猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化

doi:10.12307/2022.319

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 1969-1973.doi: 10.12307/2022.319

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猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化

张露文，戴鹏秀，张翊华，陈奕静，王璟璐，李佳锴

西北农林科技大学，陕西省咸阳市 712100

收稿日期:2020-12-02 修回日期:2020-12-05 接受日期:2021-01-16 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-18
通讯作者: 张翊华，教授，西北农林科技大学，陕西省咸阳市 712100
作者简介:张露文，女，1996年生，四川省成都市人，2021年西北农林科技大学毕业，硕士，主要从事干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31872529)，项目负责人：张翊华；陕西省自然科学基础研究计划重点项目(2019JZ-16)，项目负责人：张翊华

SV40 large T gene induces immortalization of human bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Luwen, Dai Pengxiu, Zhang Yihua, Chen Yijing, Wang Jinglu, Li Jiakai

Northwest A&F University, Xianyang 712100, Shaanxi Province, China

Received:2020-12-02 Revised:2020-12-05 Accepted:2021-01-16 Online:2022-05-08 Published:2021-12-18
Contact: Zhang Yihua, Professor, Northwest A&F University, Xianyang 712100, Shaanxi Province, China
About author:Zhang Luwen, Master, Northwest A&F University, Xianyang 712100, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31872529 (to ZYH); the Key Project of Shaanxi Natural Science Basic Research Program, No. 2019JZ-16 (to ZYH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
猴空泡病毒40：SV40，是多瘤病毒科的一种小型环状病毒，其中猴空泡病毒40大T基因抗原可与多种蛋白结合以延长细胞周期以及促进与细胞永生相关基因的表达。
永生化：体外培养的细胞在一定的实验条件下从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程，不影响其核型与分化能力，为细胞的临床应用提供基础。

背景：细胞永生化是细胞获得持续增殖能力的一种特性，大T抗原基因可使细胞永生化效率提升，并广泛应用于实验中，越来越受到研究者的关注。
目的：建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株，为人骨髓间充质干细胞的临床应用奠定基础。
方法：使用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组质粒载体转染人骨髓间充质干细胞，连续传代培养，通过形态学、细胞增殖能力、细胞表面标记、多向分化潜能等方法进行鉴定。
结果与结论：①该方法构建的永生化细胞株为贴壁生长的梭形细胞，具有人骨髓间充质干细胞特异性表面标志；②转染后第50代人骨髓间充质干细胞仍然可表达猴空泡病毒40大T抗原基因；③永生化细胞株的增殖能力优于未转染人骨髓间充质干细胞；④永生化细胞株具有向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化的潜能；⑤由此可见，转染猴空泡病毒40大T抗原基因不影响人骨髓间充质干细胞的生物学特性和分化能力，该方法可以用于建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株。

https://orcid.org/0000-0002-7121-0975(张露文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人骨髓间充质干细胞, SV40大T抗原, 基因, 转染, 永生化, 鉴定

Abstract: BACKGROUND: Cell immortalization is a characteristic of cells acquiring the ability to continue to proliferate. The large T antigen gene can improve the efficiency of cell immortalization, and is widely used in experiments, attracting more and more attention from researchers.
OBJECTIVE: To establish an immortalized cell line of human bone marrow mesenchymal stem cells and lay the foundation for the clinical application of human bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The recombinant plasmid vector containing the SV40 large T antigen gene was used to transfect human bone marrow mesenchymal stem cells, which were successively subcultured and identified by methods, such as morphology, cell proliferation ability, cell surface markers, and multidirectional differentiation potential.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The immortalized cell line constructed by this method is an adherent growth of spindle cells with specific surface markers of human bone marrow mesenchymal stem cells. (2) The 50th generation of human bone marrow mesenchymal stem cells can still express SV40 large T antigen gene after transfection. (3) The proliferation ability of the immortalized cell line is better than that of untransfected human bone marrow mesenchymal stem cells. (4) The immortalized cell line has the potential to differentiate into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic cells. (5) This shows that transfection of the SV40 large T antigen gene does not affect the biological characteristics and differentiation ability of human bone marrow mesenchymal stem cells. This method can be used to establish immortalized human bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, human bone marrow mesenchymal stem cells, SV40 large T antigen, gene, transfection, immortalization, identification

中图分类号:

张露文, 戴鹏秀, 张翊华, 陈奕静, 王璟璐, 李佳锴. 猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 1969-1973.

Zhang Luwen, Dai Pengxiu, Zhang Yihua, Chen Yijing, Wang Jinglu, Li Jiakai. SV40 large T gene induces immortalization of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 1969-1973.

图/表（结果） 7

2.1 细胞形态学特征相差显微镜下观察，第40代转染组人骨髓间充质干细胞呈长梭状，少数为多角形，贴壁生长，活力较高，但第8代未转染组人骨髓间充质干细胞形态明显发生变化，生长缓慢，见图1。转染猴空泡病毒40大T抗原基因不影响人骨髓间充质干细胞的形态，且提高了细胞活力。

2.2 细胞生长曲线转染组第40代人骨髓间充质干细胞和未转染组第8代人骨髓间充质干细胞的生长曲线，见图2，其中转染组的细胞潜伏期有所缩短，对数增长期增殖更快，平台期细胞数量增多，说明相比于未转染组，转染组的增殖能力更强。

2.3 qRT-PCR检测人骨髓间充质干细胞中猴空泡病毒40大T抗原基因的表达转染组第50代人骨髓间充质干细胞的猴空泡病毒40大T抗原基因表达显著高于未转染组第4代人骨髓间充质干细胞(P < 0.01)，见图3。

2.4 Western blot检测人骨髓间充质干细胞中猴空泡病毒40的表达未转染第4代人骨髓间充质干细胞未检测到猴空泡病毒40的表达，转染组第50代人骨髓间充质干细胞检测到猴空泡病毒40的表达，见图4。

2.5 永生化人骨髓间充质干细胞表面标记的表达通过流式细胞仪测定相关细胞表面标记分子，CD166(96.4%)、CD44(95.2%)、CD90(89.8%)、CD29(92.5%)和CD105(87.5%)呈阳性，见图5；CD14(0.7%)、CD34(0.7%)和CD11(0.6%)呈阴性，见图6。

2.6 永生化人骨髓间充质干细胞株的分化潜能转染组第50代人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化14 d后，细胞形成结节甚至团块状，茜素红染色阳性，具有分化成骨的潜能，见图7A。转染组第50代人骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化14 d后，阿利新蓝染色阳性，证明具有分化成软骨的潜能，见图7B。转染组第50代人骨髓间充质干细胞成脂肪诱导分化3周后，细胞胞浆内出现脂肪小滴，油红O染色阳性，具有分化为脂肪的潜能，见图7C。

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引言

随着医学的不断发展，干细胞由于其自我更新的特性，在临床上已成为干预许多疾病的有效手段。干细胞根据发生学来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞[1]，但胚胎干细胞由于法律和伦理问题而在临床应用受限，间充质干细胞是目前研究最为广泛而深入的一类成体干细胞，具有强大的自我更新、多向分化和免疫调节能力，可从骨髓、脂肪、肝脏、肌肉、羊水、胎盘、脐血和牙髓等多种组织中分离得到[2-6]，已经成为治疗多种组织缺陷性疾病的种子细胞[7-10]。人骨髓间充质干细胞是骨髓中的非造血干细胞，它具有多向分化潜能，能够在体外诱导分化为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞，具有广阔的应用前景[11-12]。然而在体外培养过程中，随着传代次数的增加和培养时间的延长，人骨髓间充质干细胞的增殖能力逐渐减弱，因此限制了其在临床上的应用。
细胞永生化是细胞获得持续增殖能力的一种特性，永生化的细胞具有无限增殖能力，可长期传代，且其核型不发生改变[13]。细胞永生化有多种方法，包括病毒基因转染、端粒酶激活、放射因素刺激等[14-16]。一种慢病毒载体介导猴空泡病毒40大T抗原基因转染是获得永生化细胞株的方法，猴空泡病毒40大T基因抗原可与多种蛋白结合[17]，包括p53、pRB、DNA聚合酶α-引物酶和热休克伴侣70，以延长细胞周期和促进细胞永生化相关基因的表达[18]。将猴空泡病毒40接种于新生小鼠后，很快被鉴定为一种具有致瘤特性和细胞转化能力的新病毒[19-20]。DAYA-GROSJEAN等[21]通过猴空泡病毒40病毒转染获得永生化人脉络膜细胞株；KAISER等[22]利用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组反转录病毒载体转染，成功建立了PoCo83-3永生化细胞系，为研究猪结肠上皮屏障功能提供了一个有价值的体外模型。大T抗原基因可使细胞永生化效率提升，并广泛应用于实验中，越来越受到研究者的关注。该实验通过使用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组质粒载体转染人骨髓间充质干细胞，进行连续传代培养，筛选能表达猴空泡病毒40大T抗原基因的具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞株。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞模型，细胞功能数据采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年11月至2020年4月在西北农林科技大学动物医学院外科实验室完成。
1.3 材料人骨髓间充质干细胞、HEK293T细胞由西北农林科技大学动物医学院外科实验室保存[23]；Stbl3感受细胞(北京华越洋生物科技有限公司)；携带大T抗原基因的质粒pLOX-Ttag-iresTK、pLP/PsPAX、pLP/VSVG(Addgene公司)；DMEM培养液(Hyclone公司)；无内毒素质粒提取试剂盒、2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(杭州博日科技有限公司)；TaKaRa MiniBEST通用RNA提取试剂盒(TaKaRa，Japan)；Western blot检测试剂盒(博士德生物工程有限公司)；转染试剂、胎牛血清(ZETA LIFE，USA)；α-MEM培养基、成脂诱导分化完全培养液、成骨诱导分化完全培养液、成软骨诱导分化完全培养液(赛业生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 人骨髓间充质干细胞的培养、传代将实验室冻存的、经过鉴定的第4代人骨髓间充质干细胞复苏培养，当培养皿中的细胞融合达到80%-90%时可进行传代，每次传代时，先用PBS清洗，再加入0.25%胰酶放入培养箱进行消化，直至在显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入2 mL α-MEM完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清)终止消化，以1∶3比例进行传代，每2 d换液1次。

1.4.2 携带猴空泡病毒40大T抗原基因的慢病毒包装将包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG和携带大T抗原基因的质粒pLOX-Ttag-iresTK转化至Stbl3感受态细胞中，将菌液均匀涂布在LB培养基(含100 mg/L卡那霉素)上，37 ℃培养箱中倒置平板过夜培养。待质粒扩增后，用天根试剂盒提取质粒。将实验室保存的HEK293T细胞(1×106)接种于含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，在37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养24 h。将包装质粒2.8 μg pLP/PsPAX、2 μg pLP/VSVG和1.8 μg携带大T基因的质粒pLOX-Ttag-iresTK与10 μL转染试剂混合，混匀后静置10 min。将转染复合物逐滴加至细胞培养皿中，24 h后换新鲜培养基，继续培养48 h，收集慢病毒上清液并进行滴度测定。
1.4.3 永生化人骨髓间充质干细胞株的建立待人骨髓间充质干细胞融合度达到50%时，以2×105细胞密度接种于12孔板，将收集的慢病毒上清液与含有体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液按1∶1体积加入到人骨髓间充质干细胞中转染8 h，更换新鲜α-MEM培养液继续培养，48 h后加入4 mg/L嘌呤霉素进行筛选，将稳定转染的人骨髓间充质干细胞传代，连续传代超过50代。
1.4.4 永生化人骨髓间充质干细胞的鉴定
(1)绘制细胞生长曲线：相差显微镜下，观察未转染组与转染组人骨髓间充质干细胞的形态差异。取第8代未转染人骨髓间充质干细胞和第40代转染人骨髓间充质干细胞，均以1×104个/孔的细胞密度接种至24孔培养板中，每天取3个孔细胞进行计数，取平均值记作当天细胞数，连续计数8 d。以细胞数为纵坐标，培养天数为横坐标，绘制生长曲线。
(2)未转染组第4代和转染组第50代人骨髓间充质干细胞猴空泡病毒40大T抗原基因的表达：人工设计并合成一对特异性检测引物，F：TGA CCT CCA TAG AAG ACA CCG；R：CAA ATA CCT CAG TTG CAT CCC。按照TaKaRa MiniBEST通用RNA提取试剂盒说明书对第50代转染组人骨髓间充质干细胞和第4代未转染组人骨髓间充质干细胞进行总RNA提取，将 mRNA反转录为cDNA。按照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix说明书配置反应体系进行基因表达定量检测。每个样本基因检测进行3个重复，数据采用2-ΔΔCt法进行分析。用细胞裂解法提取未转染组第4代和转染组第50代人骨髓间充质干细胞内总蛋白，BCA法鉴定蛋白浓度，以GAPDH作为内参蛋白，按照Western blot检测试剂盒说明书对猴空泡病毒40大T抗原进行Western blot检测。
(3)永生化人骨髓间充质干细胞表面标记鉴定：取第40代转染组人骨髓间充质干细胞，制成浓度为2×109 L-1的细胞悬液，取流式细胞仪专用管11个，各加入 100 μL 细胞悬液，然后分别加入 CD44、CD105、CD11a、CD14、CD166、CD29、CD34、CD45和CD90的FITC或PE标记抗体，室温下孵育 15 min ，上流式细胞仪进行检测。
(4)永生化人骨髓间充质干细胞分化潜能鉴定：将第50代转染组人骨髓间充质干细胞按1×104/cm2密度接种于24孔培养板中，待融合至70%左右用相应的培养液进行诱导分化。诱导完成后分别使用油红O染液、茜素红染液和阿利辛蓝染液对细胞进行染色，显微镜下观察染色结果并拍照。
1.5 主要观察指标 ①未转染与转染后人骨髓间充质干细胞形态学特征以及转染后人骨髓间充质干细胞增殖能力；②转染后人骨髓间充质干细胞中猴空泡病毒40 mRNA和蛋白表达水平；③转染后人骨髓间充质干细胞表面标记分子的鉴定；④转染后人骨髓间充质干细胞的成脂、成骨、成软骨细胞分化潜能。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

人骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能、免疫抑制作用、外源基因转染率高并能高效稳定表达、不存在伦理问题等特点[24]，对于正常的人骨髓间充质干细胞，可设置不同的诱导环境，能够将其诱导分化成破骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等，并可使其在多种细胞系中转化[25-26]。近年来已有关于人骨髓间充质干细胞应用于临床的研究。RE’EM等[27]将人骨髓间充质干细胞种植于具有生物活性的支架材料上，体外培养构建出组织工程软骨，再移植入小鼠体内，获得了理想的效果，可作为骨组织缺损的修复材料。闫磊等[28]利用胰高血糖素样肽1和促胰岛素分泌素等细胞因子联合诱导人骨髓间充质干细胞，并将诱导后的细胞移植到糖尿病大鼠体内，发现大鼠血糖下降，糖尿病症状得到改善。付钰等[29]证实了人羊膜间充质干细胞/人骨髓间充质干细胞共培养体系可以作为高糖高脂诱导骨损伤的潜在治疗手段。刘黎等[30]用自体人骨髓间充质干细胞治疗肝硬化患者可使肝功能明显改善，治疗安全有效且不良反应小，可作为肝硬化中晚期患者的临床治疗手段之一。虽然人骨髓间充质干细胞已用于临床，但仍然存在一些问题，主要为人骨髓间充质干细胞在体外培养时传代次数有限，具有细胞最大分裂次数界限，影响细胞的数量及其正常分化潜能，导致在临床应用中受到限制。
细胞衰老是细胞因内外环境变化而发生不可逆的增殖抑制过程，各种应激因素都可导致细胞衰老的发生[31]。永生化是目前干细胞研究的一个重要方向，它可帮助细胞从增殖衰老危机中逃离，从而使其具有无限增殖能力。为建立供研究和临床使用的永生化细胞系，该实验采用病毒载体转基因的方法建立永生化细胞株。猴空泡病毒40构建永生化细胞株的方法，主要是大T抗原起决定作用，并依赖于生长抑制因子pRB和p53的相互作用[32]。毛德文等[33]将猴空泡病毒40大T抗原基因片段导入Kupffer细胞实现细胞永生化，转染后的Kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性。王佳雯等[34]利用猴空泡病毒40成功建立了永生化鹿茸软骨细胞系和间充质干细胞系，为后续鹿茸生长及发育研究奠定了基础。WANG等[35]研究表明猴空泡病毒40大T抗原基因转染的来源于自体髌下脂肪垫的干细胞表现出增殖能力和成脂分化潜能增强。猴空泡病毒40同样能转染体外培养的不同类型细胞[36]。李盛波等[37]证实了猴空泡病毒40大T抗原基因能使人脐静脉内皮细发生永生化，且永生化人脐静脉内皮细胞增殖能力增强，凋亡率下降，无恶性转化。FUJII等[38-42]利用猴空泡病毒40成功使人牙周韧带细胞永生化，为研究人牙周韧带细胞的生物学和再生机制提供了有用的工具。利用猴空泡病毒40构建永生化细胞株已被证实有效[43]，有一些研究成功地将这些细胞应用于体内器官和组织的恢复[44]，但是仍存在一些问题，如基因组不稳定、原代细胞表型和基因型的改变，以及导致肿瘤的发生[45]，有待进一步研究。
该研究将pLOX-Ttag-iresTK转染人骨髓间充质干细胞，构建永生化细胞株，发现对人骨髓间充质干细胞的体外培养有重要作用。通过研究发现，转染组人骨髓间充质干细胞在传代培养后依旧保持细胞形态良好，可持续传代培养，不会出现增殖能力受损，表达多种表面标志物如CD166、CD105、CD29、CD44和CD90，而不表达CD45、CD34、CD11[46]，也具备向脂肪、软骨、成骨分化潜能。综上，该研究成功构建人骨髓间充质干细胞永生化模型。利用猴空泡病毒40大T基因的异位表达，可延长人骨髓间充质干细胞的寿命，并且不影响其分化潜能，建立稳定的细胞株。该细胞株具备了原代细胞的典型形态特征以及生物学功能，有可能成为理想的细胞材料，为其在临床领域研究做前期准备。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化

SV40 large T gene induces immortalization of human bone marrow mesenchymal stem cells

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