成脂分化后人牙周膜干细胞由原本的纤维状慢慢缩短，变圆。诱导分化8-10 d出现脂滴，油红O染色后可见脂滴颗粒均被染成红色，见图1B。成骨诱导后人牙周膜干细胞由纤维状开始变为多边形、鳞片状。随着诱导时间的延长，逐渐形成钙结节，经茜素红染色后可见钙结节被染成红色的矿化沉着物，见图1C。



2.2   人牙周膜干细胞的表型鉴定结果   流式细胞检测结果显示，人牙周膜干细胞表面CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC均呈强阳性表达，而CD45和HLA-DR低表达，见图2。



2.3   人牙周膜干细胞来源外泌体鉴定结果    透射电镜观察可见脂质双分子层形成的囊泡结构，见图3A。NanoFCM粒径检测显示其外泌体直径分布在50-120 nm，集中在79.86 nm，见图3B。Western blot检测结果显示，提取的外泌体中含有CD81和CD63和TSG101的表达，见图3C。



2.4   人牙周膜干细胞来源外泌体对成骨细胞增殖的影响   由图4可知，与对照组相比，不同质量浓度人牙周膜干细胞来源外泌体对成骨细胞的增殖具有促进作用，且作用呈剂量依赖性。




2.5   人牙周膜干细胞来源外泌体对成骨细胞分化的影响   由图5可知，与对照组相比，人牙周膜干细胞来源外泌体干预下，MC3T3-E1成骨细胞能够形成更多的钙结节，茜素红染色后可见更多的红色矿化沉着物。



2.6   人牙周膜干细胞来源外泌体对MEK/ERK信号通路的影响   由图6可知，与对照组相比，人牙周膜干细胞来源外泌体组MC3T3-E1成骨细胞内p-MEK及p-ERK蛋白表达量升高，MEK/ERK信号通路被激活。

存在于牙周韧带组织的人牙周膜干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，已成为骨再生、牙周组织再生及修复、牙齿微环境改建等过程中重要的种子细胞[1-2]。近年来，越来越多的研究表明干细胞发挥其作用在很大程度上是由其旁分泌主导而实现的，而干细胞分泌组分包括细胞因子和外泌体等活性物质[3]。外泌体是由细胞通过出芽方式分泌的一种直径在30-120 nm间的纳米级囊泡物，内含有蛋白质、脂质、DNA、编码和非编码RNA及代谢物等生物学活性物质[4]。外泌体通过在邻近细胞间进行“交流和通讯”，发挥多种生物学功能[5]。有大量研究证实人牙周膜干细胞具有较强的成骨分化能力，并可通过旁分泌作用影响成骨细胞的状态[6]。人牙周膜干细胞是否通过外泌体进行细胞间信息传递来影响成骨细胞的生物学功能，尚未明确。该研究旨在通过观察人牙周膜干细胞来源外泌体(periodontal ligament stem cells derived exosomes，PDLSC-exo)对成骨细胞MC3T3-E1增殖及分化的调节作用，以期为牙槽骨缺损等疾病的治疗提供科学依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外细胞功能和细胞分子机制检测实验，两组间比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年3-8月在佛山科学技术学院岭南转化医学中心实验室完成。
1.3   材料   间充质干细胞完全培养基、间充质干细胞成脂分化培养基、间充质干细胞成骨分化培养基(Cyagen，中国)；胰蛋白酶、青链霉素、谷氨酰胺(Gibco，美国)；外泌体纯化试剂盒(外泌露，ExonanoRNA，中国)；BCA试剂盒、Ⅰ型胶原酶(Solarbio，中国)；MC3T3-E1成骨细胞株(ProCell，中国)；CCK8试剂盒(APEcBIO，中国)；CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD45和HLA-DR抗体( BioLegend，美国)；CD63、CD81和TSG101抗体(Affinity，美国)；羊抗兔二抗(Bioss，中国)；流式细胞仪、超速离心机(Beckman，美国)、超净工作台、CO2培养箱箱、酶标仪(Thermo，美国)；倒置显微镜系统(Olympus，日本)；透射电镜( Hitachi-4800，日本)；凝胶电泳成像系统(Tanon，中国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   人牙周膜干细胞的分离与培养   收集佛山市口腔医院15-30岁患者，因正畸减数或阻生智齿需拔除的无牙体及牙周病损的恒牙，患者或监护人知情同意并签署同意书，该研究的实施符合佛山市口腔医院伦理委员会的相关伦理要求。收集到拔除牙后立即置于含2%双抗的PBS中4 ℃保存。用含2%双抗的PBS清洗牙齿3次；用刮治器刮取根中1/3的牙周膜组织；将牙周膜组织剪成1 mm3大小，加入装有3 mL Ⅰ型胶原酶(1 g/L)的5 mL离心管中，于37 ℃培养箱中消化1.0-2.0 h；消化液通过70 μm细胞筛后，300×g离心5 min，弃上清液；间充质干细胞完全培养基重悬细胞，按每孔(0.5-1.0)×106密度接种于6孔板，放置于37 ℃培养箱中培养；每次3 d换液1次，细胞培养至80%汇合度时，进行1∶2传代。 

1.4.2   人牙周膜干细胞的多向分化   

(1)成脂分化：取第3代细胞以2×107 L-1的细胞浓度接种于12孔板内，每孔2 mL，置于CO2培养箱中培养至细胞70%汇合度；每孔加入1 mL间充质干细胞成脂诱导分化A液，诱导培养72 h后；每孔更换1 mL间充质干细胞成脂诱导分化B液，诱导培养24 h；重复3-5个循环，直至孔内出现较多脂滴，最后将细胞在B液中培养3 d；加入1 mL 40 g/L多聚甲醛固定20 min；油红O工作液染色30 min，于显微镜下观察、拍照。

(2)成骨分化：取第3代细胞以2×107 L-1的细胞浓度接种于12孔板内，每孔2 mL，置于CO2培养箱中培养至细胞80%汇合度；每孔加入1 mL间充质干细胞成骨诱导分化液，每隔3 d换1次液，直至观察到有较多骨钙化结节形成；加入1 mL 40 g/L多聚甲醛固定20 min；茜素红染色液染色3-5 min，于显微镜下观察、拍照。
1.4.3   人牙周膜干细胞的表型鉴定   取第3代细胞，待细胞融合至80%时，用0.25%胰酶消化；调整细胞数为1×106个，300×g离心5 min，弃上清；PBS清洗2次、300×g离心5 min；分别加入荧光标记抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105和HLA-DR，室温孵育20 min，1 h内上流式细胞仪检测。
1.4.4   人牙周膜干细胞来源外泌体的收集和提取   将用于收集外泌体的间充质干细胞完全培养基在4 ℃，120 000×g条件下超速离心70 min，以去除培养基内源性外泌体，制备无外泌体(Exosome-free)完全培养基；用Exosome-free完全培养基培养第3-8代人牙周膜干细胞，培养24 h后收集细胞上清液；在4 ℃条件下，上清液依次通过300×g和10 000×g分别离心30 min，以除去死细胞及细胞碎片；小心收集上清后，转移至38.5 mL超速离心管，底部加入100 μL外泌体纯化试剂(外泌露)，100 000×g 离心70 min后吸取最底部500 μL；转移至5.5 mL超速离心管内，底部加入500 μL外泌体纯化试剂提纯外泌体，加 PBS 补齐至离心管满，
100 000×g离心70 min，用枪头插到管底吸取底部200 μL，弃去，再吸取200 μL则为纯外泌体，于-80 ℃保存，备用。
1.4.5   人牙周膜干细胞来源外泌体的鉴定   

(1)透射电镜观察：吸取外泌体样品10 μL滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液；磷钨酸10 μL 滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液；常温干燥数分钟；80 kV进行电镜检测成像。

(2)粒径分析：吸取外泌体样品5 μL，PBS稀释到30 μL，送样检测；先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针；待样本完成检测即可获得 NanoFCM仪器(Flow Nano Analyzer)检测外泌体的粒径和浓度。

(3)外泌体特异性蛋白鉴定：取50 μL外泌体提取液加入10 μL蛋白上样缓冲液，于95 ℃下进行蛋白变性10 min；用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，之后将蛋白转移到PVDF膜上进行印迹分析，取出膜置于封闭液中室温封闭 1 h；加入 Anti-CD63、CD81和TSG101抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜孵育；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h；采用 ECL化学发光试剂于化学发光成像系统中进行成像显影。
1.4.6   人牙周膜干细胞来源外泌体对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响   将成骨细胞MC3T3-E1以5 000个/孔接种于96孔板，培养24 h后分别加入不同质量浓度PDLSC-exo(0，10，50，100 mg/L)，每孔5个重复，处理48 h后加入10 μL CCK8试剂，在37 ℃反应1.5 h，利用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
1.4.7   人牙周膜干细胞来源外泌体对成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的影响   MC3T3-E1细胞以2×107 L-1的细胞浓度接种于12孔板，每孔1 mL。培养24 h后，对照组加入成骨诱导分化液，人牙周膜干细胞来源外泌体组加入含有人牙周膜干细胞来源外泌体(100 mg/L)的成骨诱导分化液。培养14 d后茜素红染色液染色3-5 min后，于显微镜下观察、拍照。
1.4.8   人牙周膜干细胞来源外泌体对成骨细胞MC3T3-E1内MEK/ERK信号通路的调控   通过Western blot检测人牙周膜干细胞来源外泌体作用前后MC3T3-E1内MEK和ERK的磷酸化水平。调整MC3T3-E1细胞浓度，以2×108 L-1的细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h后，对照组加入间充质干细胞完全培养基，人牙周膜干细胞来源外泌体组加入含有人牙周膜干细胞来源外泌体(100 mg/L)的间充质干细胞完全培养基，继续培养24 h后，每孔加入150 μL的RIPA裂解液提取蛋白，用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，之后将蛋白转移到PVDF膜上进行印迹分析，取出膜置于封闭液中室温封闭1 h；加入Anti-p-MEK和Anti-p-ERK抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜孵育；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h；采用ECL化学发光试剂于化学发光成像系统中进行成像显影。
1.5   主要观察指标   人牙周膜干细胞来源外泌体干预后MC3T3-E1细胞的增殖能力及培养皿中茜素红染色钙化程度。
1.6   统计学分析   使用GraphPad Prism 8分析各组数据，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

牙周炎是局部因素引起的牙周支持组织损伤及缺失的一种慢性感染性疾病，是造成成年人失牙的主要原因[7]。牙周支持组织的损伤修复及重建再生是牙周炎治疗的难点[8]，相较于传统治疗方法，以干细胞为基础的组织工程及再生医学技术，给牙周组织修复和再生提出了新思路，特别是牙周组织来源人牙周膜干细胞在牙周组织缺损修复的动物模型中已取得了不错的进展[9]。近年来随着对人牙周膜干细胞研究的进一步深入，有大量的研究表明存在于牙周膜组织中的人牙周膜干细胞具有旺盛的自我复制能力与强大的分化及分泌功能，在维持牙周组织微环境平衡和组织缺损后的修复再生方面具有重要作用[10]。此外，人牙周膜干细胞具有较其他间充质干细胞很好的成骨分化能力，并能够促进骨缺损的愈合及骨再生，但是其具体作用机制尚不明确[11]。

外泌体是一种具有脂质双分子层膜结构的微小囊泡，由细胞分泌并存在于血液、唾液、尿液、乳液、脑脊液等体液中，作为细胞间通讯的载体，被靶细胞吞噬后，通过特异的蛋白、脂质和核酸等内含物的释放调控细胞增殖、迁移、凋亡及分化等生理过程而发挥其功能[12-17]。近年来，关于干细胞来源外泌体的相关研究成为了干细胞领域的热点，不同间充质干细胞来源外泌体具有促进血管新生、免疫调节、皮肤损伤修复、心肌缺血再灌注损伤修复及软骨损伤修复等功能[18-22]。研究结果表明人牙周膜干细胞条件培养液能够促进MC3T3-E1细胞的增殖[23]。因此，该研究以人牙周膜干细胞来源外泌体为切入点，探讨人牙周膜干细胞来源外泌体在MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化中的作用。

该实验通过胶原酶消化法成功分离人牙周膜干细胞，流式分析结果表明，人牙周膜干细胞阴性表达CD45和HLA-DR，阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC等标记物；诱导多向分化结果显示，人牙周膜干细胞具有成骨和成脂分化能力，符合间充质干细胞的基本特性。通过超速离心法结合特定的试剂盒纯化分离得到纯度较好的人牙周膜干细胞来源外泌体，透射电镜观察可见外泌体为脂质双分子层形成的囊泡结构，粒径检测显示外泌体直径分布在50-120 nm，集中在79.86 nm，Western blot检测结果显示外泌体中有CD81，CD63和TSG101的表达。CCK8检测结果显示，经人牙周膜干细胞来源外泌体干预后，MC3T3-E1细胞增殖能力显著增强，而且这种增强效应呈现剂量依赖性。刘焱等[23]研究发现人牙周膜干细胞条件培养基干预可通过加快MC3T3-E1细胞的有丝分裂来促进细胞增殖，与该研究结果相吻合。由此可以初步判断，人牙周膜干细胞可通过其强大的旁分泌功能来发挥其促增殖作用，外泌体可能是其促进MC3T3-E1细胞增殖的一大重要因素。茜素红染色结果显示在人牙周膜干细胞来源外泌体刺激下，成骨诱导14 d后MC3T3-E1细胞表现出有更多的钙结节形成，说明人牙周膜干细胞来源外泌体能够促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。该研究检测到人牙周膜干细胞来源外泌体促进了MC3T3-E1细胞内MEK和ERK分子的磷酸化，推测人牙周膜干细胞来源外泌体可能通过激活MEK/ERK信号通路来发挥促MC3T3-E1细胞增殖及分化作用。

综上所述，该研究通过体外实验验证了人牙周膜干细胞来源外泌体能促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化，为牙周疾病及骨缺损修复的进一步研究及临床治疗提供了参考依据。但对于人牙周膜干细胞来源外泌体具体通过传递哪些内容物来发挥作用不得而知，后续还将进一步对人牙周膜干细胞来源外泌体成分进行深入分析，筛选出外泌体中调控MC3T3-E1功能的重要分子，为进一步阐明其分子机制提供线索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
牙周膜干细胞来源外泌体：在牙周膜干细胞体外培养过程中，分泌到培养基中的一种直径在30-120 nm间的纳米级囊泡物，内含有蛋白质、脂质、DNA、编码和非编码RNA及代谢物等生物学活性物质。
MC3T3-E1细胞：小鼠胚胎成骨细胞前体细胞系，形态为成纤维细胞样，有多个亚克隆，可以作为体外研究成骨细胞分化的良好模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

牙周膜干细胞是存在于牙周膜组织中的一类的间充质干细胞，具有良好的成骨能力，是牙槽骨修复的重要的种子细胞之一。有研究表明，牙周膜干细胞及其条件培养液在体外均具有促进成骨细胞增殖和分化的功能。但目前为止，牙周膜干细胞来源外泌体在MC3T3-E1细胞体外增殖及成骨分化中的作用尚不清楚。该研究通过超速离心分离的牙周膜干细胞来源外泌体，探究其对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的影响。 

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