细胞信号转导抑制因子3影响青少年特发性脊柱侧凸畸形软骨内的成骨活性

doi:10.12307/2022.818

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (26): 4160-4165.doi: 10.12307/2022.818

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细胞信号转导抑制因子3影响青少年特发性脊柱侧凸畸形软骨内的成骨活性

孙锦鹏，刘军，白云峰，华峰，王浩然，郑宏瑞，吴涛

南京医科大学第二附属医院骨科，江苏省南京市 210011

收稿日期:2021-07-17 接受日期:2021-08-21 出版日期:2022-09-18 发布日期:2022-03-07
通讯作者: 吴涛，博士，副主任医师，南京医科大学第二附属医院骨科，江苏省南京市 210011
作者简介:孙锦鹏，男，1995年生，汉族，在读硕士，主要从事青少年特发性脊柱侧凸畸形及椎板切除术后瘢痕形成研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(81301523)，项目负责人：吴涛；江苏省自然科学基金面上项目(BK20181499)，项目负责人：吴涛

Effects of suppressor of cytokine signaling 3 on osteogenic activity in the cartilage of adolescent idiopathic scoliosis

Sun Jinpeng, Liu Jun, Bai Yunfeng, Hua Feng, Wang Haoran, Zheng Hongrui, Wu Tao

Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China

Received:2021-07-17 Accepted:2021-08-21 Online:2022-09-18 Published:2022-03-07
Contact: Wu Tao, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China
About author:Sun Jinpeng, Master candidate, Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Fund), No. 81301523 (to WT); the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (General Project), No. BK20181499 (to WT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
青少年特发性脊柱侧凸畸形：是一类多发于女性且起病于青春期，没有其他伴发骨骼发育畸形且畸形进展迅速的脊柱三维畸形总称。该脊柱畸形主要由冠状位上脊柱侧向移位、矢状位上胸椎生理性后凸消失及水平面上椎体轴向旋转3个维度畸形综合构成，最终造成躯干失衡的发生，引起一系列相关并发症的发生。临床上该病表现出畸形进展速度与青春期骨骼生长速度明显相关的特征。
瘦素：是一种蛋白质类激素，主要由白色脂肪组织分泌，从外周及中枢两个方面参与机体能量代谢、软骨细胞活性、成骨细胞活性等诸多机体重要功能的调控。瘦素可激活体内下丘脑-甲状腺-交感神经通路，促进去甲肾上腺素、胰岛素样生长因子及甲状腺素等激素的分泌，增强生长板软骨细胞增殖分化活性；此外，瘦素可以直接作用于外周生长板软骨细胞表面受体，促进细胞增殖分化活性。

背景：已有相关研究报道，瘦素与细胞信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)表达异常在青少年特发性脊柱侧凸畸形发病中起重要作用。
目的：探讨SOCS3是否通过瘦素信号传导通路调节软骨细胞内成骨活性。
方法：①将人棘突软骨细胞分别以0(对照组)，100 µg/L瘦素刺激24 h，免疫组化染色观察Ⅱ型胶原表达。②将人棘突软骨细胞分9组培养，分别为空白对照组、转染pcDNA3.1-NC组、转染pcDNA3.1-SOCS3组、转染siRNA-NC组、转染siRNA-SOCS3组、瘦素+转染pcDNA3.1-NC组、瘦素+转染pcDNA3.1-SOCS3组、瘦素+转染siRNA-NC组、瘦素+转染siRNA-SOCS3组。置于培养箱中培养24 h后，实时荧光定量PCR法检测SOCS3 mRNA的表达量，MTT法检测细胞抑制率。
结果与结论：①免疫组化染色显示，瘦素刺激组软骨细胞Ⅱ型胶原表达多于对照组。②实时荧光定量PCR检测显示，转染pcDNA3.1-SOCS3可显著提高软骨细胞SOCS3 mRNA表达量，转染siRNA-SOCS3可显著降低软骨细胞SOCS3 mRNA表达量，转染pcDNA3.1-NC、siRNA-NC对软骨细胞的SOCS3 mRNA表达量无影响；瘦素预刺激可提高转染pcDNA3.1-SOCS3、siRNA-SOCS3软骨细胞的SOCS3 mRNA表达量，对转染pcDNA3.1-NC、siRNA-NC软骨细胞的SOCS3 mRNA表达量无影响。MTT检测显示，转染pcDNA3.1-SOCS3可抑制软骨细胞内成骨活性，转染siRNA-SOCS3可增强软骨细胞内成骨活性；瘦素预刺激可提高转染pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-SOCS3、siRNA-NC、siRNA-SOCS3软骨细胞内成骨活性。③结果表明，瘦素刺激可提高软骨细胞内成骨活性，SOCS3表达上调可通过瘦素抵抗抑制软骨细胞内成骨活性。
缩略语：细胞信号转导抑制因子3：suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3

https://orcid.org/0000-0002-7927-4199 (孙锦鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 瘦素, 细胞信号转导抑制因子3, 软骨细胞, 青少年, 脊柱侧凸畸形, 质粒转染

Abstract: BACKGROUND: It has been reported that the abnormal expression of leptin and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) plays an important role in the pathogenesis of adolescent idiopathic scoliosis.
OBJECTIVE: To investigate whether SOCS3 regulates the osteogenic activity of chondrocytes through the leptin signaling pathway.
METHODS: Human spinous chondrocytes were stimulated with 0 (blank control group) and 100 µg/L leptin for 24 hours, and immunohistochemical staining was used to detect the expression of type II collagen. The human spinous chondrocytes were cultured in nine groups: a blank control group, a pcDNA3.1-NC transfected group, a pcDNA3.1-SOCS3 transfected group, a siRNA-NC transfected group, a siRNA-SOCS3 transfected group, a leptin+transfected pcDNA3.1-NC group, a leptin+transfected pcDNA3.1-SOCS3 group, a leptin+transfected siRNA-NC group, and a leptin+transfected siRNA-SOCS3 group. After being cultured in an incubator for 24 hours, real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of SOCS3, and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay was used to detect the cell inhibition rate.
RESULTS AND CONCLUSION: Results of immunohistochemical staining showed that the expression of type II collagen in chondrocytes s was higher in leptin-stimulated group than the blank control group. Results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that transfection of pcDNA3.1-SOCS3 could significantly increase the mRNA expression of SOCS3 in chondrocytes, and transfection of siRNA-SOCS3 could significantly reduce the mRNA expression of SOCS3 in chondrocytes. In contrast, transfection of pcDNA3.1-NC and siRNA-NC had no effect on the mRNA expression of SOCS3 in chondrocytes. Leptin pre-stimulation could increase the mRNA expression of SOCS3 in chondrocytes transfected with pcDNA3.1-SOCS3 and siRNA-SOCS3, but it had no effect on the mRNA expression of SOCS3 in chondrocytes transfected with pcDNA3.1-NC and siRNA-NC. Results of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed that transfection of pcDNA3.1-SOCS3 could inhibit the osteogenic activity of chondrocytes, and transfection of siRNA-SOCS3 could enhance the osteogenic activity of chondrocytes. And leptin pre-stimulation could increase the osteogenic activity of chondrocytes transfected with pcDNA3.1-NC, pcDNA3.1-SOCS3, siRNA-NC, and siRNA-SOCS3. These findings indicate that leptin stimulation can increase the osteogenic activity of chondrocytes, and upregulating the expression of SOCS3 can inhibit the osteogenic activity of chondrocytes through leptin resistance.

Key words: leptin, suppressor of cytokine signaling 3, chondrocyte, adolescent, scoliosis, plasmid transfection

中图分类号:

孙锦鹏, 刘军, 白云峰, 华峰, 王浩然, 郑宏瑞, 吴涛. 细胞信号转导抑制因子3影响青少年特发性脊柱侧凸畸形软骨内的成骨活性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4160-4165.

Sun Jinpeng, Liu Jun, Bai Yunfeng, Hua Feng, Wang Haoran, Zheng Hongrui, Wu Tao. Effects of suppressor of cytokine signaling 3 on osteogenic activity in the cartilage of adolescent idiopathic scoliosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(26): 4160-4165.

图/表（结果） 4

2.1 瘦素刺激对软骨细胞内成骨活性的影响免疫组化染色显示，与对照组相比，瘦素刺激组软骨细胞被染成棕色的部分更深更密集，见图1，表明瘦素刺激后软骨细胞增殖变快、活性增强。

2.2 瘦素刺激及转染对软骨细胞内SOCS3 mRNA表达量的影响见表1。

与空白对照组比较，转染pcDNA3.1-NC、siRNA-NC组SOCS3 mRNA表达量无明显变化(P > 0.05)，表明空载体质粒和空载体siRNA不会对软骨细胞SOCS3的mRNA水平产生影响。与空白对照组比较，转染pcDNA3.1-SOCS3组SOCS3 mRNA表达量升高(P < 0.05)，转染siRNA-SOCS3组SOCS3 mRNA表达量降低(P < 0.05)，表明转染pcDNA3.1-SOCS3使软骨细胞内过表达SOCS3，转染siRNA-SOCS3使软骨细胞内低表达SOCS3。
与转染pcDNA3.1-NC组比较，瘦素+转染pcDNA3.1-NC组SOCS3 mRNA表达量无明显变化(P > 0.05)；与转染siRNA-NC组比较，瘦素+转染siRNA-NC组SOCS3 mRNA表达量无明显变化(P > 0.05)，说明转染空载体质粒或siRNA时，瘦素预刺激不会影响软骨细胞内SOCS3 mRNA的表达。
与转染pcDNA3.1-SOCS3组比较，瘦素+转染pcDNA3.1-SOCS3组SOCS3 mRNA表达量升高(P < 0.05)；与转染siRNA-SOCS3组比较，瘦素+转染siRNA-SOCS3组SOCS3 mRNA表达量升高(P < 0.05)，结果表明，瘦素可与pcDNA3.1-SOCS3质粒协同作用提升SOCS3表达水平，瘦素可部分抵消转染siRNA-SOCS3造成的软骨细胞SOCS3表达降低。
与瘦素+转染pcDNA3.1-NC组比较，瘦素+转染pcDNA3.1- SOCS3组SOCS3 mRNA表达量升高(P < 0.05)；与瘦素+转染pcDNA3.1-NC组比较，瘦素+转染siRNA-SOCS3组SOCS3 mRNA表达量降低(P < 0.05)。结果表明经瘦素预刺激后，转染pcDNA3.1-SOCS3可使软骨细胞SOCS3 mRNA的表达升高，转染siRNA-SOCS3可使软骨细胞SOCS3 mRNA的表达降低。
2.3 瘦素刺激及SOCS3表达量改变对软骨细胞内成骨活性的影响见表2。

与转染pcDNA3.1-NC组比较，转染pcDNA3.1-SOCS3组细胞抑制率升高(P < 0.05)；与转染siRNA-NC组比较，转染siRNA-SOCS3组细胞抑制率降低(P < 0.05)；与瘦素+转染pcDNA3.1-NC组比较，瘦素+转染pcDNA3.1-SOCS3组细胞抑制率升高(P < 0.05)；与瘦素+转染siRNA-NC组比较，瘦素+转染siRNA-SOCS3组细胞抑制率降低(P < 0.05)。结果表明，上调SOCS3表达量可提高软骨细胞抑制率，表明SOCS3可通过瘦素抵抗抑制瘦素对软骨细胞内成骨活性的提高。
与转染pcDNA3.1-NC组比较，瘦素+转染pcDNA3.1-NC组细胞抑制率降低(P < 0.05)；与转染siRNA-NC组比较，瘦素+转染siRNA-NC组细胞抑制率降低(P < 0.05)；与转染转染pcDNA3.1-SOCS3组比较，瘦素+转染pcDNA3.1-SOCS3组细胞抑制率降低(P < 0.05)；与转染siRNA-SOCS3组比较，瘦素+转染siRNA-SOCS3组细胞抑制率降低(P < 0.05)，提示瘦素刺激可显著提高软骨细胞内成骨活性。

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引言

脊柱侧弯是一种脊柱三维畸形，其影像学表现为脊柱冠状位Cobb角≥10°，可由先天发育或退行性病变等各种原因引起[1]。青少年特发性脊柱侧凸是脊柱侧弯中最常见类型之一[2]，与其他脊柱侧弯不同，它随着生长发育高峰的到来发生并显著进展，目前关于青少年特发性脊柱侧凸的研究日益增多，但青少年特发性脊柱侧凸畸形的发病机制仍不完全明确。目前关于青少年特发性脊柱侧凸的发病机制主要包括如下几种：基因相关学说、激素与代谢学说、生物力学学说、骨髓间充质干细胞学说、神经学说和环境学说等。临床研究发现青少年特发性脊柱侧凸畸形进展速度与青春期骨骼生长发育速度呈正相关[3]，且人体测量学研究结果显示该类患者的矫正身高及臂展均明显长于正常同龄青少年[4]，由于矫正身高与臂展主要由长骨生长决定，因此该类患者软骨内成骨活性异常是目前研究其病因与病理机制的重点。
瘦素是由ob基因编码且可调控软骨内成骨活性的蛋白质激素，主要由脂肪细胞分泌进入血液，随后穿过血脑屏障作用于下丘脑，发挥调控机体代谢等多种功能[5]。根据文献报道，青少年特发性脊柱侧凸畸形患者体质量指数显著低于同龄正常人[6-7]，提示青少年特发性脊柱侧凸畸形患者体内可能存在高瘦素活性。QIU等[8]的研究从正面验证了这一猜想，他们发现青少年特发性脊柱侧凸畸形患者外周瘦素浓度明显低于同龄对照者，提示青少年特发性脊柱侧凸畸形患者可能处于中枢高瘦素活性状态，从而抑制了外周瘦素的分泌，直接导致了软骨内成骨活性增高，致使青少年特发性脊柱侧凸畸形的发生发展。近年来大量研究表明，瘦素是青少年特发性脊柱侧凸畸形进展的关键因素[9-10]。
细胞转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)是细胞信号转导抑制因子家族的一员，可参与调节多种生理病理过程[11]，是调节细胞内瘦素信号通路的重要信号因子[12]。一项基因研究发现，青少年特发性脊柱侧凸畸形患者SOCS3基因存在明显多态性分布异常，其中严重侧凸患者SOCS3表达量著降低[13]，提示SOCS3基因与青少年特发性脊柱侧凸畸形发病存在着密切关系。既往研究通过敲除SOCS3基因或抑制SOCS3基因表达的方式干预小鼠对高卡路里饮食的反应，发现其肥胖率较对照组明显下降，提示SOCS3在瘦素信号传导通路中起到负性调控瘦素受体敏感性的作用[14-16]。目前认为，SOCS3在瘦素细胞内信号传导通路中通过负向调节瘦素受体敏感性而发挥瘦素抵抗的重要作用。因此，作者首次提出假说：瘦素通过增强软骨细胞的成骨活性促进青少年特发性脊柱侧凸畸形的发生发展，SOCS3通过瘦素抵抗减轻瘦素对软骨细胞内成骨活性的影响，从而减轻青少年特发性脊柱侧凸畸形。实验通过瘦素刺激软骨细胞及通过质粒转染升高或降低SOCS3表达，通过MTT法检测软骨细胞抑制率来反映软骨细胞内成骨活性，从而验证上述假说。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，组间比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2021年5月在南京医科大学免疫学系实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人棘突软骨细胞购买自凯基生物。
1.3.2 主要试剂及仪器 TRIzol(货号15596-026)、Lipofectamine 3000(L3000015)购自美国Invitrogen公司；重组人瘦素(货号AB9827)购自英国Abcam公司；氯仿、异丙醇购自中国南京化学试剂有限公司；文中涉及的质粒及siRNA购自江苏凯基生物；cDNA合成试剂盒(RR036B)、SYBR Green(RR086B)购自日本TaKaRa公司；Ⅱ型胶原抗体(货号28459-1-AP)购自Proteintech公司；MTT(货号0793)购自美国Amersco公司；DMSO(货号D2650)购自美国SIGMA公司；6孔板、96孔板购自美国Corning Incorporated公司；生物引物由南京金斯瑞公司合成；台式恒温振荡器(型号THZ-312，中国)购自上海精宏实验设备有限公司；电热扶风干燥箱(101AS-3，中国)购自上海圣欣科学仪器有限公司；倒置显微镜(IX51，日本)购自OLYMPUS公司；酶标仪(ELx800，美国)购自BioTek公司。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞的培养以0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化软骨细胞30 min，随后用0.2%Ⅱ型胶原酶消化5 h。收集消化后的软骨细胞，细胞计数板计数后接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3 d换液一次。待细胞接近融合时0.25%胰蛋白酶-EDTA消化2 min，计数后按1∶3传代。
1.4.2 瘦素对软骨细胞成骨活性的影响将软骨细胞接种于96孔细胞培养板中，接种密度2×104/孔，分别以含0(对照组)，100 µg/L瘦素的DMEM培养基培养，24 h后免疫组化染色观察Ⅱ型胶原表达。
免疫组化染色：40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，PBS浸洗3次，每次3 min。用通透剂通透10 min，PBS浸洗3次，每次3 min。每张切片滴加2滴体积分数3%H2O2溶液，室温孵育10 min，PBS浸洗3次，每次3 min。体积分数10%山羊血清室温封闭1 h，PBS浸洗3次，每次5 min。滴加Ⅱ型胶原抗体(稀释比1∶2 000)，4 ℃湿盒过夜。第2天甩去一抗稀释液，PBS洗涤3次，每次5 min。滴加100 μL二抗(1∶500稀释)，室温孵育1 h。PBS洗涤3次，每次5 min。加入新鲜配置的DAB工作液50 μL。显微镜下观察染色深浅，染色完成后用蒸馏水洗涤。苏木精染核，1 min后蒸馏水洗涤。1%盐酸乙醇分化，温水反蓝。梯度(体积分数60%，80%，90%，100%)的乙醇脱水，每种浓度3 min；二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min。中性树脂封固，盖玻片固定后显微镜下观察。
1.4.3 瘦素预刺激及SOCS3过表达、低表达对软骨细胞的影响将软骨细胞接种于96孔细胞培养板中，接种密度2×104/孔，分9组培养，分别为空白对照组、转染pcDNA3.1-NC组、转染pcDNA3.1-SOCS3组、转染siRNA-NC组、转染siRNA-SOCS3组、瘦素+转染pcDNA3.1-NC组、瘦素+转染pcDNA3.1-SOCS3组、瘦素+转染siRNA-NC组、瘦素+转染siRNA-SOCS3组。空白对照组不进行任何处理。瘦素刺激各组首先以100 µg/L瘦素刺激24 h，然后进行细胞转染。
质粒转染：分别用250 μL不含血清的DMEM培养基稀释2 μg pcDNA3.1-NC质粒和pcDNA3.1-SOCS3质粒，轻轻混匀，室温孵育5 min；用250 μL不含血清DMEM培养基稀释5 μL Lipofectamine 3000，轻轻混匀并室温孵育5 min；将含质粒和含Lipofectamine 3000的DMEM培养基混匀，室温孵育20 min。当孔中细胞密度达到80%左右时，将质粒-Lipofectamine 3000混合液加入培养孔中，轻轻混匀。培养4-6 h 后，将孔中含质粒-Lipofectamine 3000混合液的培养基移去，更换为新鲜的DMEM培养基，将培养板置于37 ℃的CO2 培养箱中培养24 h，进行后续检测。
siRNA转染：分别用250 μL不含血清的DMEM培养基稀释2.5 μg siRNA-NC和siRNA-SOCS3，轻轻混匀，室温孵育5 min；用250 μL不含血清的DMEM培养基稀释5 μL Lipofectamine 3000，轻轻混匀并室温孵育5 min；将含siRNA和含Lipofectamine 3000的培养基混匀，室温孵育20 min。当孔中细胞密度达到80%左右时，将siRNA-Lipofectamine 3000混合液加入培养孔中，轻轻混匀。培养4-6 h 后，将孔中含siRNA-Lipofectamine 3000混合液的培养基移去，更换为新鲜的培养基，将培养板置于37 ℃的CO2 培养箱中培养24 h，进行后续检测。
实时荧光定量PCR检测SOCS3 mRNA表达量：吸去培养板中细胞培养基，用预冷过的PBS洗涤细胞，每孔加入1 mL Trizol提取细胞总RNA，反转录后加入SYBR Green后进行RT-PCR实验。扩增条件为：预变性95 ℃ 30 s→变性95 ℃ 5 s→退火60 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 10 min，共40个循环。以GAPDH为内参，计算2-∆∆Ct值，最后比较目的基因在细胞中的相对表达量。所用引物委托南京金斯瑞生物科技公司合成：人GAPDH上游引物5′- CAA ATT CCA TGG CAC CGT CA-3′，下游引物5′- AGC ATC GCC CCA CTT GAT TT-3′；SOCS3上游引物5′- GCT CCA AGA GCG AGT ACC AG-3′，下游引物5′- CTG TCG CGG ATC AGA AAG GT-3′。
MTT法检测细胞抑制率：每孔分别加入20 μL MTT溶液，于培养箱中继续孵育4 h，每孔加入DMSO 150 μL，振荡反应10 min使沉淀溶解，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度值。实验重复3次。
细胞抑制率＝1-实验组吸光度值/空白对照组吸光度值
1.5 主要观察指标瘦素对软骨细胞内成骨活性的影响，瘦素预刺激及SOCS3过表达、低表达对软骨细胞SOCS3 mRNA表达量与成骨活性的影响。
1.6 统计学分析运用SPSS 13.0软件包进行独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

青少年脊柱特发性侧凸畸形是一类好发于女性、于青春期发病、畸形发展较为迅速的脊柱三维畸形的总称[17]，目前青少年特发性脊柱侧凸畸形的发病机制尚不明确，因此无法对该病做到早期发现并阻断疾病的进展。目前临床上对青少年特发性脊柱侧凸畸形的治疗仍停留在脊柱畸形发生后的矫正治疗，给青少年患者带来了生理和心理上的巨大痛苦，给家庭和社会带来的巨大的经济负担，因此开展青少年特发性脊柱侧凸病因及发病机制的相关研究是目前从根本上解决该类疾病的重要途径，从而将青少年特发性脊柱侧凸畸形的治疗推进至早期风险筛查、中期进展阻断、晚期畸形矫正的综合治疗时代。目前关于青少年特发性脊柱侧凸畸形发病机制的研究非常广泛，主要包括遗传学、间充质干细胞、组织、脊柱生物力学、神经学、激素、生物化学、环境和生活方式等。据文献报道，青少年特发性脊柱侧凸畸形患者青春期骨骼生长发育速度与脊柱侧凸畸形进展速度呈正相关，同时该类患者的矫正升高及臂展明显高于同龄健康青少年，提示青少年特发性脊柱侧凸畸形患者存在较同龄健康青少年人群明显活跃的软骨内成骨过程。ZHU等[18]发现青少年特发性脊柱侧凸畸形患者脊柱椎体前柱软骨内成骨活性明显高于后柱膜性成骨活性，从而造成胸椎后凸消失，进一步支持了青少年特发性脊柱侧凸畸形患者软骨内成骨过程存在过度活跃状态。故而，目前一般认为软骨细胞内成骨活性异常是青少年特发性脊柱侧凸畸形发病的核心环节。
目前认为中枢高瘦素可能是青少年特发性脊柱侧凸畸形发病的重要病因。瘦素是一种蛋白质激素，可以从外周及中枢两个方面参与机体能量代谢、软骨活性[19]、成骨活性等重要功能的调控[20]，瘦素既可以通过对成骨细胞和软骨细胞的直接代谢作用影响骨骼，也可以通过下丘脑和交感神经系统、体质量变化及对其他激素(例如垂体)产生的影响间接影响骨骼[21]，瘦素在骨生理学中的作用取决于这些相互矛盾的影响的平衡。目前，已有关于多种疾病模型的研究表明瘦素与软骨细胞活性关系十分密切。在骨关节炎中，高剂量瘦素可通过多种通路加速软骨细胞衰老，而瘦素受体高表达则通过激活瘦素通路加速软骨细胞衰老[22-24]。在软骨损伤的研究中发现，瘦素以剂量依赖方式促进软骨细胞的增殖[25]。在椎间盘退变中，瘦素可以刺激椎间盘细胞和软骨细胞增殖[26]。在体外实验中，瘦素与甲状腺激素协同作用促进生长板软骨细胞增殖和终末分化[27]。有研究发现青少年特发性脊柱侧凸畸形患者瘦素受体水平较对照组减低，从而导致软骨细胞活性降低[28]。以上研究表明，瘦素可增强软骨细胞活性、促进软骨细胞增殖。此次实验结果同样显示瘦素可以增强软骨细胞内成骨活性，与既往研究结果一致，进一步验证了瘦素对软骨细胞活性的促进作用。
瘦素对软骨内成骨活性的调控机制如下：瘦素在跨膜受体帮助下通过血脑屏障与下丘脑区域瘦素受体结合，激活体内下丘脑-甲状腺-交感神经通路，促进去甲肾上腺素、胰岛素样生长因子及甲状腺素等激素的分泌，增强生长板软骨细胞增殖分化活性[29]；此外，瘦素可以直接作用于外周生长板软骨细胞表面受体，促进细胞的增殖分化活性[30]。根据BURWELL等[31]的研究，中枢高瘦素活性和外周低瘦素水平两方面促进了青少年特发性脊柱侧凸畸形的发生发展。瘦素由外周脂肪组织分泌后通过血脑屏障进入中枢，作用于下丘脑区域的瘦素受体，激活下丘脑-甲状腺-交感神经通路负向调控脂肪细胞的数量和功能，从而减少瘦素的分泌，维持体内瘦素的相对稳态[32]。目前研究认为瘦素通过血脑屏障转运是一个单向主动运输过程，当外周瘦素水平较低时瘦素转运效率会相对提高[33]，但外周低瘦素水平仍会导致中枢低瘦素活性，但为什么青少年特发性脊柱侧凸畸形患者会出现中枢高瘦素活性与外周低瘦素水平同时存在呢？根据LIU等[34]的研究，青少年特发性脊柱侧凸畸形患者具有较高的瘦素受体水平，即青少年特发性脊柱侧凸畸形患者对瘦素有较高的生物利用度，从而导致外周瘦素低水平时仍能保持中枢高瘦素活性。作者猜测另一个可能的原因是青少年特发性脊柱侧凸畸形患者对瘦素的敏感性增高。早在1998年SOCS3就被鉴定为瘦素抵抗的可能介质[35]，在此基础上MORI等[12]进一步通过敲除SOCS3基因反向证明了SOCS3可以降低瘦素敏感性，从而导致瘦素抵抗的发生；随后又有大量研究证实了SOCS3在瘦素抵抗中的作用[36-38]。该调控机制主要是：当瘦素水平升高过度激活瘦素受体引起机体高瘦素状态时，JAK/STAT 通路中的STAT3及STAT5大量被磷酸化激活，发挥其促进代谢增加能量消耗的作用；与此同时，上述两活性因子亦进入细胞核内促使SOCS3基因转录翻译，使SOCS3表达量明显上调，而SOCS3可以与瘦素受体结合抑制其功能，从而降低瘦素受体敏感性，使机体进入瘦素抵抗状态。此次实验结果表明，SOCS3表达上调可通过瘦素抵抗来减轻瘦素对软骨细胞内成骨活性的促进作用，与既往研究结果相一致，进一步验证了SOCS3在瘦素抵抗中的作用。
MTT法检测软骨细胞抑制率的结果显示，瘦素刺激后软骨细胞的抑制率降低，表明瘦素刺激可以提高软骨细胞内成骨活性；而在加或不加瘦素刺激的情况下，SOCS3表达上调均可使软骨细胞抑制率降低，SOCS3表达下调均可使软骨细胞抑制率升高，表明SOCS3可降低软骨细胞内成骨活性。揭示了中枢高瘦素活性与外周低瘦素水平在青少年特发性脊柱侧凸畸形患者中同时存在的原因，一方面，青少年特发性脊柱侧凸畸形患者瘦素受体过表达使机体处于高瘦素活性状态，从中枢与外周两个层面促使软骨内成骨活性明显升高，导致脊柱侧凸畸形的发生；另一方面，该类患者SOCS3表达下调，避免了机体细胞内瘦素抵抗状态形成，使瘦素高活性状态得以维持，促使脊柱畸形进一步持续进展。
虽然实验证实了瘦素通过提高软骨细胞内成骨活性而促进青少年特发性脊柱侧凸畸形的发生发展，SOCS33通过瘦素抵抗机制减轻瘦素对软骨细胞内成骨活性的影响，从而减轻青少年特发性脊柱侧凸畸形这一猜想，但仍存在缺陷：只是在细胞层面研究了瘦素及SOCS3对软骨细胞成骨活性的影响，未能在动物水平通过瘦素刺激或敲除SOCS3基因来研究软骨细胞的成骨活性及青少年特发性脊柱侧凸畸形的发病率、青少年特发性脊柱侧凸畸形的严重程度。因此，课题组还将在今后的工作中针对上述问题进行探讨，进一步探究中枢高瘦素水平在脊柱侧凸发生发展过程所产生的作用及机制。
研究结果显示，瘦素通过增强软骨细胞成骨活性促进青少年特发性脊柱侧凸畸形的发生发展，SOCS3通过瘦素抵抗机制抑制青少年特发性脊柱侧凸畸形的发生发展。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

细胞信号转导抑制因子3影响青少年特发性脊柱侧凸畸形软骨内的成骨活性

Effects of suppressor of cytokine signaling 3 on osteogenic activity in the cartilage of adolescent idiopathic scoliosis

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