2.1   无机离子仿生骨膜和MBGNs的内部结构和形貌   MBGNs透射电镜结果见图1所示，显示出分布在颗粒内部上的中空通道，纳米粒大多在300 nm左右。MBGNs扫描电镜结果见图2A所示，颗粒光滑整齐，粒径相对均匀。仿生骨膜扫描电镜结果见图2B所示，对水凝胶孔壁进行放大观察后可以明显观察到水凝胶孔壁出现凹凸不平,这是介孔生物活性玻璃纳米颗粒均匀附着于无机离子仿生骨膜表面的表现。通过观察MBGNs和无机离子仿生骨膜表面形态说明材料成功制备。







2.2   无机离子仿生骨膜体外硅离子的释放   仿生骨膜硅离子释放曲线见图3所示，其释放速率在24 h内迅速升高，并达到最大释放速率，并且在随后各时间点内释放速率没有发生较大变化，均在80×10-6-90×10-6内波动。提示仿生骨膜在7 d内硅离子有稳定的释放。




2.3   无机离子仿生骨膜材料的细胞相容性     活死荧光染色结果显示，当培养至7 d时，3组骨髓间充质干细胞生存状态均良好，呈现绿色荧光的活细胞占大多数比例，形态学伸展也较为良好，与此同时，呈现红色荧光的死亡细胞数量极少，见图4。证明无机离子仿生骨膜具有良好的细胞相容性，无明显细胞毒性。



2.4   无机离子仿生骨膜对骨巨噬细胞极化状态的影响   见图5，6。

将材料与骨巨噬细胞共培养至7 d时的细胞免疫荧光结果分别见图5，6所示，两张图中荧光颜色为绿色的是巨噬细胞通标(F4/80)，表明研究中骨巨噬细胞纯度较高。图5显示，呈红色的巨噬细胞M1表型(iNOS)在空白组和对照组有较高表达，实验组相对表达较少。图6显示，呈红色的巨噬细胞M2表型(CD206)在实验组表达明显较空白组和对照组高。共培养7 d后，仿生骨膜对巨噬细胞的M2极化有明显促进作用。由各组iNOS和CD206荧光半定量分析结果可见，仿生骨膜对巨噬细胞的M2极化有明显促进作用。
2.5   无机离子仿生骨膜材料的体外成骨性能   各组骨髓间充质干细胞成骨诱导培养7 d后的碱性磷酸酶染色结果，见图7，实验组染色深度明显高于空白组和对照组，证明碱性磷酸酶的表达在有仿生骨膜的实验组中更为显著。对其染色强度进行的半定量分析结果所示，碱性磷酸酶的表达在有仿生骨膜的实验组中更为显著。



2.6   体内动物实验结果
2.6.1   实验动物数量分析   18只大鼠全部进入结果分析。
2.6.2   无机离子仿生骨膜在大鼠颅骨缺损中对巨噬细胞极化状态的影响   术后7 d各组骨缺损周围巨噬细胞表型相关基因检测结果，见图8，结果显示空白组和对照组M1型巨噬细胞分泌的促炎基因肿瘤坏死因子α mRNA表达量高于实验组，实验组M2型巨噬细胞分泌的抑炎基因白细胞介素4 mRNA表达量高于空白组、对照组。




2.6.3   无机离子仿生骨膜在大鼠颅骨缺损中的成骨性能   术后8周各组大鼠颅骨缺损处苏木精-伊红染色结果，见图9，可见空白组和对照组没有或较少量楔形新生骨覆盖缺损区域周围，实验组新生骨组织几乎整体覆盖缺损区域。

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现今临床上，骨缺损后主要植入自体骨[1]、异体骨或人工骨治疗[2-3]，尽管有一定的疗效，但是骨不愈合率仍然有10%左右，很大原因就是没有重视骨膜的重要性。骨膜在骨的发育和损伤愈合过程中都起着至关重要的作用，骨膜主要分为内、外两层，是包覆于骨周围的一种薄而坚韧的结缔组织膜[4-5]，附着于肌腱和籽骨表面外的所有骨面,是为骨骼提供物理保护的复合结构，是传感机械载荷的机械传感器，是启动级联信号的生化分子储存库，是骨形成和修复的利基，是骨组织滋养的“脐带”，骨膜损伤越重骨不愈合的概率就越高。而且，骨组织损伤及材料植入都会引发急性炎症免疫反应，严重的炎症免疫反应会显著延长骨修复进程，增加骨不愈合的概率[6]。实际上，动物研究已经全面证明，如果没有巨噬细胞的直接参与，骨折是不会愈合的，但是目前国内外仿生骨膜研究大多忽略了骨折急性期炎症反应，这仍然会导致骨不愈合或延迟愈合的发生，因此，研究仿生骨膜的调控免疫来促进骨再生是目前亟需突破的瓶颈。

当组织受到细菌、创伤、毒素、高温或任何其他原因的伤害时，就会发生炎症反应。一般来说，它们可分为非感染性损伤相关分子模式(DAMP)和感染性病原体相关分子模式(PAMP)。在骨缺损后，炎症阶段发生在骨愈合的早期，通常会持续1周左右[7]。这个过程中，多种免疫细胞类型参与了免疫反应，如淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等，但巨噬细胞是介导骨缺损急性期炎症反应的主要效应细胞，其通过分泌各种细胞因子起着最重要的作用[8]。巨噬细胞可极化成两种不同的表型：促炎症的“M1”表型和抗炎的“M2”表型。M1表型通常在损伤后三四天停留在损伤部位，此后转变为M2表型，其分泌的生长因子促进间充质干细胞介导的骨折愈合后期的骨形成。如果M1表型持续时间较长，而M2表型未能增强，使骨缺损局部环境持续处于炎症状态，就会引起过度炎症反应，增加骨不愈合概率[9]。M2表型可表达骨缺损修复中的关键基因(如精氨酸酶和Fizz1)，并分泌各种细胞因子和生长因子，帮助细胞增殖、分化和细胞外基质沉积，包括白细胞介素4、白细胞介素10和转化生长因子β[10]。因此，如果仿生骨膜可促进巨噬细胞向M2表型极化，将有利于骨修复，减少骨不愈合概率。

近期研究发现可通过材料结构调控巨噬细胞表型，如亲水性、大孔径、高孔隙率、低模量或含RGD黏附序列的水凝胶、定向拓扑纤维均可促进巨噬细胞M2极化，降低炎症反应[11-13]。或通过负载不同因子调控巨噬细胞表型，如将丝素功能化纳米电纺丝经过细胞因子白细胞介素4修饰后植入小鼠皮下，修饰后的纳米电纺丝促进了巨噬细胞M2极化[14]。还可通过材料本身调控免疫，促进成骨，CHEN等[15]使用含β-磷酸三钙的镁支架促进巨噬细胞分泌成骨细胞的诱导因子，如骨形态发生蛋白2、白细胞介素1受体拮抗剂。介孔生物活性玻璃纳米颗粒(mesoporous bioactive glass nanoparticles，MBGNs)可在骨愈合过程中可溶出无机离子形成生物矿化层，促进骨修复[16]。甲基丙烯酸明胶(methacrylic acid gelatin，GelMA)为甲基丙烯酸酐改性的明胶水凝胶，是一种已经较为成熟的广受关注的水凝胶材料，可以成型为膜状并在骨损伤区域覆，同时GelMA水凝胶具有较为良好的亲水性，并且GelMA水凝胶富含RGD序列(RGD sequence)，能够促进细胞的黏附，与天然细胞外基质结构相似，常作为细胞生长支架[17]。XIN等[18]用MBGNs与GelMA作为主要成分的仿生骨膜可溶出钙硅磷离子，增强骨髓间充质干细胞矿化，促进成骨，但其大多数研究都集中在直接控制成骨细胞上，而硅离子是一种可促进巨噬细胞M2极化的无机离子，所以无机离子仿生骨膜对炎症微环境的影响仍需探索。

此次实验将MBGNs与GelMA共混后光交联构建了一种有免疫调控作用的无机离子仿生骨膜，通过体内外实验分析仿生骨膜的免疫调控作用，以期为构建免疫功能化骨移植材料治疗骨缺损提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   材料学及对比观察细胞实验、动物实验，组间比较采用t检验。
1.2   时间及地点    实验于2021年3-9月在苏州大学南校区骨科研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   实验用主要试剂   明胶、甲基丙烯酸酐(上海凌峰化学)；光引发剂(日本TCI公司)；正硅酸乙酯(美国Sigma-Aldrich)；四水硝酸钙、磷酸三乙酯(上海凌峰)；十六烷基三甲基溴化铵、HCl、三羟甲基氨基甲烷(上海阿拉丁)；人体模拟体液(上海源叶公司)；胎牛血清、α-MEM培养基(美国Gibco公司)；成骨诱导培养基(Oricell公司)；F4/80-AF594抗体、CD206-AF488抗体、iNOS-AF488抗体、双抗、胰蛋白酶、DAPI染色液、活死染色试剂盒(英国Abcam公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天公司)；40 g/L多聚甲醛固定液、Trizol、苏木精-伊红染色试剂盒(中国上海碧云天有限公司)。
1.3.2   实验用主要仪器   扫描电镜(日本日立公司)；透射电子显微镜(美国FEI公司)；电感耦合等离子体光谱仪、正置相差显微镜(德国Leica公司)；石蜡包埋机、切片机(德国Leica公司)。
1.3.3   实验动物   雄性SD大鼠22只，6-8周龄，SPF级，体质量(250±50) g，购自苏州昭衍研究中心有限公司，许可证号：SCXK(苏)2018-0006，饲养于苏州大学动物中心SPF级屏障系统内。进行实验前，所有大鼠均为5只一笼，合笼饲养，经1周适应性喂养后进行动物实验。动物实验经苏州大学伦理委员会审批(批准号：SUDA20211123A01)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   实验方法   
1.4.1   无机离子仿生骨膜的制备

制备MBGNs：配置pH=8的Tris-HCl缓冲液。取500 mL Tris-HCl缓冲液，油浴加热至60 ℃；使用分析天平称取1.5 g十六烷基三甲基溴化铵，加入Tris-HCl缓冲液中磁力搅拌器至完全溶解；再使用分析天平称取4.9 g四水硝酸钙加入反应液中，搅拌直至完全溶解；随后滴加1.8 mL三磷酸乙酯搅拌至充分溶解；最后缓慢滴加13 mL正硅酸乙酯，全程保持反应温度于50 ℃，完全溶解后溶液逐渐转变为白色，继续搅拌16 h；将反应所得乳白色悬液12 000 r/min离心5 min，得到白色沉淀；多次清洗沉淀后烘干过夜；将干燥后的白色固体置入坩埚中，使用马弗炉煅烧以2 ℃/min的速度升温至650 ℃并保温3 h，得到白色固体即为成品MBGNs。

制备GelMA：称取20 g明胶加入200 mL PBS中，60 ℃油浴并磁力搅拌，1.0-2.0 h完全溶解；继续保持60 ℃搅拌并缓慢滴入16 mL甲基丙烯酸酐，大约每4 min滴入1 mL，滴入完成后继续搅拌1 h；取800 mL PBS，加热至50 ℃，加入到上述反应体系中继续搅拌15 min；冷却并置入透析袋中透析5 d，以去除没有参加反应的甲基丙烯酸酐和其他杂质；透析完成后将所得溶液倒出并加热至60 ℃；趁热将所得溶液使用0.22 µm滤膜抽滤，过滤后进行冷冻干燥：首先将液体预冻24 h，再转入冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，得到泡沫状固体，即为GelMA单体。

制备无机离子仿生骨膜：使用PBS加热至60 ℃，并加入质量分数1%的光引发剂，避光搅拌直至完全溶解；加入200 g/L的GelMA；再加入质量分数3%的MBGNs，将所得溶液置入模具并置于紫外灯下光照3 min，自由基聚合引起交联固化，获得无机离子仿生骨膜。
1.4.2   仿生骨膜形态观察

透射电镜观察：取100 mg MBGNs分散于2 mL乙醇中，取2 μL滴入透射电镜铜网上，室温干燥4 h，设置电压于120 kV，观察MBGNs内部形态。

扫描电镜观察：将仿生骨膜在-20 ℃预冻后进行冷冻干燥，冷冻干燥后的仿生骨膜贴于导电胶载物台，再取少量MBGNs黏附于贴好导电胶上，完成喷金后使用扫描电镜观察并拍摄相关照片。
1.4.3   无机离子仿生骨膜体外硅离子释放   仿生骨膜复合水凝胶成胶后，放于6孔板中，每孔添加1 mL人体模拟体液，放入37 ℃摇床中孵育。使用移液枪收集第1，2，3，4，5，6，7天的上清液，配制王水，将样品逐一加入对应标号的烧杯，恒温165 ℃加热1 h，至样品完全消解。去除玻璃盖，将温度升高至190 ℃恒温加热至烧杯中的溶液体积约黄豆大小，停止加热，将每份样品用4%HNO3定容至2 mL。为保证样品中无杂质，将过滤后的样品稀释1 000倍，保证其浓度在×10-6级别。配制元素标准曲线，选择硅元素，调至低分辨率测量，测量时间设置为20 s。建立测量序列：设置空白对照、标准曲线、样品测量，保证标准曲线R≈1的前提下，上机使用电感耦合等离子体发射光谱法检测仿生骨膜浸提液中的硅离子浓度。
1.4.4   体外细胞实验

骨髓间充质干细胞的分离与培养：取1只6-8周龄SD大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)后断颈处死，取下双侧股骨和胫骨，冲洗骨髓腔，细胞培养于α-MEM培养基中；24 h后弃去上清液，胰酶消化贴壁细胞，重新在10 cm培养皿上铺板，得到原代骨髓间充质干细胞，随后进行传代、冻存等操作。

骨巨噬细胞的分离与培养：取3只6-8周SD大鼠，麻醉后断颈处死，取下双侧股骨和胫骨，冲洗骨髓腔，细胞培养于α-MEM培养基中；12-16 h后收集上层悬浮细胞，转移至6孔板中培养，加入含30 µg/L集落刺激因子的α-MEM培养液2 mL，继续培养3 d后得到骨巨噬细胞，进行相关实验。

无机离子仿生骨膜的细胞相容性：取GelMA前体溶液300 µL滴加至无菌24孔板中，进行光交联凝固成水凝胶，作为对照组；取仿生骨膜复合水凝胶前体溶液300 µL滴加至无菌24孔板中，进行光交联凝固成水凝胶，作为实验组；将第7代骨髓间充质干细胞以1×105/孔的密度接种于24孔板内，以单独培养的细胞为空白组。每组设3个复孔。共培养7 d后，配置活死染色工作液，培养板中每孔滴加工作液染色，30 min后取出孔板中的水凝胶，使用正置荧光显微镜观察并拍照。

无机离子仿生骨膜对骨巨噬细胞极化状态的影响：在无菌24孔板中，按照前述方法分别制备对照组与实验组水凝胶；将骨巨噬细胞以5×103/孔的密度接种于24孔板中，以单独培养的细胞为空白组。每组设3个复孔。共培养7 d后，去除培养液，40 g/L多聚甲醛室温下固定；5%BSA封闭非特异性抗原；次日加入F4/80-AF594抗体，4 ℃过夜孵育；后加入M1型巨噬细胞特征表型iNOS-AF488抗体；另一队列样本则加M2型巨噬细胞特征表型CD206-AF488抗体，4 ℃过夜孵育；样品复温30 min后，加入DAPI标记细胞核，染色结束后倒置荧光显微镜下观察拍照。

无机离子仿生骨膜材料体外的成骨性能：在无菌24孔板中，按照前述方法分别制备对照组与实验组水凝胶；将第7代骨髓间充质干细胞以1×104/孔的密度接种于24孔板中，以单独培养的细胞为空白组。每组设3个复孔。当各组细胞培养至70%融合率时，吸去培养基，换成成骨诱导培养基继续培养，换液频率变更为每周2次。7 d后，吸去培养基，使用40 g/L多聚甲醛固定半小时；PBS冲洗以彻底清除多聚甲醛，在每孔内加入碱性磷酸酶染色工作液400 µL，室温避光反应约20 min，避免反应时间过长出现假阳性；及时镜下观察拍照，镜下观察呈现蓝紫色染色的即为阳性细胞。
1.4.5   动物实验 

大鼠颅骨缺损模型制备与分组处理：取18只8周龄SD大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，使用手术刀在大鼠颅顶正中线切开切口，于顶骨区中线两侧对称部位，使用环锯制备直径5 mm的全层骨缺损，完全去除骨瓣；取无机离子仿生骨膜水凝胶植入双侧骨缺损部位作为实验组，取纯GelMA水凝胶植入双侧骨缺损部位作为对照组，空白组不植入材料，每组6只大鼠，最后逐层缝合。

RT-PCR检测骨缺损局部巨噬细胞表型：术后7 d，使用高浓度CO2窒息法处死每组3只大鼠，取出颅骨颅顶标本，立即储存于液氮罐中；用研钵将标本研磨至粉末状，取150 mg骨组织到2 mL无酶EP管中，加入1 mL Trizol；加入200 µL氯仿溶液；4 ℃下12 000×g离心15 min；取上清到另一无酶EP管中，加入等体积异丙醇溶液，4 ℃环境中12 000×g离心10 min，去除上清；加入1 mL 体积分数75%乙醇溶液，4 ℃7 500×g离心10 min，去除上清，使用无屑滤纸吸除管壁中残留液体加入适量DEPC；取2 µL RNA溶液，通过超微量分光光度计测定260 nm和280 nm吸光度值，确定RNA浓度。以RNA(1 µg)、4×g DNA wiper Mix(4 µL)、Oligo dT23VN(1 µL)、Random hexamers(1 µL)、10×RT Mix(2 µL)、HiScript Ⅱ Enzyme Mix(2 µL)，RNase free ddH2O(补充至20 µL)为体系合成cDNA。后以cDNA(1 µL)、上游引物(0.5 µL)、下游引物(0.5 µL)、SYBR Premin PCR Mix(10 µL)、DPEC(补充至20 µL)为PCR反应体系测定相关基因表达量。表1为组织炎症基因引物序列，GAPDH设为内参基因，检测炎症基因引物序列由金唯智生物科技有限公司设计并合成。

颅骨缺损区成骨性能：术后8周，使用高浓度CO2窒息法处死每组3只大鼠，取出颅骨颅顶标本，使用生理盐水冲洗后浸入体积分数10%甲醛中固定48 h；之后通过10%EDTA进行脱钙，常规制作厚度为5 µm的切片，进行苏木精-伊红染色，镜下观察缺损区新生骨组织形成。 
1.5   主要观察指标   MBGNs和无机离子仿生骨膜的表面形态；无机离子仿生骨膜的细胞相容性；无机离子仿生骨膜在体内、外对巨噬细胞表型极化的影响以及对成骨性能的作用。
1.6   统计学分析   应用Prism Graphpad 7.0统计软件分析，数据以x±s表达，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州大学生物统计学专家审核。
1.7   出版规范   该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行 3 次查重。文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

随着工业化程度的提高，创伤、肿瘤切除手术或先天畸形所致的临界大小骨缺损的临床治疗面临巨大挑战。据估计，中国每年有300万人被诊断出骨骼损伤。之前一般采用同种骨移植或异体骨移植的方式进行治疗，现生物组织工程学的出现和发展为解决这些问题提供了新的选择和思路，基于不同天然或人工生物材料的组织工程支架作为骨替代材料已被研究用于骨缺损的临床治疗。在骨缺损的修复中，骨本身一直是作为主要考虑的关键因素，而骨膜的损伤常常被忽略。事实上，骨膜不仅在骨生长发育中有重要的作用，而且在骨愈合的过程中也起着重要的作用。近年国内外的发展趋势是制备人工骨膜促进骨修复，尽管人工骨膜具有一定的成骨和成血管功能，但植入体内的骨愈合率却很低，其很大程度上取决于免疫系统对材料的作用。国内外目前大多数研究都集中于控制成骨细胞来促进骨修复，如WU等[19]用可持续释放血管内皮生长因子的分层微/纳米纤维仿生骨膜作为外源性血管化骨膜纤维层，在体内诱导内源性形成层，使骨膜和骨组织完全再生；或研究材料支架本身理化性质促进成骨细胞生长，如TANG等[20]用利用胺/钙和羧基之间的界面离子键相互作用，采用内外双重分级增强策略构建了纳米纤维/颗粒双重增强的分级丝素支架促进成骨。而对于骨缺损局部炎症微环境和材料植入所引发的炎症对骨愈合的研究尚少，因此研究人工骨膜如何影响炎症环境以及是否有利于骨修复是十分迫切的[3]。一般骨缺损后局部环境中巨噬细胞是主要免疫调节细胞，其可分为M1表型(促炎杀菌)和M2表型(抗炎修复)[21]。在不同时间段巨噬细胞表现出相应的表型改变，在炎症早期巨噬细胞被极化为M1表型，这种表型可产生一氧化氮和促炎细胞因子，导致组织损伤；而后巨噬细胞主要极化为M2表型，这种表型可以抑制促炎细胞因子的产生，促进组织修复。但是生物材料植入通常会诱导巨噬细胞M1极化，引起炎症异物反应、肉芽肿形成、纤维包裹，最终骨整合失败[22]。现已有报道M2巨噬细胞能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，表现为碱性磷酸酶升高和骨矿化[22]。因此生物材料植入物如果能调控巨噬细胞表型、促进M2极化，就能降低生物材料植入的炎症反应，提高骨整合、增加骨愈合成功率。硅离子是一种能促进巨噬细胞向M2极化、调控炎症的无机离子[23-24]。MBGNs是在生物活性玻璃和介孔二氧化硅基础上研制的新型材料，含80%SiO2的无机材料，以其为主要成分的生物材料已被多次证明是具有优良促进骨修复能力的植入物[25-26]。但是单纯MBGNs在体内难以成型，离子释放过快，不能单独应用于骨移植部位，需要优良的支架。在众多生物材料细胞支架中，水凝胶因与天然基质的内在相似性，为细胞生长和组织形成提供了一种三维支撑，正如GelMA及无机离子仿生骨膜的电镜观察所看到的，GelMA水凝胶支架呈现一种稳定的多孔三维结构，GelMA力学性能优良，常作为细胞生长支架[27]。此次实验将MBGNs与GelMA共混后光交联得到一种无机离子仿生骨膜，这种骨膜不仅能通过MBGNs形成生物矿化层和GelMA提供生长支架的作用促进成骨，还能通过仿生骨膜持续释放Si4+来促进巨噬细胞向M2极化，抑制炎症、提高骨整合、增加生物材料植入的成功率。

实验首先利用模板法成功合成出MBGNs，从MBGNs的透射电镜和扫描电镜看到纳米粒大小均一，呈规则圆形，而纳米粒内部的中空通道更有利于硅离子的释放。从无机离子仿生骨膜的扫描电镜可观察到多孔水凝胶孔壁凹凸不平，为纳米颗粒嵌入附着的表现，并且纳米粒在水凝胶表面分布均匀，显示出纳米粒分散性较佳。扫描电镜与透射电镜均有力证明了MBGNs和无机离子仿生骨膜的成功合成，并且纳米粒具有良好的分散性。硅离子释放曲线表明仿生骨膜在模拟体液中稳定释放硅离子长达1周，具有缓释作用，可持续影响巨噬细胞极化，调控炎症微环境。而且，MBGNs的介孔结构和较大的比表面积也为未来进一步修饰材料提供了潜力。

良好的生物相容性是生物材料的必备特性，骨髓间充质干细胞常被用于评估骨修复材料的细胞相容性和成骨能力[28]。共培养7 d后活死染色观察骨髓间充质干细胞，发现3组细胞活性均尚佳，死亡率较低，无明显差异，证明无机离子仿生骨膜具有良好的细胞相容性，无明显细胞毒性。一氧化氮合成酶和CD206分别是巨噬细胞M1型和M2型的免疫荧光标志物[29]。分3组共培养7 d后，利用免疫荧光染色对比观察各组巨噬细胞表型变化，如预期一样，在仿生骨膜上的骨巨噬细胞M2表型标志物CD206表达增多，而M1型标志物一氧化氮合成酶鲜有表达，其他两组的结果反之，说明仿生骨膜具有明显促巨噬细胞M2极化的作用。在对仿生骨膜的体外成骨能力实验中，骨髓间充质干细胞是生长至一定阶段后可在成骨培养基诱导下转向成骨分化的细胞[30]。碱性磷酸酶是成骨分化早期的标志物，主要功能是使局部磷浓度升高，从而促进钙磷结合沉积，使细胞外基质成熟矿化[31]。实验结果显示碱性磷酸酶在实验组表达更明显，说明在骨修复早期实验组骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强，展现出更优秀的骨修复能力。实验证明了巨噬细胞M2型在实验组表达最为显著，而M2表型恰好可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促进成骨[24]，作者认为实验组M2表型高表达与碱性磷酸酶高表达之间有密不可分的联系。无机离子在人工生物工程材料的运用中，经常遇到植入动物体内后离子前期释放速率过快、后期无离子释放，材料无法持续发挥，而且可能会因局部高浓度无机离子引发相关并发症的发生，此次实验使用具有中空介孔通道结构的MBGNs融合于GelMA水凝胶中，其具有良好的模拟骨膜分泌功能，从而使无机离子有序释放，促进骨组织生长。在动物体内同样首先检测了各组巨噬细胞表型的变化，建立大鼠颅骨缺损模型后，空白组不植入材料、对照组植入纯GelMA水凝胶，实验组植入无机离子仿生骨膜[32]，7 d后取颅骨进行巨噬细胞相关基因检测。肿瘤坏死因子α可作为巨噬细胞M1表型标志[33]，白细胞介素4可作为巨噬细胞M2表型标志[34-36]。体内实验结果与体外细胞实验结果相吻合，实验组巨噬细胞M2表型高表达、M1表型低表达，空白组和对照组反之，证明无机离子仿生骨膜在体内同样有明显促巨噬细胞M2极化的功能。在之后进行的术后8周颅骨缺损苏木精-伊红染色中，实验组显示出的成骨能力也明显优于空白组和对照组。以上动物实验表明，仿生骨膜在体内所展现远期优秀的骨修复能力与其早期可促进巨噬细胞向M2型极化所形成抗炎的微环境也是密不可分的。

综上所述，实验从免疫调控方面探讨了无机离子仿生骨膜在体内、外通过调控巨噬细胞表型来营造抗炎微环境，从而促进成骨分化、加快骨修复进程的作用，为构建免疫功能化骨移植材料治疗骨缺损提供新思路。当然实验目前还存在着一些不足，例如利用MBGNs的载药能力负载抗炎因子以进一步提高免疫调控能力，以及材料免疫调控机制方面还需要继续深入的研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
骨膜：作为正常骨组织的重要组成部分，是包裹在骨组织周围的一层薄而坚韧的结缔组织膜，在骨组织的发育和修复中起着决定性的
作用。
介孔生物活性玻璃纳米颗粒：是一种Ca-Si-P系的无机材料，表面有中空通道，具有较大的比表面积，可局部释放钙硅磷离子促进成骨。
甲基丙烯酸明胶：是甲基丙烯酸酐改性的明胶，具有良好的生物相容性和力学性能，可作为细胞支架。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此次实验将介孔生物活性玻璃纳米颗粒与甲基丙烯酸明胶共混后光交联，构建了一种有免疫调控作用的仿生骨膜。通过在体内外的对比观察研究，发现仿生骨膜不仅在体外有显著免疫调控作用，而且在大鼠颅骨缺损的体内研究中也有明显的免疫调控作用，均可极化巨噬细胞M2亚型，促进骨修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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