合成聚合物Kartogenin/Pluronic F127胶束与骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2021.241

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Kartogenin：长期以来科学家们都致力于寻找可再生成骨的方法，这是对抗骨质疏松症的核心难题，2012-04-05，《Science》在线报道了 Kartogenin的发现，该小分子是一种Smad4/Smad5通路激活剂，拥有极强的促成骨分化能力，能有效促进间充质干细胞向成骨细胞分化，这些研究成果为成骨修复提供了新的线索。
Pluronic：由聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(PEO-PPO-PEO)组成，是一种广泛应用的合成聚合物。Pluronic胶束被认为是一种新型纳米药物，可以增加溶解度和改善循环时间，并在目标部位释放药物。Pluronic共聚物可以自组装成球形胶束，其中环氧乙烷作为亲水性外壳，环氧丙烷作为疏水性内核。将疏水性药物包封在环氧丙烷核心中，将水不溶性化合物转移到胶束溶液的环氧丙烷核心中的过程称为“溶解”。Pluronics胶束可以显著提高疏水性药物的溶解度。
背景：小分子药物Kartogenin是Smad4/Smad5通路激活剂，拥有极强的促骨分化能力，可促进骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞，但其药物效果较为局限。
目的：设计并研制Kartogenin/Pluronic F127胶束，观察其对骨髓间充质干细胞定向成骨分化的作用。
方法：将小分子药物Kartogenin溶于二甲基亚砜中，然后与Pluronic F127溶液混合均匀，通过真空旋转蒸发仪去除有机溶剂购形成一干燥的药脂膜，加入PBS制备为Kartogenin/Pluronic F127胶束。取对数生长期的大鼠骨髓间充质干细胞，分4组处理，分别加入常规细胞培养液(空白组)、含Pluronic F127胶束溶液的细胞培养液(Pluronic F127组)、含Kartogenin的细胞培养液(药物组)、含Kartogenin/Pluronic F127胶束溶液的细胞培养液(实验组)，其中药物组与实验组中药物浓度均为1 μmol/L，Pluronic F127组与实验组胶束浓度一致。检测细胞增殖、凋亡及成骨相关蛋白表达。
结果与结论：①透射电镜显示Kartogenin/Pluronic F127胶束呈现出不规则的球状形态，粒径分布较为均匀，粒径范围为32.6-118.9 nm，多集中在77.3 nm；②MTT检测显示，随着培养时间的延长，4组细胞存活率下降，但均保持在90%以上，4组间细胞生存率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③处理24 h后的流式细胞仪检测显示，4组间的细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④处理24 h后的Western blot检测显示，药物组、实验组的骨桥蛋白、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2及基质金属蛋白酶2表达均高于Pluronic F127胶束组、空白组(P < 0.05)，实验组的碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2及基质金属蛋白酶2表达高于药物组(P < 0.05)；⑤结果表明，Kartogenin/Pluronic F127胶束可促进骨髓间充干细胞的成骨分化。
https://orcid.org/0000-0002-7012-9577 (陈栋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 胶束, Pluronic F127, Kartogenin, 干细胞, 成骨分化, 细胞增殖, 蛋白

Abstract: BACKGROUND: The small molecule drug Kartogenin is an activator of the Smad4/Smad5 pathway. It has a strong ability to promote bone differentiation and can promote the directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts, but its drug effect is relatively limited.
OBJECTIVE: We designed and developed Kartogenin/Pluronic F127 micelles to observe its effect on the directional osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Kartogenin was dissolved in dimethyl sulfoxide and mixed with Pluronic F127 solution. The organic solvent was removed by vacuum rotary evaporator to form a dry drug lipid membrane. PBS was added to prepare Kartogenin/Pluronic F127 micelles. The bone marrow mesenchymal stem cells of rats in the logarithmic growth phase were divided into four groups, which were treated with conventional cell culture medium (blank group), cell culture medium containing Pluronic F127 micelle solution (Pluronic F127 group), cell culture medium containing Kartogenin (drug group), and cell culture medium containing Kartogenin/Pluronic F127 micelle solution (experimental group). Among them, the drug concentration in the drug group and the experimental group was 1 μmol/L, and the micelle concentration in Pluronic F127 group was the same as that in the experimental group. Cell proliferation, apoptosis and expression of osteogenic related proteins were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Transmission electron microscope revealed that Kartogenin/Pluronic F127 micelles had irregular spherical shape and uniform particle size distribution. The particle size ranged from 32.6 nm to 118.9 nm, most of which were concentrated at 77.3 nm. (2) MTT assay showed that with the extension of culture time, the cell survival rate of the four groups decreased, but remained above 90%, and there was no significant difference in the cell survival rate among the four groups (P > 0.05). (3) Flow cytometry after 24 hours of treatment showed that there was no significant difference in the cell apoptosis rate among the four groups (P > 0.05). (4) After 24 hours of treatment, western blot assay showed that the expression levels of osteopontin, alkaline phosphatase, bone morphogenetic protein-2 and matrix metalloproteinase-2 in drug group and experimental group were higher than those in Pluronic F127 micelle group and blank group (P < 0.05). The expression levels of alkaline phosphatase, bone morphogenetic protein-2 and matrix metalloproteinase-2 in experimental group were higher than those in drug group (P < 0.05). (5) The results showed that Kartogenin/Pluronic F127 micelles could promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: bone, material, micelle, Pluronic F127, Kartogenin, stem cells, osteogenic differentiation, cell proliferation, protein

中图分类号:

陈栋, 蒋欣. 合成聚合物Kartogenin/Pluronic F127胶束与骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5473-5477.

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图/表（结果） 5

2.1 Kartogenin/Pluronic F127胶束的表征动态光散射法测量结果显示，Kartogenin/Pluronic F127胶束粒径分布较为均匀，呈现出明显的单峰分布，粒径范围为32.6-118.9 nm，多集中在77.3 nm，如图1A所示；Kartogenin/Pluronic F127胶束透射电镜观察结果如图1B，C所示，胶束呈现出不规则的球状形态，形态大小与动态光散射法测量结果相符合。将Kartogenin/Pluronic F127胶束用去离子水进行充分稀释，此时胶束均匀并分布散在去离子水中。Kartogenin/Pluronic F127胶束的Zeta电位为-46 mV，性质较为稳定。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态学特征显微镜下观察发现，骨髓间充质干细胞接种后24 h呈圆球形，也可见少量细胞贴壁，呈长条形或短小棒状(图2A)；第3天后细胞密度减少，贴壁细胞数增多，形成大小不同，细胞呈细长梭形，伪足增长(图2B)；第7天细胞迅速增加、明显增多，细胞多呈梭形，排列紧密状，最终完全舒展，恢复成梭形(图2C)。

2.3 Kartogenin/Pluronic F127胶束对骨髓间充质干细胞活性的影响 MTT检测显示，随着培养时间的延长，4组细胞存活率下降，但均保持在90%以上，4组间细胞生存率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3，说明Kartogenin/Pluronic F127胶束对骨髓间充质干细胞活性的影响较小。

2.4 Kartogenin/Pluronic F127胶束对骨髓间充质干细胞凋亡的影响处理24 h后的流式细胞仪检测显示，4组间的细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5 Kartogenin/Pluronic F127胶束对骨髓间充质干细胞成骨相关蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，药物组、实验组的骨桥蛋白、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2及基质金属蛋白酶2表达均高于Pluronic F127胶束组、空白组(P < 0.05)；实验组的碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2及基质金属蛋白酶2表达高于药物组(P < 0.05)，两组间骨桥蛋白表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)；Pluronic F127胶束组骨桥蛋白、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2及基质金属蛋白酶2表达与空白组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图5。
2.6 材料的细胞相容性通过细胞增殖与凋亡实验可得，Kartogenin/Pluronic F127胶束具有良好的细胞相容性。

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引言

骨质疏松症是一种多因素所致的进行性系统性骨代谢性疾病，以骨量减少和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折[1]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，分布在骨膜内，可以生成细胞外基质的有机成分，负责骨基质的合成、分泌和矿化作用。成骨细胞主要由骨髓间充质干细胞分化而成，而骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，具有干细胞的自我更新和多向分化能力，在特定的条件下具有分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等多种细胞的潜能，可为骨生长及骨修复提供细胞来源。
骨髓间充质干细胞作为一种干细胞其分化方向具有不确定性，如何诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞成为治疗骨质疏松症的关键。目前国内外多采用细胞因子[2]、药物[3-5]、纳米微粒及miRNA等诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞[6-7]，其中以药物研究最为广泛。小分子药物Kartogenin是Smad4/Smad5通路激活剂，拥有极强的促骨分化能力。2016年王呈等[7]研究发现使用小分子Kartogenin能够促进骨髓间充质干细胞定向分化成成骨细胞，具有积极的临床意义。
有效地将药物运输到靶向组织，不仅可以减少对正常组织的药物毒性作用，而且可以提高局部药物的浓度。药物输送系统包括很多种，其中以纳米颗粒的研究和应用最为广泛，最近已成为癌症治疗的一项重要进步[8-9]。近几十年来，科研人员已研发出了可生物降解的药物输送系统，如基于聚合物的纳米颗粒，它可作为有效药物载体以实现治疗剂向特定靶位点的持续释放[10]。Pluronic是众多纳米颗粒制剂中的一种，其中Pluronic F127因广泛的生物医学应用而备受关注[11]。近年来，Pluronic F127在美国已经被批准进行临床试验，具有较为不错的医疗市场和前景[12]。综合上述原因，实验选用Pluronic F127作为药物载体将治疗物质包封在聚合物中，然后递送到其靶位点，能够增加其溶解度和半衰期；为了提高小分子药物Kartogenin的治疗效果，设计一种新型的药物载体结构，提高Kartogenin的药物有效率。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学观察实验。
1.2 时间及地点实验于2018年3至9月在中日友好医院研究所完成。
1.3 材料小分子药物Kartogenin(Adooq公司，美国)；Pluronic F127(sigma-aldrich公司，美国)；Wistar大鼠骨髓间充质干细胞SCSP-401(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；大鼠骨髓间充质干细胞完全培养液、细胞孵育箱(Thermo公司，美国)；胰蛋白酶(康宁公司，美国)；倒置显微镜、荧光显微镜(奥林巴斯，日本)；多功能酶标仪(北京普天新桥技术有限公司)；基质金属蛋白酶2抗体、骨桥蛋白抗体、骨形态发生蛋白2抗体、碱性磷酸酶抗体(Abcam公司，英国)；分光光度计(F-7000，Hitachi，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养采用含体积分数10%胎牛血清的大鼠骨髓间充质干细胞完全培养液培养大鼠骨髓间充质干细胞。当干细胞完全覆盖培养瓶时用0.2%胰酶消化液进行细胞消化，PBS轻轻进行冲洗，洗刷后残留的胰酶消化液并进行细胞传代。上述细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2孵育箱内孵育，依据细胞生长快慢二三天进行一次传代。
1.4.2 Kartogenin/Pluronic F127胶束的制备将2 mg的Kartogenin分子溶解于1 mL二甲基亚砜中，充分混匀后与Pluronic F127溶液(4 mg Pluronic F127薄片与1 mL氯仿)混合均匀，然后将上述混合溶液移至到茄型瓶中，通过真空旋转蒸发仪去除机溶剂使其在瓶底形成一干燥的药脂膜；随后加入2 mL的PBS溶解药脂膜，并在60 ℃水浴中水化30 min；将水化后的溶液经过0.2 µm孔径的聚碳酸酯膜过滤去除未包裹的Kartogenin分子，从而得到Kartogenin/Pluronic F127胶束。
1.4.3 胶束的表征利用透射电镜和动态光散射法检测Kartogenin/Pluronic F127胶束的形态学特性和粒径参数。用去离子水将纳米胶束溶液稀释至0.25 g/L，取10 μL样品滴于镀碳膜铜网上，室温干燥过夜，挥发掉多余水分；再取5 μL 1%醋酸双氧铀溶液染色30 s，之后滤纸吸干染色液，42 ℃恒温干燥器干燥后，透射电镜下观察样品形态。用去离子水将不同的纳米胶束溶液稀释至0.25 g/L，取1 mL样品，用激光粒度仪(Zetasizer 5000)测定纳米胶束的水合直径和Zeta电位，测定条件：激光波长633 nm，角度90°，温度25 ℃。
1.4.4 投药量的影响利用分光光度计测定载药胶束中Kartogenin的浓度。先量取2 mg胶束标准品，用甲醇溶解后稀释定容于20 mL容量瓶中，配制成质量浓度为100 mg/L的储备液。其次，分别称取标准品Kartogenin分子及空白辅料(Pluronic F127)适量，无水乙醇溶解后稀释至一定倍数，以无水乙醇为空白对照，在200-600 nm波长范围内扫描。结果显示，Kartogenin在462 nm处有最大吸收峰，而空白辅料无干扰，因此以462 nm作为Kartogenin检测波长。胶束的载药量和药物包封率计算公式如下：载药量=胶束包载药物量/(胶束包载药物量+空胶束质量)×100%，包封率=胶束包载药物量/药物投料量×100%。结果显示，Kartogenin/Pluronic F127胶束标准品的载药量和包封率分别为23.85%和34.72%。
1.4.5 实验分组选择对数生长期的骨髓间充质干细胞，制作成均匀的细胞悬液，细胞计数板计数后接种在96孔板中，每孔接种细胞约1×104，分4组处理，分别加入常规细胞培养液(空白组)、含Pluronic F127胶束溶液的细胞培养液(Pluronic F127组)、含Kartogenin的细胞培养液(药物组)、含Kartogenin/Pluronic F127胶束溶液的细胞培养液(实验组)，每组设置3个副孔和1个空白对照孔，对照孔中仅加培养液。置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
药物浓度与胶束的确定：既往研究和前期研究提示，Kartogenin药物能够明确诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞[13]。设置Kartogenin药物终浓度为0，0.1，1，10，100 μmol/L共5个梯度，显微镜和免疫印迹检测显示，随着药物浓度升高，骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力增强，其中以1 μmol/L为最适浓度。称取1 mg Kartogenin，在37 ℃下溶于PBS中，并定溶于300 mL(Kartogenin常温下药物溶解度较小)，此时药物有效浓度为100 μmol/L，通过PBS稀释成1 μmol/L用于药物组。依据Kartogenin/Pluronic F127胶束的包封率，称取20 mg的Kartogenin/Pluronic F127胶束室温下溶于PBS中，并定溶于20 mL，此时胶束浓度为100 μmol/L，依据Kartogenin/Pluronic F127胶束载药量可计算出能够有效释放Kartogenin药物浓度为23.85 μmol/L，通过PBS稀释至1 μmol/L用于实验组。Pluronic F127组释放的Pluronic F127胶束浓度与Kartogenin/Pluronic F127组释放出的Pluronic F127胶束浓度保持一致。
1.4.6 细胞增殖实验处理0，5，10，15，20，25 h后取出 96 孔板，每孔加入 20 μL 的 5 g/L MTT 溶液，正常培养4 h后取出 96孔板。小心吸取掉细胞培养板的上清后，每孔加入 100 μL二甲基亚砜，低速震荡15 min使结晶紫充分溶解混匀，使用酶联免疫仪在490 nm波长处读取数值。根据以下公式计算细胞活性率：细胞活性率(%)=(实验孔A值-空白对照孔A值)/(对照孔A值-空白对照孔A值)×100%。
1.4.7 流式细胞仪检测细胞凋亡处理24 h后，将各组细胞悬液接种于BD Falcon圆底试管，加入100 μL AV-FITC和核酸染料PI，同时阳性对照组1仅加入AV-FITC，阳性对照组2仅加入核酸染料PI，阴性对照组仅加入PBS。轻轻混匀，用Binding Buffer缓冲液冲洗二三次并弃除上清液，取SAV FITC 0.5 μg溶解于0.1 mL Binding Buffer缓冲液中并混匀，待用。加入5 μL PI溶解于含SAV FITC 的Binding Buffer缓冲液中，常温避光放置30 min。每组BD Falcon圆底试管中加入1×Binding Buffer缓冲液0.4 mL。最后上机检测。
1.4.8 Western blot检测成骨相关蛋白处理24 h后，加入RIPA裂解液裂解细胞悬液，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度并用 RIPA 裂解液将蛋白稀释至同一浓度。SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、孵育基质金属蛋白酶2(1∶200)、骨桥蛋白(1∶200)、碱性磷酸酶(1∶200)、骨形态发生蛋白2(1∶400)、β–actin(1∶800)等相应一抗，洗脱后加二抗。采用增强型ECL化学发光试剂使蛋白条带可视化并在胶片上显影。用 Image J 软件检测阳性条带相对吸光度，并对结果进行相对定量分析。
1.5 主要观察指标各组细胞增殖、凋亡及成骨相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用统计学软件Graphpad Prism 7.0进行数据分析，计量数据采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，当P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

由于骨损伤的治疗窗口窄及成骨细胞分化激活困难，临床上治疗十分较为棘手。成骨细胞是蛋白分泌型细胞，能合成并分泌骨基质，产生Ⅰ型胶原，并能吸收、转移钙离子，是骨形成、再建的重要功能细胞。骨髓间充质干细胞在来源、分离方法及可分化组织类型上有着独特的优势，是目前最为合适的骨组织工程细胞来源，具有广阔的发展前景和临床应用价值。骨髓间充质干细胞在特定条件下可向成骨细胞分化，但有关成骨诱导分化条件及作用机制的研究较少。Kartogenin是一种疏水分子药物，其可诱导骨髓间充质干细胞定向分化成成骨[7]。此次实验结果显示，Kartogenin在不影响骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的情况下可促进其成骨分化，这与既往的研究结果一致。
Pluronic F127是最常见的Pluronic聚合物之一，因其广泛的生物医学应用而备受关注[14]。Pluronic F127作为药物传递载体已被临床和药学研究，如囊泡、胶束、混合胶束、原位凝胶、片剂、乳剂、靶向诊断等[15]。尽管具有广谱药理学性质，但由于在水溶液中的低溶解度和在生理pH值下的快速降解，Pluronic系统本质上是热敏性的，其在低温下以液体形式存在，在较高温度下变成半固体凝胶，Pluronic F127的这种可逆转换行为已被应用于各种生物活性剂药物递送的不同领域[16]。Kartogenin分子药物是治疗骨关节炎有效的药物之一，但由于水溶解度低限制了其药效作用。此次实验将Kartogenin和Pluronic F127胶束混合一起制备成药物递送载体，增加了Kartogenin的水溶解度，合成的Kartogenin/Pluronic F127混合胶束性质稳定，具有良好的包封率和载药量，透射电镜显示其为清晰的不规则圆形纳米粒径，且大小相对均一。通过进一步实验发现，Pluronic F127空白胶束对骨髓间充质干细胞活性的影响较小，基本不会引起细胞凋亡，能作为有效的药物载体，这也与既往关于Pluronic F127对细胞无毒性的研究是一致的[17]。
Kartogenin分子是Smad4/5信号通路激活剂，可调节转化生长因子β应答基因的转录，直接激活信号通路引起骨形态发生蛋白分泌[18]。骨形态发生蛋白是一组具有类似结构的高度保守功能蛋白，骨形态发生蛋白分泌后既能与细胞外基质及可溶性拮抗剂结合，还能与多种细胞膜表面的蛋白受体相互作用，它不仅具有区别于其他骨生长因子的独特结构和理化性质，而且其家族中不同成员的基因定位及成骨机制等也不尽相同[19]。Smad信号通路激活也可促进PI3K/Akt信号通路激活，引起碱性磷酸酶的表达升高[20]，碱性磷酸酶的作用主要参与骨骼发育，其在儿童生理性骨骼发育期的活力较正常成人高一二倍[21]。Smad信号通路激活可激活PI3K/Akt信号通路及erk1/2信号通路，而这些通路的激活均可促进基质金属蛋白酶2的表达，基质金属蛋白酶2属于明胶酶亚家族成员，其也是成骨细胞的有效鉴定标记物之一[22]。
骨桥蛋白是一种磷酸蛋白，也是PI3K/Akt信号通路的下游蛋白，在骨基质的矿化和吸收过程中有重要作用[23]。骨桥蛋白分子中有一富含天冬氨酸的区域，通过这一区域骨桥蛋白可以与组织中的羟基磷灰石结合而发挥作用[24]。此次实验显示，Kartogenin/Pluronic F127胶束可显著提高骨髓间充质干细胞内骨桥蛋白、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2及基质金属蛋白酶2蛋白表达水平，这也意味着Kartogenin/Pluronic F127胶束能够有效促进骨髓间充质干细胞定向成骨分化。同时实验结果还显示，Kartogenin/Pluronic F127胶束诱导骨髓间充质干细胞表达成骨相关蛋白优于Kartogenin药物，意味着Pluronic F127胶束作为药物载体可提高其疗效；但结果也显示了细胞内骨桥蛋白表达在Kartogenin/Pluronic F127胶束组和Kartogenin组无明显差异，作者认为骨桥蛋白在骨髓间充质干细胞内表达反应敏感，即小量Kartogenin分子可引起骨桥蛋白在细胞内大量及持续表达。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程