway)，包括Wnt4、Wnt5a、Wnt11等。非经典通路又分为Wnt/Ca2+和Wnt/PCP细胞极性通路(Planar cell polarity pathway，PCP)途径[21-23]。Wnt经典信号通路在整个肾管和输尿管芽早期都有明显的表达活性，是肾脏正常分枝形态形成所必需的[24]。当小鼠肾脏中条件性敲除β-Catenin后，其肾脏发育出现明显缺陷[25]；非经典Wnt途径同样也参与收集管的形态发育[26]，其中Wnt4是Wnt蛋白家族中重要的信号因子，是生成肾祖细胞的必要条件，在肾脏器官形成过程中Wnt4是肾小管形成的自动诱导因子，诱导间充质细胞向上皮细胞的分化，并调节细胞黏附因子，在肾小管、间充质和输尿管上皮结构形成中发挥重要作用[27-28]。
经构建的慢病毒载体转染胚肾细胞HEK293后，细胞内目的基因SMARCAL1在mRNA和蛋白水平表达均明显升高，选用pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体成功构建了携带目的基因的过表达慢病毒，并在HEK293细胞内顺利表达，基因过表达在mRNA和蛋白水平上效果均显著。在转染过程中测得HEK293最佳转染复数为3，其转染复数较其他细胞偏小，所需病毒颗粒少，通过慢病毒载体的方式转染HEK293细胞效率高，且过程简易。SMARCAL1基因过表达后胚肾细胞HEK293的增殖活力受到明显抑制，而转染空载慢病毒组中细胞的增殖并未受到显著的抑制，慢病毒转染的方式对于胚肾细胞的增殖不存在明显的影响。与两组对照组相比，在SMARCAL1过表达的HEK293细胞中CTNNB1和WNT4基因表达下调。CTNNB1和WNT4基因分别是Wnt经典通路和非经典通路的重要基因之一，两条Wnt通路均参与肾脏的发育与成熟，呈现着特定的时间表达模式，即在胚肾细胞中呈现高表达，而成熟的肾脏中表现为低表达。SMARCAL1基因表达上调改变Wnt通路中这两个信号分子的表达，会导致胚肾细胞中由本身高表达状态变成低表达，最终影响Wnt通路在胚胎肾脏中特异的时间表达模式。其中Wnt经典信号通路在整个肾管和输尿管芽早期都有明显的表达活性，是肾脏正常分枝形态形成所必需的。CTNNB1基因作为Wnt/β-catenin经典信号中的关键基因，其表达下调影响着Wnt经典信号通路下游的信号传递，从而导致肾脏发育异常。另外Wnt4作为非经典通路中的信号分子，是肾小管形成的自动诱导因子，WNT4基因在胚肾细胞中呈高表达，参与着肾单位的功能与结构分化[2]。若WNT4表达下调，导致间充质细胞向上皮细胞的分化受阻，调节细胞黏附因子能力下降，可影响肾单位及输尿管的结构分化，进而对肾单位功能造成影响[29]。同SMARCAL1基因缺失也导致了胚肾时期Wnt通路中一些分子的表达量发生改变[30]，细胞内SMARCAL1过表达后Wnt经典信号通路中关键基因和非经典信号通路中参与肾脏形态发育的基因表达均明显减少，胚肾细胞增殖受到抑制，这进一步说明SMARCAL1表达的改变影响Wnt通路中一些信号分子的基因表达，影响着胚肾时期细胞内Wnt通路的时间表达模式，并可通过Wnt途径参与胚胎肾脏的发育。
SMARCAL1基因在肾脏发育时期的表达存在空间和时间上的表达模式，SMARCAL1基因缺失时会改变Wnt表达，而SMARCAL1过度上调同样改变Wnt通路中一些基因的表达，亦反向证明了SMARCAL1基因参与Wnt通路的调节。而Wnt通路在胚胎时期肾脏发育中发挥重要的作用，无论是经典通路还是非经典通路的信号异常改变，均会引起肾单位及输尿管发育异常，导致肾脏功能障碍。这为SMARCAL1基因在基因调控功能方面的探索做以铺垫，并有利于SMARCAL1基因缺失所致的肾脏疾病机制的进一步探索与研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖

Construction of human SMARCAL11 gene over-expressed lentiviral vector and its effect on proliferation of embryonic kidney cells

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