低温冷冻干燥后富血小板纤维蛋白生物学性状的变化

doi:10.12307/2021.142

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 4995-4999.doi: 10.12307/2021.142

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

低温冷冻干燥后富血小板纤维蛋白生物学性状的变化

刘磊，狄海萍，郭海娜，曹大勇，牛希华，夏成德

郑州市第一人民医院烧伤科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2020-06-10 修回日期:2020-06-16 接受日期:2020-08-25 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 夏成德，硕士生导师，主任医师，郑州市第一人民医院烧伤科，河南省郑州市 450000
作者简介:刘磊，男，1989年生，河南省驻马店市人，汉族，2018年首都医科大学毕业，硕士，主要从事干细胞与创面修复的研究。

Changes in biological characteristics of platelet-rich fibrin by freeze-drying technology

Liu Lei, Di Haiping, Guo Haina, Cao Dayong, Niu Xihua, Xia Chengde

Department of Burn, First People’s Hospital of Zhengzhou City, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2020-06-10 Revised:2020-06-16 Accepted:2020-08-25 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Xia Chengde, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Burn, First People’s Hospital of Zhengzhou City, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Liu Lei, Master, Department of Burn, First People’s Hospital of Zhengzhou City, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

富血小板纤维蛋白：是通过一步离心法获得的第2代血小板衍生物，由于生长因子释放缓慢且持久，而且大量的纤维蛋白构成疏松网状结构可为细胞增殖和迁移提供足够的空间，在组织修复与重建外科有潜在的应用价值。

背景：富血小板纤维蛋白在临床上已被用于骨及软组织修复，但是由于其具有生物活性，仅限于短期临床应用。如何稳定保存富血小板纤维蛋白及延长临床应用时间，显得尤为重要。

目的：探讨低温冷冻干燥技术对富血小板纤维蛋白形态学以及对富血小板纤维蛋白中血小板释放生长因子活力及释放规律的影响。
方法：制备新鲜及冻干富血小板纤维蛋白，将其浸泡于无血清的DMEM基础培养基，收集1，7，14，21 d各个时间点冻干及新鲜富血小板纤维蛋白析出液，进行成纤维细胞培养及血小板衍生生长因子BB含量测定，比较冻干前后富血小板纤维蛋白形态结构、生长因子活力及释放规律；通过苏木精-伊红染色进行形态学观察；通过CCK8法测定细胞增殖；通过细胞划痕实验评价对细胞迁移能力的影响；通过ELISA试剂盒检测不同时点两组析出液中血小板衍生生长因子BB含量。
结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，冻干富血小板纤维蛋白结构呈疏松呈海绵状，孔隙直径较大，蓝染有核细胞数目明显减少；②与无血清基础培养基相比，第1天和第7天收集的新鲜及冻干富血小板纤维蛋白析出液明显促进成纤维细胞增殖(P < 0.05)，其中冻干富血小板纤维蛋白析出液对成纤维细胞增殖能力效果更显著(P < 0.05)；③与无血清培养基相比，新鲜、冻干富血小板纤维蛋白析出液及含10%胎牛血清的完全培养基，在12 h及24 h两个时间点均能有效促进成纤维细胞迁移，差异有显著性意义(P < 0.05)；④与新鲜富血小板纤维蛋白析出液相比，冻干富血小板纤维蛋白析出液在12 h及24 h两个时间点促进成纤维细胞的迁移作用更明显(P < 0.05)，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤新鲜富血小板纤维蛋白组血小板衍生生长因子BB在第7天释放量最大，随着时间推移，生长因子释放量逐渐减少；冻干富血小板纤维蛋白组血小板衍生生长因子BB在第1天释放量最大，随着时间推移生长因子释放量逐渐减少，差异有显著性意义(P < 0.05)；两组生长因子释放总量进行比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；⑥结果表明，冻干技术保存富血小板纤维蛋白具有可行性，可以为组织修复重建提供理论依据。

https://orcid.org/0000-0002-3352-5685(刘磊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 低温冷冻干燥, 富血小板纤维蛋白, 成纤维细胞, 血小板衍生生长因子BB, 细胞增殖, 细胞迁移

Abstract: BACKGROUND: Platelet-rich fibrin has been used in bone and soft tissue repair in clinic. However, due to its biological activity, it is limited to short-term clinical application. Therefore, how to keep platelet-rich fibrin stably and prolong the time of clinical application is very important.
OBJECTIVE: To explore the effect of freeze-drying technology on the morphology of platelet-rich fibrin and the activity and release regularity of growth factor releasing from platelets in platelet-rich fibrin.
METHODS: Fresh and freeze-dried platelet-rich fibrin were prepared and then soaked in DMEM basic medium without fetal bovine serum. The supernatant of freeze-dried or fresh platelet-rich fibrin was collected at 1, 7, 14 and 21 days and used for fibroblast culture and platelet-derived growth factor-BB content determination. The morphological structure, activity and release regularity of growth factor releasing from platelets in platelet-rich fibrin were compared before and after freeze-drying. Morphological observation was detected by hematoxylin-eosin staining. Cell proliferation was measured by CCK8 assay. The cell migration ability was evaluated by cell scratch test. Platelet-derived growth factor-BB content of collected supernatant at different time points in the two groups was detected by using ELISA kit.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining showed that the structure of freeze-dried platelet-rich fibrin was loose and spongy, and the pore diameter was large. The number of nuclear cells in blue staining was significantly reduced. (2) Compared with the serum-free medium, the fresh and freeze-dried platelet-rich fibrin extracts collected on the 1 and 7 days significantly promoted the proliferation of fibroblasts (P < 0.05), and freeze-dried platelet-rich fibrin extracts strongly promoted the proliferation capacity of fibroblasts (P < 0.05). (3) Compared with the serum-free medium, the fresh and freeze-dried platelet-rich fibrin extract, and the complete medium containing 10% fetal bovine serum could effectively promote the migration of fibroblasts at 12 and 24 hours, and the difference was statistically significant (P < 0.05). (4) Compared with the fresh platelet-rich fibrin, the freeze-dried platelet-rich fibrin showed higher migration ability of fibroblasts at 12 and 24 hours (P < 0.05), and the difference was statistically significant (P < 0.05). (5) The content of platelet-derived growth factor-BB in fresh platelet-rich fibrin group was the largest at 7 days, and the release of growth factor gradually decreased. The content of platelet-derived growth factor-BB in freeze-dried platelet-rich fibrin group was the largest at 1 day, and the release of growth factor gradually decreased with time, and the difference was statistically significant (P < 0.05). The total content of platelet-derived growth factor-BB showed no significant difference between the two groups (P > 0.05). (6) The results show that freeze-drying technology is feasible for platelet-rich fibrin preservation, which can provide theoretical basis for tissue repair and reconstruction.

Key words: freeze-drying technology, platelet-rich fibrin, fibroblasts, platelet-derived growth factor BB, cell proliferation, cell migration

中图分类号:

刘磊, 狄海萍, 郭海娜, 曹大勇, 牛希华, 夏成德. 低温冷冻干燥后富血小板纤维蛋白生物学性状的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4995-4999.

Liu Lei, Di Haiping, Guo Haina, Cao Dayong, Niu Xihua, Xia Chengde. Changes in biological characteristics of platelet-rich fibrin by freeze-drying technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4995-4999.

图/表（结果） 4

2.1 形态学观察结果苏木精-伊红染色显示，新鲜PRF中纤维蛋白为均质红染疏松网状结构，网状结构中无血小板及细胞结构，在PRF凝胶与红细胞层的交界处聚集着蓝染的白细胞；冻干PRF中纤维蛋白呈疏松呈海绵状，孔隙直径较大，蓝染有核细胞数目明显减少，见图1。

2.2 成纤维细胞增殖能力测定成纤维细胞培养48 h后，在显微镜下进行细胞形态学观察，含有冻干PRF析出液和新鲜PRF析出液培养的成纤维细胞，形态良好，细胞数目明显增多，与含体积分数10%胎牛血清完全培养基培养的成纤维细胞数目相比无明显差别。而无血清培养基培养48 h，细胞形态变圆，脱落，细胞数目明显减少(图2A)。成纤维细胞培养48 h，CCK8进行增增殖能力测定，结果表明，与无血清基础培养基相比，第1天和第7天收集的新鲜及冻干PRF析出液明显促进成纤维细胞增殖(P < 0.05)，其余各个时间点收集的两组析出液促进细胞增殖能力与无血清培养基组相比无差异，第1天及第7天两组析出液对成纤维细胞的增殖能力相比，冻干PRF析出液更能促进成纤维细胞增殖(P < 0.05)，见图2B。结果表明，低温冷冻干燥不影响PRF中血小板释放生长因子的活力。

2.3 成纤维细胞迁移能力测定细胞划痕实验中，与无血清的培养基相比，新鲜PRF析出液及干PRF析出液及含体积分数10%胎牛血清的完全培养基，在12 h及24 h两个时间点均能有效刺激成纤维细胞的迁移，差异有显著性意义(P < 0.05)。与新鲜PRF析出液相比，冻干PRF析出液在12 h及24 h两个时间点促进成纤维细胞的迁移作用更明显(P < 0.05)，差异有显著性意义(P < 0.05)。提示新鲜及冻干PRF析出液均可促进成纤维细胞的迁移，低温冷冻干燥并不影响血小板释放的生长因子活性，见图3。

2.4 生长因子血小板衍生生长因子BB测定结果显示，新鲜PRF组血小板衍生生长因子BB在第7天释放量最大，随着时间推移，生长因子释放量逐渐减少；冻干PRF组血小板衍生生长因子BB在第1天释放量最大，随着时间推移生长因子释放量逐渐减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。两组生长因子释放总量进行比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计生物学性能观察实验。
1.2 时间及地点于2019年6至12月在郑州市第一人民医院干细胞重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂 DMEM培养液(Solarbio，中国)，磷酸盐缓冲液(Solaebio，中国)，氨苄青霉素(Amresco，美国)，硫酸链霉素(Am-resco，美国)，胎牛血清(Gibco，美国)，0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)，CCK8试剂盒(Amresco，美国），血小板衍生生长因子BB试剂盒(Solarbio，中国)。
1.3.2 实验仪器恒温培养箱(Thermo，美国)，离心机(TD25-WS，中国)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，冻干机(CHRIST)。
1.3.3 实验主要仪器显微镜(荷兰飞利浦)；SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化公司)；Hettich ROTOFIX32A离心机(Hettich公司)；CO2培养箱(Thermo Scientifc公司)；流式细胞仪(BIO-RAD公司)；普通光学倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)；JSM-6390A型扫描电镜(JEOL公司)；实时荧光定量反转录PCR仪(上海睿铂赛生物科技有限公司)；MLDEL680型酶标仪(BIO-RAD公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备新鲜PRF及冻干PRF 根据文献报道，抽取12名健康志愿者静脉血10 mL置于无添加剂玻璃管中，然后以400×g离心力离心10 min后取出，4 ℃静置 10 min[11]。在无菌操作台内将离心管中最上层的贫血小板血浆弃掉后，再用眼科镊将PRF凝胶轻轻取出，切除其下端的红细胞部分，即得到新鲜的 PRF，全血离心后分3层，中间层即为PRF，将制备好的PRF放置无菌6孔板中，封口膜封存，置入-80 ℃冰箱中冷冻过夜。然后将培养皿置于冷冻干燥机并在真空低温(400 Pa，-45至-40 ℃)条件下冷冻干燥 24 h，即为冻干PRF，4 ℃冰箱储存。以上所有操作志愿者均知情同意，并通过郑州市第一人民医院伦理委员会批准。
1.4.2 制备冻干及新鲜PRF条件培养基将新鲜及冻干PRF置于15 mL无菌离心管，加入5 mL无血清的DMEM基础培养基，分别在1，7，14，21 d收集析出液，每一时间点收集析出液后，再加入5 mL无血清培养基，待下一个时间点进行收集，获得析出液浓度定义为100%。析出液一部分用于生长因子测定，一部分用于细胞实验。用于细胞实验的条件培养基是用无血清培养基根据体积进行稀释获得，配置最终浓度为20%，进行细胞实验。
1.4.3 PRF形态学观察将新鲜及冻干PRF浸泡在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切片，4 μm厚度石蜡切片经过脱蜡，进行苏木精-伊红染色光学显微镜下观察并拍照。
1.4.4 成纤维细胞增殖能力测定根据文献报道，将包皮环切术后的皮肤组织进行成纤维细胞分离培养，使用P2代成纤维细胞进行细胞实验[12]。成纤维细胞以2×104/孔密度接种于6孔板中，细胞贴壁后，加入无血清基础培养基培养24 h，倒出培养基，分别加入含体积分数10%胎牛血清的完全培养基及无血清基础培养基，在0 h及48 h显微镜下拍照观察细胞的形态及数目。为了比较不同时间点收集的析出液对成纤维细胞增殖的影响，将成纤维细胞以2×103/孔密度接种于96孔板，12 h后待细胞贴壁，更换无血清基础培养基继续培养24 h，倒出培养基，分别加入1，7，14，21 d收集的体积分数为10%的冻干及新鲜PRF析出液100 μL，48 h后使用CCK8试剂盒进行细胞增殖实验测定，并计算细胞增殖率。
1.4.5 成纤维细胞迁移能力测定将成纤维细胞以2×104密度接种于12孔板中，直到细胞融合85%，开始进行划痕实验。使用200 μL微量移液枪枪头在12孔板内垂直于横线纵向划痕，枪头要垂直，不能倾斜。PBS冲洗3次清除细胞碎片，分别加入2 mL无血清DMEM培养基，含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基2 mL、10%冻干PRF析出液(无血清)2 mL和10%新鲜PRF析出液(无血清)2 mL，其中冻干及PRF析出液均使用第7天收集的析出液，并按体积分数配置为浓度为10%的条件培养基。于12 h及24 h分别拍照记录，比较各组迁移面积百分百比。
1.4.6 生长因子血小板衍生生长因子BB测定将收集的1，7，14，21 d析出液用ELISA试剂盒进行测定。
1.5 主要观察指标 ①冻干及新鲜PRF形态学；②冻干PRF生长因子活力及释放规律。
1.6 统计学分析数据采用Graph Pad Prism软件处理，两独立样本比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

新鲜PRF制备是通过自然离心获得的凝胶结构，可缓慢释放所含生长因子，但是由于PRF富含大量纤维蛋白，导致该凝胶结构坚韧不易塑形，如长期体外储存则有细菌污染风险，而临床又需要即刻应用[8]。采用低温冷冻技术保存PRF，不仅保留了新鲜PRF的生物学活性，还可以根据临床需要将冻干PRF制备成膜片状、颗粒状或者粉末状，亦可以作为构建组织工程的支架材料，方便临床应用，也利于长期冷存和运输。生物材料的表面形态、硬度及孔隙直径等均会影响接种细胞的增殖、黏附及基因表达[12-16]。研究表明，冻干PRF的孔隙直径是新鲜PRF的13.4倍，这种疏松的结构更有利于细胞的增殖和黏附[12]。此次研究在低温冷冻干燥处理PRF后，观察冻干PRF的形态学结构，苏木精-伊红染色显示冻干PRF结构呈疏松海绵状，孔隙直径较大，蓝染有核细胞数目明显减少。由此可见冻干保存PRF可以增大其孔隙直径，较大的孔隙直径一方面可以为细胞增殖提供足够的空间，另一方面可以增加与液体的接触面积加快PRF体内降解。
PRF中血小板能够释放大量生长因子，实现组织修复及重建[17-29]。在创面修复过程中，成纤维细胞是创面愈合的主要修复细胞，成纤维细胞活化、增殖、迁移、合成胶原填补缺损从而促进创面愈合[30-32]。血小板衍生生长因子是调控细胞增殖和分化的关键因子，其中血小板衍生生长因子BB是促进成纤维细胞增殖及胶原合成的关键因子[33]。因此作者通过获得新鲜及冻干PRF析出液用于培养成纤维细胞，观察其对成纤维细胞增殖及迁移能力的影响，同时检测各个时间点析出液中血小板衍生生长因子BB的含量及释放总量；结果表明，与无血清基础培养基相比，第1天和第7天收集的新鲜及冻干PRF析出液和含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基均能明显促进成纤维细胞增殖(P < 0.05)，其余各个时间点两组析出液促进细胞增殖能力与无血清基础培养基相比无明显差异；第1天及第7天两组析出液对成纤维细胞增殖能力相比，冻干PRF效果显著(P < 0.05)，并且随着时间延长对细胞生长促进作用明显减弱，这可能与生长因子随时间延长释放量逐渐减少有关。通过检测各个时间点收集析出液生长因子的量及释放总量进行比较，结果显示新鲜PRF组血小板衍生生长因子BB在第7天释放量最大，随着时间推移，生长因子释放量逐渐减少；冻干PRF组血小板衍生生长因子BB在第1天释放量最大，随着时间推移生长因子释放量逐渐减少，差异有显著性意义(P < 0.05)；两组生长因子释放总量进行比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。通过细胞划痕实验，新鲜PRF析出液及干PRF析出液及含体积分数10%血清的完全培养基，在12 h及24 h两个时间点均能有效刺激成纤维细胞的迁移，差异有显著性意义(P < 0.05)。与新鲜PRF析出液相比，冻干PRF析出液在12 h及24 h两个时间点均能明显促进成纤维细胞的迁移(P < 0.05)，差异有显著性意义(P < 0.05)。以上结果提示新鲜及冻干PRF析出液均可促进成纤维细胞的增殖与迁移，但冻干PRF析出液促进细胞增殖及迁移的能力更明显，证实低温冷冻干燥并不影响血小板释放生长因子的活性以及含量，这与文献报道结果一致[34-35]。由于新鲜PRF释放生长因子至少可以维持7 d，因此在进行创面修复时将7 d作为一个治疗周期，此次研究结果证实冻干PRF中血小板释放的血小板衍生生长因子BB可以维持7 d；同样在成纤维细胞增殖实验中观察到，第1天及第7天收集的冻干PRF析出液更利于成纤维细胞的增殖，7 d之后收集的析出液对细胞增殖无明显影响，这与生长因子释放规律保持一致。
综上所述，低温冷冻干燥技术保存PRF是一种可行的方法，作为一种有活性的生物支架材料，在组织工程领域有潜在应用价值，可以为慢性创面治疗提供理论依据；但是关于冻干PRF在体内能否进行创面修复，效果如何，有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低温冷冻干燥后富血小板纤维蛋白生物学性状的变化

Changes in biological characteristics of platelet-rich fibrin by freeze-drying technology

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[1]	沈江涌, 贺茜, 唐玉婷, 王建军, 刘金毅, 陈园园, 王昕艺, 刘彤, 孙浩原. 铁死亡诱导剂RAS合成致死分子3抑制病理性瘢痕成纤维细胞的纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1168-1173.
[2]	梅静怡, 刘江, 肖聪, 刘鹏, 周浩浩, 林展翼. 组织工程血管构建过程中平滑肌细胞增殖变化及代谢模式[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1043-1049.
[3]	左俊, 马少林. β-谷甾醇对增生性瘢痕成纤维细胞作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 216-223.
[4]	王倩, 卢子昂, 李利和, 吕超亮, 王盟, 张存鑫. 青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 224-230.
[5]	姚思琦, 黎文正, 汪虹. 转化生长因子β/Smad信号通路与瘢痕疙瘩的靶向治疗[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2619-2624.
[6]	左俊, 马少林. 增生性瘢痕差异表达基因及小分子药物预测的生物信息学分析与验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2166-2172.
[7]	孙菁, 廖健, 孙江龄, 程萍, 冯红超. 重组人生长激素促进人牙髓干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 56-61.
[8]	贺茜, 万瑀, 唐玉婷, 杨安宁, 吴凯, 焦运, 白志刚, 姜怡邓, 沈江涌. 铁死亡诱导剂抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-.
[9]	乔鲁卉, 马子雨, 郭浩宇, 侯玉东. 葛根素与淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 872-877.
[10]	柯维强, 陈祥慧, 陈小玲, 孟杰, 马燕琳. 自体外周血干细胞移植联合利妥昔单抗治疗弥漫大B细胞淋巴瘤及相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 915-920.
[11]	胡新明, 乔艳华, 王肖帆, 李林玉, 赵冰. 长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1参与盆腔器官脱垂的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 669-675.
[12]	唐玉婷, 贺茜, 万瑀, 王建军, 杨安宁, 吴凯, 焦运, 白志刚, 姜怡邓, 沈江涌. 紫草素调控MicroRNA-382-5p抑制人增生性瘢痕成纤维细胞纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5642-5648.
[13]	黄倩, 郝丽英, 贺龙龙, 杜良智. 氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层影响成骨细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5430-5435.
[14]	周悦彬, 郭洪刚. 镁基合金支架负载兔源性骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5491-5496.
[15]	郑晓晗, 冯晓丽, 胡兰, 高仕君, 魏艳召, 黄婷, 孙圣童, 魏绪芳, 王埮, 赵振强. 巨噬细胞迁移抑制因子促进人胚胎干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5348-5356.