敲减ATR基因对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响

doi:10.12307/2022.375

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (19): 2985-2990.doi: 10.12307/2022.375

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

敲减ATR基因对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响

唐蜜，秦臻，韦正新，倪鸣，柴小康

贵州医科大学基础医学院，贵州省贵阳市 550025

收稿日期:2021-06-26 修回日期:2021-08-09 接受日期:2021-08-30 出版日期:2022-07-08 发布日期:2021-12-28
通讯作者: 秦臻，博士，副教授，硕士生导师，贵州医科大学基础医学院，贵州省贵阳市 550025
作者简介:唐蜜，女，1993年生，四川省广安市人，汉族，贵州医科大学基础医学院在读硕士，主要从事心血管药理学与干细胞相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81403445)，项目负责人：秦臻

Effect of ATR gene knockdown on senescence and function of rat bone marrow endothelial progenitor cells

Tang Mi, Qin Zhen,Wei Zhengxin, Ni Ming, Chai Xiaokang

School of Basic Medical Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China

Received:2021-06-26 Revised:2021-08-09 Accepted:2021-08-30 Online:2022-07-08 Published:2021-12-28
Contact: Qin Zhen, MD, Associate professor, Master’s supervisor, School of Basic Medical Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
About author:Tang Mi, Master candidate, School of Basic Medical Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81403445 (to QZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
内皮祖细胞：是一类能够增殖分化为内皮细胞的多潜能干细胞，主要分布于骨髓，参与修复损伤血管及血管新生，可摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白，体外培养贴壁呈梭形，可分化增生为成熟内皮细胞，形成管腔样结构。
ATR基因：因其和ATM及酵母Rad3基因有着较高同源性，被命名为ATR，作为DNA损伤检测点的主要成员，ATR属于PIKK家族，可独立激活DNA损伤通路，参与单链DNA损伤，导致细胞周期阻滞。

背景：内皮祖细胞在血管内皮更新及修复中发挥重要作用，利用体外扩增的自体内皮祖细胞移植促进缺血部位血管新生，现已成为防治缺血性心血管疾病的新策略，但取自老年机体的内皮祖细胞在体外扩增中会出现细胞衰老迹象，难以发挥修复能力，研究表明DNA损伤与细胞衰老关系密切，DNA损伤检测点是调控DNA损伤的重要关卡。
目的：通过慢病毒RNA干扰技术敲减大鼠骨髓内皮祖细胞中的ATR基因，探讨其在内皮祖细胞衰老进程中的作用。
方法：将大鼠骨髓源内皮祖细胞进行分离、培养并鉴定，将分离出的内皮祖细胞继续培养至第3代，随机分为3组：未转染组(空白组)、阴性对照组、基因敲减组(ATR-RNAi组)。未转染组正常培养，阴性对照组、基因敲减组分别予以慢病毒RNAi及慢病毒ATR-RNAi稳定转染至第3，6天，通过qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中ATR mRNA和蛋白表达水平，β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞的衰老情况，MTT比色法检测各组细胞的增殖能力，Transwell实验和体外血管生成试剂盒分别检测各组细胞迁移能力及成血管功能，流式细胞术检测各组细胞周期变化。
结果与结论：①与未转染组比较，ATR-RNAi 组内皮祖细胞表达ATR mRNA和蛋白水平明显降低(P < 0.01)，表明ATR基因表达被有效敲减；②与未转染组比较，ATR-RNAi组蓝染细胞数量减少，表明衰老程度明显减轻(P < 0.01)；③与未转染组相比，ATR-RNAi组细胞增殖、迁移和成血管功能明显增强(P < 0.05)；④与未转染组比较，ATR-RNAi 组处于G1、G2期的细胞百分率明显减少，S期细胞百分率显著增多(P < 0.05)；⑤结果表明，敲减ATR基因表达可以延缓内皮祖细胞的衰老进程，同时增强内皮祖细胞的功能，减轻细胞周期的停滞。

https://orcid.org/0000-0001-9419-013X (秦臻)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 内皮祖细胞, 骨髓, ATM与Rad相关蛋白激酶, 慢病毒转染, 细胞衰老, 细胞功能, 细胞周期

Abstract: BACKGROUND: Endothelial progenitor cells play an important role in vascular endothelial renewal and repair. The transplantation of autologous endothelial progenitor cells expanded and cultured in vitro to promote angiogenesis in ischemic sites has become a new strategy for the prevention and treatment of ischemic cardiovascular diseases. However, the endothelial progenitor cells derived from the elderly body will show signs of cellular senescence when expanded in vitro. The ability of aging endothelial progenitor cells to repair vascular endothelium is difficult to exert. Studies have shown that DNA damage is closely related to cell aging, and DNA damage detection points are an important checkpoint for regulating DNA damage.
OBJECTIVE: Lentiviral RNA interference technology was used to knockdown ATM and Rad3-related kinase (ATR) gene in rat bone marrow endothelial progenitor cells, and to explore its role in the aging process of endothelial progenitor cells.
METHODS: Endothelial progenitor cells from bone marrow in rats were isolated, cultured and identified. After the isolated endothelial progenitor cells were cultured to the third generation, they were counted and randomly divided into three groups: non-infection control group (blank group), negative control group, and gene knockdown group (ATR-RNAi group). The non-infection control group was cultured normally, and the negative control group and gene knockdown group were stably transfected with lentiviral RNAi and lentiviral ATR-RNAi to day 3 and day 6, respectively. The level of ATR mRNA in each group of cells was detected by qRT-PCR. The protein expression of ATR in each group of cells was detected by western blotting. The senescence of each group of cells was detected by β-galactosidase staining. MTT colorimetric method was used to detect cell proliferation activity in each group. Transwell chamber and in vitro angiogenesis kit were used to detect cell migration ability and tubule formation of each group. Flow cytometry was applied to detect the cell cycle change in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the non-infection control group, the expression levels of ATR mRNA and ATR protein in the endothelial progenitor cells in ATR-RNAi group were decreased significantly (P < 0.01), indicating that ATR gene expression was effectively reduced. (2) Compared with the non-infection control group, the number of blue-stained cells in the ATR-RNAi group decreased, indicating that the degree of aging was significantly reduced (P < 0.01). (3) Compared with the non-infection control group, cell proliferation, migration and tubule formation in the ATR-RNAi group were significantly enhanced (P < 0.05). (4) Compared with the non-infection control group, the percentages of cells in the G1 and G2 phases in the ATR-RNAi group were decreased significantly, and the percentage of cells in the S phase was increased significantly (P < 0.05). (5) These results indicate that knockdown of the expression of ATR genes could delay the aging process of endothelial progenitor cells, promotes the function of endothelial progenitor cells, and reduces the stagnation of cell cycles.

Key words: endothelial progenitor cells, bone marrow, ATM and Rad3-related kinase, lentiviral transfection, cell senescence, functional activity, cell cycle

中图分类号:

唐蜜, 秦臻, 韦正新, 倪鸣, 柴小康. 敲减ATR基因对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 2985-2990.

Tang Mi, Qin Zhen, Wei Zhengxin, Ni Ming, Chai Xiaokang. Effect of ATR gene knockdown on senescence and function of rat bone marrow endothelial progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(19): 2985-2990.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠骨髓源内皮祖细胞的生长特性及鉴定结果提取的大鼠骨髓源单个核细胞在分离之初时呈小圆形，在培养液中呈悬浮状态，3 d后细胞大量贴壁，培养5 d后贴壁细胞逐渐增多变大，开始出现伪足样突起，呈长梭形首尾相连形成条索样，培养7 d后呈纺锤形、铺路石状，培养14 d后可见长梭形细胞大量增殖融合，或呈网状结构，见图1A；传代培养至第2代时，细胞经FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL处理后，通过荧光显微镜观察内皮祖细胞摄取Dil-ac-LDL呈红色，结合FITC-UEA-1呈绿色，双染色阳性细胞呈橙黄色，为正在分化的内皮祖细胞，见图1B。

2.2 慢病毒在内皮祖细胞中的转染效率慢病毒转染至第3，6天，阴性对照组和ATR-RNAi 组发出绿色荧光的细胞约占观察视野下细胞总数的80%以上，且细胞状态良好，表明转染效率稳定，可进行进一步实验，见图2。

2.3 慢病毒转染后细胞ATR mRNA和蛋白的表达 qRT-PCR与Western blot结果显示，与未转染组比较，ATR-RNAi 组ATR mRNA及蛋白的表达水平显著降低(P < 0.01)，阴性对照组无明显变化；与第3天比较，第6天未转染组和阴性对照组的ATR蛋白表达显著上调(P < 0.01)，ATR mRNA表达则无明显变化，见图3。

2.4 内皮祖细胞衰老程度的变化 β-半乳糖苷酶染色结果显示，与未转染组比较，ATR-RNAi 组的细胞染色阳性率显著降低(P < 0.01)，阴性对照组无明显变化；与转染第3天的各组细胞比较，转染第6天的各组细胞染色阳性率均有显著升高(P < 0.01)，提示敲减ATR基因可延缓内皮祖细胞衰老，见图4。

2.5 内皮祖细胞功能的变化 MTT、Transwell和成血管实验结果显示，在慢病毒转染第3天和第6天对应时间点里，与未转染组比较，ATR-RNAi 组内皮祖细胞的增殖能力有所增强，迁移细胞数量增多，培养4 h后镜下可见内皮祖细胞的小管样结构也明显增多(P < 0.05)，阴性对照组无明显变化；与转染第3天比较，各组细胞在转染第6天时其增殖、迁移和成血管功能均有所降低(P < 0.05)，提示敲减ATR基因可增强内皮祖细胞的功能，见图5。

2.6 内皮祖细胞周期的变化流式细胞术检测结果表明，与未转染组比较，ATR-RNAi 组在第3天其G1期细胞百分率显著降低(P < 0.05)，第6天G2期细胞百分率显著降低(P < 0.05)，同时其S期的细胞百分率显著增加(P < 0.05)，阴性对照组则无显著变化。与第3天比较，未转染组与阴性对照组在第6天时处于G2期的细胞百分率显著升高(P < 0.01)，处于S期的细胞百分率显著降低(P < 0.05)，ATR-RNAi 组则无显著变化，见图6。

参考文献

[1] XIA WH, LI J, SU C, et al. Physical exercise attenuates age-associated reduction in endothelium-reparative capacity of endothelial progenitor cells by increasing CXCR4/JAK-2 signaling in healthy men. Aging Cell. 2012;11(1):111-119.
[2] ASAHARA T, MUROHARA T, SULLIVAN A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275(5302): 964-967.
[3] CHILLÀ A, MARGHERI F, BIAGIONI A, et al. Mature and progenitor endothelial cells perform angiogenesis also under protease inhibition: the amoeboid angiogenesis. J Exp Clin Cancer Res. 2018;37(1):74.
[4] XUE C, HUANG Q, ZHANG T, et al. Matrix stiffness regulates arteriovenous differentiation of endothelial progenitor cells during vasculogenesis in nude mice. Cell Prolif. 2019;52(2):e12557.
[5] HU Z, WANG H, FAN G, et al. Danhong injection mobilizes endothelial progenitor cells to repair vascular endothelium injury via upregulating the expression of Akt, eNOS and MMP-9. Phytomedicine. 2019;61: 152850.
[6] FANG J, GUO Y, TAN S, et al. Autologous Endothelial Progenitor Cells Transplantation for Acute Ischemic Stroke: A 4-Year Follow-Up Study. Stem Cells Transl Med. 2019;8(1):14-21.
[7] 秦臻,韦正新,宰青青,等.黄精降低活性氧水平促进衰老内皮祖细胞功能的研究[J].中国药理学通报,2019,35(1):123-127.
[8] 朱光旭,黄岚,武晓静,等.不同年龄段大鼠血清影响内皮祖细胞向成熟内皮诱导分化[J].中国动脉硬化杂志,2007,15(9): 647-652.
[9] OU HL, SCHUMACHER B. DNA damage responses and p53 in the aging process. Blood. 2018;131(5):488-495.
[10] 秦臻,韦正新,许键炜.黄精对衰老大鼠内皮祖细胞 DNA 损伤检测点ATM/ATR 通路的影响[J].中药新药与临床药理,2019,30(5):529-534.
[11] NGANGUEM NZALLE YRANNEY BRICE,林慕之,毛善永,等.大鼠骨髓源内皮祖细胞的分离与鉴定[J].贵州医科大学学报,2020,45(3): 265-269.
[12] 李丽玲,计晓娟,余更生,等.1种新来源的内皮祖细胞提取分离方法[J].免疫学杂志,2019,35(3):269-276.
[13] 罗伟,李翔翮,杨先腾,等.小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定[J].中华创伤骨科杂志,2018,20(6):523-528.
[14] 秦臻,黄水清.当归补血汤含药血清对内皮祖细胞功能及其 PI3K/Akt 通路影响的研究[J].中国药理学通报,2013,29(9):1320-1323.
[15] 胡洁,陈庆伟,贺无恙.增龄与动脉粥样硬化性心血管疾病临床类型的相关性分析[J].临床心血管病杂志,2018,34(11):1081-1085.
[16] 饶璇,李元建.内皮细胞损伤与修复的研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2017,25(5):531-535.
[17] FAZEL S, CIMINI M, CHEN L, et al. Cardioprotective c-kit+ cells are from the bone marrow and regulate the myocardial balance of angiogenic cytokines. J Clin Invest. 2006;116(7):1865-1877.
[18] QIAO J, QI K, CHU P, et al. Infusion of endothelial progenitor cells ameliorates liver injury in mice after haematopoietic stem cell transplantation. Liver Int. 2015;35(12):2611-2620.
[19] 宰青青,秦臻,叶兰.黄精对自然衰老大鼠内皮祖细胞功能及端粒酶活性的影响[J].中国中西医结合杂志,2016,36(12):1480-1485.
[20] NAKAMURA AJ, CHIANG YJ, HATHCOCK KS, et al. Both telomeric and non-telomeric DNA damage are determinants of mammalian cellular senescence. Epigenetics Chromatin. 2008;1(1):6.
[21] 李文瑞,刘新光,周中军. DNA 损伤与细胞衰老关系的研究进展[J].国际检验医学杂志,2010,31(6):576-578.
[22] MAYNARD S, FANG EF, SCHEIBYE-KNUDSEN M, et al. DNA Damage, DNA Repair, Aging, and Neurodegeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015;5(10):a025130.
[23] MARÉCHAL A, ZOU L. DNA damage sensing by the ATM and ATR kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(9):a012716.
[24] 乔田奎,陈伟,袁素娟.ATM 蛋白激酶依赖性信号转导通路研究进展[J].复旦学报(医学版),2012,39(4):433-437.
[25] FALCK J, COATES J, JACKSON SP. Conserved modes of recruitment of ATM, ATR and DNA-PKcs to sites of DNA damage. Nature. 2005; 434(7033):605-611.
[26] SANCAR A, LINDSEY-BOLTZ LA, UNSAL-KAÇMAZ K, et al. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu Rev Biochem. 2004;73:39-85.
[27] REAPER PM, GRIFFITHS MR, LONG JM, et al. Selective killing of ATM- or p53-deficient cancer cells through inhibition of ATR. Nat Chem Biol. 2011;7(7):428-430.

引言

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类能够进行自我更新，具有游走特性并能增殖分化为内皮细胞的定向干细胞[1]。ASAHARA等[2]通过免疫磁珠细胞分选法于1997年首次从人外周血成功分离培养出内皮祖细胞后，越来越多的研究表明，内皮祖细胞在骨髓中占比丰富，且增殖活力强[3-5]；在缺血、缺氧、炎症等病理或生理性因素影响下，内皮祖细胞可通过血液循环定向迁移至受损血管与缺血组织，从而对血管内膜进行修复。随着对内皮祖细胞研究的不断深入，利用体外扩增培养的自体内皮祖细胞移植修复损伤内皮已成为防治缺血性心血管疾病的新策略之一[6]，自体细胞移植可有效避免免疫排斥反应，也不存在伦理学方面的争议。然而，缺血性心血管疾病多发于中老年人群，取自中老年机体的内皮祖细胞在体外扩增培养会很快出现增殖缓慢或停滞、分化功能减退等衰老迹象[7]。衰老的内皮祖细胞数量和功能上明显不如正常的细胞，同时老化内皮祖细胞的修复能力也很难发挥。研究表明，DNA损伤与细胞衰老关系密切，其中ATM与Rad相关蛋白激酶(ATM and Rad3-related kinase，ATR)依赖的DNA损伤检测点是调控DNA损伤的重要关卡之一[8-9]。前期研究观察到衰老大鼠骨髓源内皮祖细胞在体外培养过程中ATR表达逐渐增高，而抗衰老中药黄精可通过下调ATR表达来延缓内皮祖细胞的衰老[10]，但ATR对内皮祖细胞衰老的影响尚不明确，为此，该研究首先分离培养衰老大鼠骨髓中内皮祖细胞并进行鉴定，再利用慢病毒RNA干扰细胞中ATR基因的表达，进一步探讨ATR基因在内皮祖细胞衰老进程中的作用，以期为临床内皮祖细胞移植提供一些新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2019年12月至2020年12月在贵州医科大学基础医学院药理学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SD大鼠20只，20月龄，健康SPF级，雌雄各半，体质量500-560 g；北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700111130。环境：湿度控制在50%-70%，温度20-26 ℃，喂养灭菌饮用水和标准鼠饲料。
1.3.2 实验试剂与仪器 M199培养基(批号：2177684)购自Gibco公司；胎牛血清(批号：2139378CP)购自Gibco公司；大鼠骨髓淋巴细胞分离液试剂盒(批号：TBD2013LR)购自天津灏洋生物科技有限公司；碱性成纤维细胞生长因子(批号：1210432-1)、血管内皮生长因子(批号：1107436)购自PeproTech公司；FITC 标记的荆豆凝集素1(FITC-UEA-1，批号：055M4077V)购自美国Sigma 公司； Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil- ac-LDL，批号：YB-0013)购自广州奕源生物科技有限公司；慢病毒及转染试剂购自Santa Cruze公司；荧光定量PCR试剂盒购自Servicebio公司；ATR抗体(批号：13934S)购自美国CST公司；β-半糖苷酶染色试剂盒购自碧云天公司；Transwell小室(批号：07417006)购自Corning公司；多聚甲醛溶液(批号：1116A20)购自LEAGENE公司；体外血管生成试剂盒购自Millipore公司；细胞周期检测试剂盒购自碧云天公司。实时荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司；高速离心机购自美国Thermo Fisher公司；IX71荧光显微镜购自日本Olympus公司；TS100倒置显微镜购自日本Nikon公司；流式细胞仪购自美国BD公司；酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；CO2培养箱购自美国Thermo Fisher公司。
1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓源内皮祖细胞的培养及鉴定[11-13] 采用脱颈法处死大鼠，在无菌环境下解剖取出双侧胫骨、股骨，浸泡于体积分数为75%乙醇中消毒，用注射器吸取PBS冲洗髓腔，并运用200目细胞筛将悬液进行过滤，采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，收集细胞后再用PBS进行清洗，获得的细胞团块用含10 mg/L血管内皮生长因子、10 mg/L碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为20%胎牛血清的M199全培养液进行重悬，然后将其接种于T25细胞培养瓶中，于第4天进行换液，之后每3 d换液1次，并继续培养至第2代，将细胞用FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL共同孵育，最后用双染色法进行鉴定，荧光显微镜下拍照。

1.4.2 细胞分组及转染将培养至第3代的内皮祖细胞计数后继续培养24 h，将其随机分为3组：未转染组(空白组)、阴性对照组、基因敲减组(ATR-RNAi 组)。阴性对照组和ATR-RNAi组分别予以慢病毒RNAi及慢病毒ATR-RNAi稳定转染，筛选合适的感染复数感染细胞，加入终质量浓度为5 mg/L的 Polybrene，于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱孵育24 h后吸去含病毒的培养液，重新加入M199全培养基，继续培养至第3，6天；通过荧光显微镜观察慢病毒载体中的绿色荧光蛋白，根据细胞中绿色荧光蛋白的表达情况以判定转染效率，转染效率=荧光阳性细胞数/筛选细胞总数×100%。
1.5 主要观察指标
1.5.1 运用qRT-PCR法检测各组细胞中ATR mRNA的表达收集转染至第3，6天的各组内皮祖细胞，采用Trizol法提取各组细胞总RNA，依据反转录说明书合成单链cDNA，并以cDNA为模版，参照PCR试剂盒说明书进行扩增，以β-actin(150 bp)为内参，上游引物序列为：5’-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC -3’，下游引物序列：5’-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’，ATR (163 bp)的上游引物序列为：5’ -AAC CTG TTT ACT TAA ATG TGC TGC-3’ ，下游引物序列：5’-CTG ACC TGT AAC GCC GAC TC-3’，采用 2 - ΔΔCt 法计算各组细胞中ATR mRNA表达水平。
1.5.2 Western blot法检测各组内皮祖细胞中ATR蛋白表达水平将转染至第3，6天的各组内皮祖细胞从培养箱拿出放于冰盒上，弃去原培养液，PBS预冷，清洗2次，吸净PBS，加入RIPA裂解液，细胞刮刮取细胞，离心，提取细胞总蛋白。根据BCA蛋白定量检测试剂盒说明检测总蛋白浓度，然后按比例将蛋白样品与上样缓冲液混匀；将蛋白样品热变性后加入事先制好的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，然后用PVDF膜进行转移；使用Quick Western封闭液将膜封闭15 min；用TBST液清洗PVDF膜，每次10 min，共3次，加入特异性的一抗(ATR抗体、β-actin抗体)，4 ℃环境慢摇过夜；次日用TBST液洗3次，每次10 min，加入二抗，室温下孵育2 h；TBST液洗3次，用化学显影液进行曝光，得到目的条带显影；通过ImageJ软件对各个条带的灰度值进行比对分析。
1.5.3 β-半乳糖苷酶染色检测各组内皮祖细胞的衰老情况依据衰老相关半乳糖苷酶染色试剂盒的说明进行操作，首先从培养箱取出转染至第3，6天的各组内皮祖细胞，弃去原培养基，PBS清洗3次，加入1 mL半乳糖苷酶染色固定液，常温下放置15 min，弃去固定液，PBS清洗3次，加入事先预热的1 mL染色工作液，以防液体蒸发，孔板用封口膜封住，放于无CO2培养箱37 ℃环境中孵育过夜，次日弃去染色工作液，PBS清洗，在倒置显微镜下观察，随机选取5个视野(×100)拍照，衰老细胞的胞质着色，最后计算出衰老细胞所占的百分比。
1.5.4 MTT比色法检测各组内皮祖细胞的增殖能力将转染至第3，6天的各组内皮祖细胞接种于96孔板中(2×103个/孔)，37 ℃培养箱中贴壁培养24 h，每孔中加入5 g/L MTT溶液 15 μL，再于培养箱继续孵育4 h；拿出孔板弃去上清，加入二甲基亚砜，摇床轻摇10 min，置酶标仪在570 nm波长处检测吸光度值。
1.5.5 Transwell实验检测各组内皮祖细胞迁移能力转染至第3，6天的各组内皮祖细胞用胰酶消化后，重悬计数，每孔200 μL细胞悬液(1×108 L-1)加入Transwell的上室，在下室中加入600 μL含50 mg/L血管内皮生长因子的M199培养基，于培养箱中培养24 h，弃去小室中的培养基，使用多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2次，放于滤纸上风干，在小室中加入结晶紫染色20 min，PBS洗2次，于镜下随机选取5个视野(×100)，将迁移至小室外层的细胞进行计数，取其平均值。
1.5.6 成血管实验检测各组内皮祖细胞成管功能[14] 根据体外血管生成试剂盒说明书操作，ECM10×稀释液和ECMatfixTM 胶液同时置于4 ℃环境过夜融化，次日将100 μL ECM10×稀释液加入900 μL ECM-atfixTM胶液中，将二者混匀，以每孔50 μL快速加入96孔板中，勿产生气泡，将其放于37 ℃培养箱，1 h后基质胶凝固，将转染至第3，6天的各组内皮祖细胞计数后以150 μL(1×105个/孔)的量接种于胶上，37 ℃环境孵育4 h，于镜下随机取5个视野进行观察(×100)，将长度为宽度4倍以上的细胞进行计数，得出平均值。
1.5.7 流式细胞术检测细胞周期将转染至第3，6天的各组内皮祖细胞用胰酶消化后，以1×109 L-1的细胞浓度加入提前预冷的1 mL体积分数为70%乙醇中，二者混合后固定12 h，离心，用1 mL预冷的PBS进行重悬，再次离心，弃上清，余50 μL PBS，轻弹管底部以免细胞成团，再用碘化丙啶染色液0.5 mL在37 ℃环境中孵育30 min，注意避光，于激发波长488 nm处检测红色荧光，24 h内完成检测。
1.6 统计学分析相关数据用x±s表示，采用 SPSS 18.0统计软件进行分析，方差齐性条件下，采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用 LSD 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

血管内皮损伤会影响血管屏障功能、血管舒张反应的调节功能及分泌功能等，因此，维护血管内皮的完整性对防治心脑血管疾病具有重要意义[15-17]。由于成熟的内皮细胞其增殖能力较低，又属于终末分化细胞，替代损伤内皮能力有限，而内皮祖细胞则可通过旁分泌和自分泌一些细胞因子，促进血管再生、抑制内膜过度增生；研究发现移植体外培养的内皮祖细胞能够在缺血区聚集并参与心肌血管新生[18]，维持心脏、血管功能。近年来利用内皮祖细胞治疗缺血性心血管疾病已成为再生医学研究的热点之一，但是内皮祖细胞在体内数量较少，需通过体外扩增才能满足移植需求；同时由于缺血性疾病多在中老年人群高发，其内皮祖细胞在体外扩增时往往出现细胞复制时间延长、停滞等衰老迹象[19-20]，这极大限制了其临床应用，为此寻找干预内皮祖细胞衰老的分子靶点显得格外重要。
细胞衰老是指细胞的增殖能力丧失并且细胞周期永久停滞，从而进入相对稳定的一种状态。细胞衰老的类型主要包括复制性衰老以及应激引起的早熟性衰老，其中心环节都与细胞DNA损伤有关[21]，研究表明细胞衰老与线粒体DNA损伤、端粒DNA损伤、基因组不稳定以及衰老相关异染色质位点关系密切[22-23]。真核细胞具有一套高度保守的DNA修复机制，通过启动DNA损伤修复反应，可以引发细胞周期阻滞，赢得修复受损DNA的时间，以免受损的DNA信息传递下去，而细胞周期过度阻滞会引起细胞增殖不可逆地停滞从而最终导致细胞衰老[24]。细胞周期DNA损伤检测点是维持细胞基因组遗传信息稳定的重要机制，在DNA损伤修复中发挥着重要作用，其中ATR作为检测点的中心成员主要参与单链DNA损伤或复制叉停止的应答[25-26]。DNA损伤发生后，ATR募集到损伤位点并被激活，导致一系列级联反应，产生的最终效应包括DNA损伤修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡。然而当ATR发生突变或被异常激活时会导致细胞周期检测点失调，进而影响基因组的稳定性，使细胞周期过度阻滞而难以进入S期，从而促使细胞衰老。在作者前期的研究中也发现衰老大鼠内皮祖细胞在体外传代培养中ATR表达逐渐增高，而抗衰老中药黄精在延缓内皮祖细胞衰老的同时也下调了ATR的表达。
该研究通过慢病毒转染使内皮祖细胞中的ATR表达下调，转染第3，6天通过β-半乳糖苷酶染色、MTT法、Transwell实验、成血管实验、流式细胞术检测表明ATR基因在内皮祖细胞衰老中同样发挥了重要作用，敲减ATR基因能减轻细胞周期停滞，延缓内皮祖细胞的衰老，增强内皮祖细胞的功能，这提示延缓内皮祖细胞衰老可通过调控ATR基因来达成。同时，其他研究还表明ATR对于肿瘤细胞的存活也起重要作用[27]，肿瘤细胞更加依赖ATR分子通路调控细胞DNA损伤修复促进细胞存活，抑制ATR可诱导ATR通路依赖型恶性肿瘤细胞死亡，但对正常细胞繁殖和生长影响较小。因此，在抗衰老和抑制肿瘤方面，ATR是一个值得期待和关注的靶点。
该研究在干细胞衰老领域探讨了DNA损伤检测点ATR基因对内皮祖细胞衰老的干预作用，可为临床内皮祖细胞移植提供一些新思路，但由于实验的局限性，只进行了体外实验，并未通过体内实验进行验证，探索还未十分深入和广泛，尚待后续研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

敲减ATR基因对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响

Effect of ATR gene knockdown on senescence and function of rat bone marrow endothelial progenitor cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[2]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[3]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.
[4]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[5]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[6]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[7]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[8]	崔兴, 孙小琪, 郑伟, 马德欣. 黄芩汤调控自噬干预小鼠肠道急性移植物抗宿主病的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1057-1062.
[9]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.
[10]	冯建波, 李陈诚, 刘金月, 王小敏, 彭笳宸. 金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入建立创伤性大鼠骨髓炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 700-705.
[11]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[12]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[13]	关鸿, 张宏博, 邵焱, 郭栋, 张海严, 蔡道章. PDZ结构域蛋白1缺失促进骨关节炎软骨细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 182-189.
[14]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.
[15]	孙友强, 马超, 梁萌梦, 辛鹏飞, 张华, 向孝兵. 自噬在骨细胞中重要作用的最新研究进展：骨相关细胞活性和骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 276-282.