建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案

doi:10.12307/2022.964

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (1): 28-33.doi: 10.12307/2022.964

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案

黄文俊1，2，3，4，5，周亚飞1，2，3，4，5，王洁1，2，3，4，5，李环1，2，3，4，5，张艳敏1，2，3，4，5，周锐1，2，3，4，5

1陕西省儿童疾病精准医学重点实验室，陕西省西安市 710002；2西安市儿童健康与疾病重点实验室，陕西省西安市 710002；3陕西省儿科疾病研究所，陕西省西安市 710002；4西安市儿童医院，陕西省西安市 710002；5西安交通大学附属儿童医院，陕西省西安市 710002

收稿日期:2021-12-01 接受日期:2022-01-25 出版日期:2023-01-08 发布日期:2022-06-06
通讯作者: 周锐，生物学博士，副研究员，陕西省儿童疾病精准医学重点实验室，陕西省西安市 710002；西安市儿童健康与疾病重点实验室，陕西省西安市 710002；陕西省儿科疾病研究所，陕西省西安市 710002；西安市儿童医院，陕西省西安市 710002；西安交通大学附属儿童医院，陕西省西安市 710002
作者简介:黄文俊，女，1983年生，四川省德阳市人，汉族，2011年四川大学毕业，药理学硕士，助理研究员，主要从事基于诱导多能干细胞的遗传罕见病机制及治疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81974014)，项目负责人：张艳敏；西安市卫生健康委员会卫生科研人才项目——面上培育项目(2022ms08)，项目负责人：周锐

Establishment and identification of a protocol for highly efficient differentiation of hepatocytes from human pluripotent stem cells

Huang Wenjun1, 2, 3, 4, 5, Zhou Yafei1, 2, 3, 4, 5, Wang Jie1, 2, 3, 4, 5, Li Huan1, 2, 3, 4, 5, Zhang Yanmin1, 2, 3, 4, 5, Zhou Rui1, 2, 3, 4, 5

1Key Laboratory of Precision Medicine to Pediatric Diseases of Shaanxi Province, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; 2Xi’an Key Laboratory of Children’s Health and Diseases, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; 3Shaanxi Institute for Pediatric Diseases, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; 4Xi’an Children’s Hospital, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; 5Affiliated Children’s Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China

Received:2021-12-01 Accepted:2022-01-25 Online:2023-01-08 Published:2022-06-06
Contact: Zhou Rui, Doctor of Biology, Associate researcher, Key Laboratory of Precision Medicine to Pediatric Diseases of Shaanxi Province, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Xi’an Key Laboratory of Children’s Health and Diseases, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Shaanxi Institute for Pediatric Diseases, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Xi’an Children’s Hospital, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Affiliated Children’s Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China
About author:Huang Wenjun, Master, Assistant researcher, Key Laboratory of Precision Medicine to Pediatric Diseases of Shaanxi Province, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Xi’an Key Laboratory of Children’s Health and Diseases, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Shaanxi Institute for Pediatric Diseases, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Xi’an Children’s Hospital, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China; Affiliated Children’s Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81974014 (to ZYM); Xi'an Municipal Health Commission Health Research Talent Project—General Cultivation Project, No. 2022ms08 (to ZR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
人诱导多能干细胞：通过将转录因子组合(Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc)导入到终末分化体细胞使其诱导重编程为与胚胎干细胞特性高度类似的细胞类型，具备三胚层分化潜能和自我更新能力的同时，还具备无伦理争议、可个性化获取以及无免疫排斥等优点，因此具有巨大的临床应用潜力。

背景：人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞特性高度类似的多能干细胞类型，具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力。将人诱导多能干细胞定向分化成具备功能的肝脏细胞对临床肝脏替代治疗意义重大。
目的：建立一种高效的基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案。
方法：利用明场显微镜、免疫荧光对人诱导多能干细胞特性进行鉴定。通过转录因子重组蛋白手段时序性调控不同信号通路，即在第0，5，10，15天顺序加入激活素A、成纤维细胞生长因子4/骨形态发生蛋白4、肝细胞生长因子、肿瘤抑制因子M，使多能干细胞经历终末内皮层、肝内胚层、肝母细胞(肝脏前体细胞)最终分化成为有功能的肝脏细胞。利用明场显微镜、实时定量PCR(qPCR)、ELISA动态观察不同阶段形态特征和分子标记物。
结果与结论：①所使用的人诱导多能干细胞具备经典的诱导多能干细胞形态特征并且高表达诱导多能干细胞特异标记蛋白(SSEA4、SOX2、OCT4)；②人诱导多能干细胞发生了终末内胚层、幼稚肝细胞、肝脏细胞不同阶段形态转变；③qPCR结果显示，随着肝细胞分化进展，诱导多能干细胞特异标记物(OCT4)显著下调，终末内胚层(GCS、CXCR4)和肝脏内胚层标记物(HNF4α、HNF1β)则呈现先升高再下调趋势，而肝脏细胞标记物(CYP34A、ALB)则呈现出逐渐递增趋势；④ELISA结果进一步显示，诱导15 d以后的肝脏细胞开始具备肝特异蛋白(白蛋白、尿素)分泌功能，并且随着时间延长其分泌功能进一步增加；⑤上述结果提示，成功建立人诱导多能干细胞向肝脏细胞定向分化的实验方案，为未来临床肝脏细胞替代治疗提供实验基础。
缩略语：人诱导多能干细胞：human pluripotent stem cells，hiPSC

https://orcid.org/0000-0001-7638-1442 (周锐)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人诱导多能干细胞, 肝脏细胞, 分化, 终末内胚层, 肝脏内胚层, 肝母细胞

Abstract: BACKGROUND: Similar to the human embryonic stem cells, human induced pluripotent stem cells possess the ability to differentiate into three germ layers and self-renewal capacity. It is of great clinical significance to generate functional hepatocytes from human induced pluripotent stem cells.
OBJECTIVE: To establish a protocol for the directed differentiation into hepatocytes from human induced pluripotent stem cells.
METHODS: Human induced pluripotent stem cells were characterized by a microscope and immunofluorescence. Pluripotent stem cells were differentiated into definitive endoderm, hepatic endoderm, hepatoblasts, and finally functional hepatocytes via sequential modulation of the signaling pathways using recombinant transcription factors. That was, activin A, fibroblast growth factor 4/bone morphogenetic protein 4, hepatocyte growth factor, and tumor suppressor M were added sequentially on days 0, 5, 10, and 15. The morphological features and molecular markers at different stages were dynamically observed by microscopy, real-time quantitative PCR, and ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The human induced pluripotent stem cells exhibited the typical morphology of pluripotent stem cells and expressed high-levels of the induced pluripotent stem cells-specific markers, SSEA4, SOX2, and OCT4. (2) The human induced pluripotent stem cells were successfully induced sequentially into definitive endoderm cells, hepatoblasts, and hepatocytes. (3) Real-time quantitative PCR showed that with the progression of hepatocyte differentiation, the expression of induced pluripotent stem cells marker (OCT4) was decreased. The expression levels of definitive endoderm (GCS and CXCR4) and hepatic endoderm (HNF4α and HNF1β) markers were increased and then decreased. The expression of hepatocyte markers (CYP34A and ALB) was gradually increased. (4) ELISA results further showed that the hepatocytes after 15 days of induction began to secrete liver-specific proteins (albumin and urea), and their secretory function further increased with the prolongation of time. (5) We conclude that a protocol for differentiation of hepatocytes from human induced pluripotent stem cells was successfully established, which provides an unlimited source of hepatocytes for liver regeneration.

Key words: human induced pluripotent stem cell, hepatocyte, differentiation, definitive endoderm, hepatic endoderm, hepatoblast

中图分类号:

黄文俊, 周亚飞, 王洁, 李环, 张艳敏, 周锐. 建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 28-33.

Huang Wenjun, Zhou Yafei, Wang Jie, Li Huan, Zhang Yanmin, Zhou Rui. Establishment and identification of a protocol for highly efficient differentiation of hepatocytes from human pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(1): 28-33.

图/表（结果） 5

2.1 hiPSCs表型鉴定结果明场显微镜下显示hiPSCs呈现经典的诱导多能干细胞特征，表现为hiPSCs克隆边缘光滑，克隆内细胞排列致密，细胞呈圆形、边界清晰，核仁明显且核质比高。免疫荧光图片显示hiPSCs核转录因子OCT4和SOX2高水平特异性表达在细胞核中，而hiPSCs特异膜蛋白SSEA4定位在细胞膜上且呈现强信号。上述结果均符合hiPSCs特征，见图1。

2.2 hiPSCs向肝脏细胞定向分化过程中形态变化在前期发表文献基础之上[18-19]，优化并建立新的hiPSCs定向分化肝脏细胞方案。如图2分化步骤示意图所示，通过依次应用激活素A、骨形态发生蛋白4/成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子使hiPSCs经历终末内胚层、肝内胚层、肝母细胞进而转变成幼稚的肝细胞，随即在肿瘤抑制因子M作用下使其进一步成熟。如图3明场显微镜下观察显示，随着分化进程，细胞形态经历了明显的变化，表现为从第0天的经典hiPSCs形态，如高核质比、核仁明显和细胞边缘清晰，到第5天终末内胚层细胞和第15天肝母细胞，二者均为典型上皮细胞，但明显失去了hiPSCs的特征形态。到第15天以后开始出现经典的肝脏细胞形态，呈多边形，细胞核大且圆、居中，上述结果初步提示肝细胞分化成功。

2.3 利用qPCR动态检测不同细胞阶段标记物mRNA水平利用qPCR在第0，5，10，15天4个时间节点检测不同细胞分化阶段标记物，结果显示，hiPSCs特异标记物OCT4第0天表达最高，随时间呈现递减趋势，第10天(P < 0.05)和第15天(P < 0.01)具有显著性差异；终末内胚层标记物GCS(P < 0.01)、CXCR4(P < 0.05)在第5天表达骤升，随后在第10天(GCS，P < 0.01；CXCR4，P < 0.05)和第15天(P < 0.05)明显下调；肝内胚层标记物HNF4A、HNF1β在第10天表达显著升高(P < 0.05)，随后HNF1β在第15天明显下降(P < 0.05)；而肝细胞标记物CYP34A、ALB在第15天显著上调(P < 0.05)。上述标记物表达动态变化情况均同体外肝脏细胞分化发育阶段相对应，进一步提示肝细胞分化成功，见图4。

2.4 利用免疫荧光和ELISA检测肝脏细胞特异标记物蛋白水平利用免疫荧光检测第15天时肝细胞特异标记物AFP，结果显示AFP信号定位在细胞核中，呈现强阳性率。利用ELISA分别对第15，25，30，35天细胞上清中的白蛋白和尿素进行检测，结果显示，在第15天时上清中白蛋白和尿素呈现低水平表达，随着分化进展细胞上清中二者含量均递增且在第35天达到最大(第25，30天， P < 0.05；第35天，P < 0.01)。上述结果进一步证实肝细胞分化成功。见图5。

参考文献

[1] STRUECKER B, RASCHZOK N, SAUER IM. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2014;11(3):166-176.
[2] 黄文峰,张小玲,谢志军,等.肝移植的研究进展及常见并发症处理[J].中国组织工程研究,2012,16(5):907-910.
[3] REHBACH K, FERNANDO MB, BRENNAND KJ. Integrating CRISPR Engineering and hiPSC-Derived 2D Disease Modeling Systems. J Neurosci. 2020;40(6):1176-1185.
[4] RAASCH M, FRITSCHE E, KURTZ A, et al. Microphysiological systems meet hiPSC technology-New tools for disease modeling of liver infections in basic research and drug development. Adv Drug Deliv Rev. 2019;140:51-67.
[5] TAKAHASHI K, TANABE K, OHNUKI M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007; 131(5):861-872.
[6] HAN JK, SHIN Y, KIM HS. Direct Conversion of Cell Fate and Induced Endothelial Cells. Circ J. 2021. doi: 10.1253/circj.CJ-21-0703. Online ahead of print.
[7] TANI H, TOHYAMA S, KISHINO Y, et al. Production of functional cardiomyocytes and cardiac tissue from human induced pluripotent stem cells for regenerative therapy. J Mol Cell Cardiol. 2021;164:83-91.
[8] WANG J, REN H, LIU Y, et al. Bioinspired Artificial Liver System with hiPSC-Derived Hepatocytes for AcuteLiver Failure Treatment. Adv Healthc Mater. 2021;10(23):e2101580.
[9] MOKHAMES Z, REZAIE Z, ARDESHIRYLAJIMI A, et al. Efficient smooth muscle cell differentiation of iPS cells on curcumin-incorporated chitosan/collagen/polyvinyl-alcohol nanofibers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2020;56(4):313-321.
[10] SIN YY, BALLANTYNE LL, RICHMOND CR, et al. Transplantation of Gene-Edited Hepatocyte-like Cells Modestly Improves Survival of Arginase-1-Deficient Mice. Mol Ther Nucleic Acids. 2018;10:122-130.
[11] NIE YZ, ZHENG YW, OGAWA M, et al. Human liver organoids generated with single donor-derived multiple cells rescue mice from acute liver failure. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):5.
[12] OKAMOTO R, TAKAYAMA K, AKITA N, et al. Human iPS Cell-based Liver-like Tissue Engineering at Extrahepatic Sites in Mice as a New Cell Therapy for Hemophilia B. Cell Transplant. 2018;27(2):299-309.
[13] RASHIDI H, LUU NT, ALWAHSH SM, et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Arch Toxicol. 2018;92(10):3117-3129.
[14] TAKAYAMA K, AKITA N, MIMURA N, et al. Generation of safe and therapeutically effective human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for regenerative medicine. Hepatol Commun. 2017;1(10):1058-1069.
[15] NAGAMOTO Y, TAKAYAMA K, OHASHI K, et al. Transplantation of a human iPSC-derived hepatocyte sheet increases survival in mice with acute liver failure. J Hepatol. 2016;64(5):1068-1075.
[16] ASGARI S, MOSLEM M, BAGHERI-LANKARANI K, et al. Differentiation and transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells. Stem Cell Rev Rep. 2013;9(4):493-504.
[17] LIU H, KIM Y, SHARKIS S, et al. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 2011;3(82):82ra39.
[18] TOBA Y, DEGUCHI S, MIMURA N, et al. Comparison of commercially available media for hepatic differentiation and hepatocyte maintenance. PLoS One. 2020;15(2):e0229654.
[19] SI-TAYEB K, NOTO FK, NAGAOKA M, et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 2010;51(1):297-305.
[20] PAUKLIN S, VALLIER L. Activin/Nodal signalling in stem cells. Development. 2015;142(4):607-619.
[21] KALLI M, MPEKRIS F, WONG CK, et al. Activin A Signaling Regulates IL13Rα2 Expression to Promote Breast Cancer Metastasis. Front Oncol. 2019;9:32.
[22] TIRUTHANI K, SARKAR P, RAO B. Trophoblast differentiation of human embryonic stem cells. Biotechnol J. 2013;8(4):421-433.
[23] YANG J, JIANG W. The Role of SMAD2/3 in Human Embryonic Stem Cells. Front Cell Dev Biol. 2020;8:653.
[24] ARNOLD SJ, ROBERTSON EJ. Making a commitment: cell lineage allocation and axis patterning in the early mouse embryo. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(2):91-103.
[25] D’AMOUR KA, AGULNICK AD, ELIAZER S, et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005;23(12):1534-1541.
[26] KUBO A, SHINOZAKI K, SHANNON JM, et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 2004; 131(7):1651-1662.
[27] VALLIER L, TOUBOUL T, BROWN S, et al. Signaling pathways controlling pluripotency and early cell fate decisions of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 2009;27(11):2655-2666.
[28] VALLIER L, TOUBOUL T, CHNG Z, et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PLoS One. 2009;4(6):e6082.
[29] GOUON-EVANS V, BOUSSEMART L, GADUE P, et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2006;24(11):1402-1411.
[30] ZARET KS, GROMPE M. Generation and regeneration of cells of the liver and pancreas. Science. 2008;322(5907):1490-1494.
[31] HUANG H, RUAN H, AW MY, et al. Mypt1-mediated spatial positioning of Bmp2-producing cells is essential for liver organogenesis. Development. 2008;135(19):3209-3218.
[32] CAI J, ZHAO Y, LIU Y, et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 2007;45(5):1229-1239.
[33] SI-TAYEB K, LEMAIGRE FP, DUNCAN SA. Organogenesis and development of the liver. Dev Cell. 2010;18(2):175-189.
[34] SNYKERS S, DE KOCK J, ROGIERS V, et al. In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art. Stem Cells. 2009;27(3):577-605.
[35] YOSHIMURA A, ICHIHARA M, KINJYO I, et al. Mouse oncostatin M: an immediate early gene induced by multiple cytokines through the JAK-STAT5 pathway. EMBO J. 1996;15(5):1055-1063.
[36] DANOY M, TAURAN Y, POULAIN S, et al. Analysis of hiPSCs differentiation toward hepatocyte-like cells upon extended exposition to oncostatin. Differentiation. 2020;114:36-48.
[37] CHIKADA H, ITO K, YANAGIDA A, et al. The basic helix-loop-helix transcription factor, Mist1, induces maturation of mouse fetal hepatoblasts. Sci Rep. 2015;5:14989.

引言

肝移植是当前终末期肝病治疗的唯一有效方法，但面临肝来源短缺、免疫排斥以及术后需要终生服药等问题[1-2]，获取足够多的有功能的肝脏细胞有望为未来肝脏替代性治疗提供充足的种子细胞。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)是一类通过导入多能重编程因子到终末分化体细胞(例如外周血单核细胞或者皮肤成纤维细胞)使其重编程为与胚胎干细胞性状类似的多能干细胞类型，即拥有自我更新和三胚层多向分化潜能[3-5]。由于其无伦理束缚和移植免疫排斥，因此一经报道就被广泛应用研究且被认为是未来最具应用潜力的干细胞类型[6-9]。

随着hiPSCs定向分化肝脏细胞方案的不断提高和优化，动物体内开展肝脏损伤治疗的应用研究也取得了较理想的治疗效果[10-17]。hiPSCs来源肝脏细胞植入动物体内包括原位移植和异位移植，前者包括静脉注射[16-17]、肝细胞成片移植[15]、脾脏内注射[10，14]，后者主要包括肾包膜下和皮下移植[11-13]。肝脏疾病模型以药物或基因敲除等诱发的急慢性肝脏损伤为主[10-11，13-15，17]，而动物模型以小鼠为主。上述研究均显著提高了肝损伤模型动物的存活率，提示其在未来临床肝脏替代治疗中的应用潜力。

该研究旨在构建一种基于hiPSCs的肝脏细胞定向分化方案，通过重组蛋白转录因子手段时序性调控不同信号通路使得hiPSCs依次经历终末内胚层、肝脏内胚层、肝母细胞(肝脏前体干细胞)、幼稚肝细胞最终到功能相对成熟的肝脏细胞。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。实验数据运用Graphpad软件进行多组间one-way ANOVA分析。
1.2 时间及地点实验于2021年3-8月在西安交通大学附属儿童医院陕西省儿科疾病研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 hiPSCs系(LHPB-YaabC3，中国)，由未来智人再生医学研究院(广州)有限公司友情赠送。实验方案经西安交通大学医学部伦理委员会批准，批准号为2019-599。
1.3.2 实验试剂和仪器 hiPSCs维持培养基BIOCISO(未来智人，中国)；RPMI/1640培养基、DMEM/F12培养基(BI，以色列)；B27添加物、GlutaMAX(Thermo，美国)；重组蛋白激活素A、重组蛋白骨形态发生蛋白4、重组蛋白成纤维细胞生长因子4、重组蛋白肝细胞生长因子、重组蛋白肿瘤抑制因子M(Pepro Tech，美国)；小鼠来源一抗SSEA4、大鼠来源一抗SOX2、兔源一抗OCT4、兔源一抗AFP、山羊抗大鼠Alexa Fluor Plus 555荧光二抗、山羊抗兔Alexa Fluor Plus 488荧光二抗、山羊抗小鼠Alexa Fluor Plus 555荧光二抗、山羊抗兔Alexa Fluor Plus 555荧光二抗、抗淬灭封固剂(含 DAPI)(Invitrogen，美国)；RNA提取试剂盒(Tiangen，中国)；cDNA反转录试剂盒、QuantiTect SYBR® Green PCR试剂盒(Takara，日本)；肝细胞维持培养基(LONZA，美国)；人白蛋白ELISA试剂盒(Invitrogen，美国)；尿素分析试剂盒(Abcam，美国)；引物合成(擎科生物，中国)；低温台式离心机(Gene，美国)；倒置明场相差显微镜及拍照系统(巴玖，中国)；共聚焦荧光显微镜(Olympus，日本)；超净工作台(Thermo，美国)；CO2恒温培养箱(Thermo，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 hiPSCs维持培养将形态典型状态良好的hiPSCs培养在基质胶预处理(1∶50稀释)过的含BIOCISO培养基的培养皿中，待细胞融合度在70%-80%时，使用0.02% EDTA以1∶4-1∶7比例进行传代或进行下游分化实验。
1.4.2 hiPSCs定向分化肝脏细胞取hiPSCs(第40-50代之间)以1.0×105/孔数量接种于12孔板，融合度近100%时(记为0 d)开始分化：①肝细胞分化阶段(第0-15天)：该阶段使用的基础培养基为RPMI/1640(含1×B27和1×GlutaMAX)。以100 μg/L 激活素A作用5 d(第0-5天)，以20 μg/L 骨形态发生蛋白4和20 μg/L成纤维细胞生长因子4作用5 d(第6-10天)，再以20 μg/L 肝细胞生长因子作用5 d(第11-15天)。②肝细胞成熟阶段(第16-35天)：更换含20 μg/L肿瘤抑制因子M的肝细胞维持培养基。
1.4.3 hiPSCs向肝脏细胞分化不同阶段观察细胞形态在hiPSCs向肝脏细胞分化的第0，5，15，25，30，35天动态观察细胞形态变化并拍照记录。
1.4.4 免疫荧光检测hiPSCs和肝脏细胞标记物取维持培养第3天的hiPSCs和分化第15天的肝脏细胞进行实验。使用40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，DPBS洗脱3次，每次5 min，封闭缓冲液(1X PBS/5% BSA/0.03% Triton X-100)封闭30 min，加入一抗[兔抗OCT3/4单克隆抗体(1∶100)、大鼠抗SOX2单克隆抗体(1∶200)、小鼠抗SSEA4单克隆抗体(1∶200)、兔抗AFP多克隆抗体(1∶50)]，4 ℃孵育过夜，加入二抗[Alexa Fluor555山羊抗兔二抗(1∶500)、Alexa Fluor488山羊抗兔二抗(1∶500)、Alexa Fluor555山羊抗小鼠(1∶500)、Alexa Fluor555山羊抗大鼠(1∶500)]，室温避光1 h。使用含DAPI抗淬灭剂复染封固，荧光显微镜观察成像。
1.4.5 ELISA检测肝脏细胞特异分泌蛋白水平分化后第15，25，30，35天检测。

(1)使用Albumin Human ELISA Kit利用双抗体夹心法检测分化肝细胞上清中的白蛋白水平。将细胞上清、阳性对照、阴性对照样品加入到预先包被白蛋白抗体的96孔板中，加入生物素标记的白蛋白抗体进一步结合被捕获的目的蛋白，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶进一步结合生物素，终止反应后在酶标仪450 nm波段检测吸光度，通过标准品对应吸光度值绘制标准曲线计算检测样品中的白蛋白水平。

(2)使用Urea Assay kit利用比色法检测肝细胞上清中尿素水平。将50 μL反应混合液加入到含有50 μL细胞上清、阳性对照96孔板中，同时设置空白组，即50 μL背景反应混合液(去除酶成分)加入到细胞上清中，室温避光反应60 min，利用酶标仪在570 nm波段检测吸光度值，通过标准品对应吸光度值绘制标准曲线计算检测样品中尿素水平。
1.4.6 qPCR检测hiPSCs和肝脏细胞分化不同阶段标记物取分化不同时间节点的细胞(第0，5，10，15天)，采用qPCR法检测各细胞分化不同阶段标记物。使用RNAsimple总RNA提取试剂盒提取RNA，用Nanodrop测量RNA浓度，使用PrimeScript™ RT Master Mix制备cDNA。采用TB Green Fast qPCR Mix试剂盒进行qPCR反应检测基因表达，PCR反应程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸15 s，40个热循环。熔解曲线：95 ℃、2 min，60 ℃、20 s，95 ℃、15 s，从60 ℃缓慢加热到99 ℃。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt计算各基因相对表达量，引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①hiPSCs、终末内胚层、肝母细胞、肝脏细胞特异形态特征；②分化进展过程中 (hiPSCs、终末内胚层、肝内胚层、肝母细胞、肝脏细胞)实时定量PCR检测对应阶段细胞特异标记物；③肝脏细胞分化后不同时间点ELISA检测肝脏细胞合成分泌的白蛋白、尿素水平。
1.6 统计学分析实验数据均用x±s表示，运用GRAPHPAD软件进行多组间one-way ANOVA分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过西安交通大学医学院统计学专家审核。

讨论

肝脏移植是临床终末期肝病的唯一有效治疗手段，但严重受制于肝源不足[1-2]。2007年日本科学家山中伸弥通过建立重编程技术首次获得hiPSCs，因其具备胚胎干细胞的特性，包括自我更新和三胚层分化潜能，且无体内移植免疫排斥，因此被认为是器官组织替代治疗的理想种子细胞[5]。该研究建立了一种基于hiPSCs定向肝脏细胞分化的实验方案。通过时序性加入转录因子重组蛋白激活素A、骨形态发生蛋白4/成纤维细胞生长因子4、肝细胞生长因子和肿瘤抑制因子M调控对应信号通路使得hiPSCs依次向终末内胚层、肝内胚层、肝母细胞、幼稚细胞到最终相对成熟肝细胞命运转变。与之相对应，细胞形态和标记物mRNA水平均随分化进展经历了与之相对应的变化过程。分化的肝脏细胞随时间进展其特异标记物合成分泌水平显著增加。综上，提示成功建立基于hiPSCs的肝脏细胞定向分化方案。

胚胎肝脏分化发育经历肝细胞特化和肝细胞成熟两个阶段，其中激活素A、骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子通路介导了肝细胞的特化阶段。激活素 A信号通路介导的内胚层分化是决定hiPSCs能否高效分化成肝脏细胞的关键。激活素 A属于转化生长因子β超家族成员，通过与细胞膜上杂合二聚的Ⅰ、Ⅱ型激活素受体结合，后者募集磷酸化Smad家族复合物，激活的后者进入细胞核作为转录因子发挥基因表达调控作用[20-21]。激活素 A介导的信号通路发挥广泛的生物学功能，包括机体发育、分化、细胞增殖、迁移以及机体免疫效应等[22-23]。研究发现胚胎内胚层发育依赖于激活素 A信号通路[24-26]，而阻断激活素 A信号则显著抑制了内胚层标记物表达水平，相反促进了胚胎向中胚层方向分化[25]。该研究在分化早期(第0-5天)加入100 μg/L 激活素A实现了高效的hiPSCs向终末内胚层命运转变，表现为从第0天到第5天hiPSCs的标记物OCT4表达显著下调而终末内胚层标记物GCS、CXCR4表达水平显著提高。与之相对应，细胞也发生了明显的形态变化。需要注意的是，不同的hiPSCs其最适合的激活素 A浓度需要优化。激活素 A除了具备促内胚层分化还具备维持多能干细胞的干性，即抑制多能干细胞分化[27-28]，且有一定的细胞毒性。因此，在使用不同的hiPSCs或者胚胎干细胞进行肝脏细胞定向分化时，摸索出最佳的激活素 A浓度是分化成败与否或者分化效率高低的最核心要素。骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子通路在终末内胚层向肝脏内胚层分化过程中发挥至关重要的作用[29-32]。此外发现二者联合应用通过上调肝脏相关基因表达从而促进肝脏内胚层特化[32]。故研究中采用了骨形态发生蛋白4/成纤维细胞生长因子4联合作用方式实现高效的肝脏内胚层特化。

肝细胞生长因子和肿瘤抑制因子M介导的信号通路在肝细胞成熟阶段发挥重要作用[33]。前者能够促进肝母细胞和幼稚肝脏细胞的增殖[34]，而后者则在肝脏细胞的成熟过程中不可或缺[35]。由于体外获得结构和功能成熟的肝脏细胞是细胞替代治疗是否有效的前提基础，故研究中在幼稚肝细胞到成熟肝细胞阶段添加了肿瘤抑制因子M，结果显示相较于幼稚阶段(第15天)，加入肿瘤抑制因子M显著增加了肝细胞特异蛋白(白蛋白和尿素)的分泌能力，并且呈现时间递增趋势。由此，该研究进一步证实了肿瘤抑制因子M在hiPSCs定向分化肝细胞成熟过程中的促进作用[36-37]。

综上，该研究建立了一种相对高效的基于hiPSCs肝脏细胞定向分化的实验方案。通过时序性调控不同信号通路，诱导hiPSCs经过终末内胚层、肝内胚层、肝脏前体细胞，最终定向分化到功能相对成熟的肝脏细胞，为临床肝脏细胞替代治疗提供了实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案

Establishment and identification of a protocol for highly efficient differentiation of hepatocytes from human pluripotent stem cells

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[1]	代香林, 张文凤, 姚喜军, 商佳琪, 黄秋瑾, 任怡帆, 邓久鹏. 钛酸钡/聚乳酸复合压电薄膜材料对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和成骨分化能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 367-373.
[2]	李睿, 刘珍, 郭子歌, 卢瑞杰, 王晨. 纯钛表面载阿司匹林微球与聚多巴胺复合涂层促进成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 374-379.
[3]	兰倩, 辜仰聪, 肖欣, 毕雪婷, 李娜. 人牙周膜干细胞来源外泌体干预成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 54-58.
[4]	席花蕾, 薛冰, 徐婉秋, 许晓航, 姚丽红, 王秀梅. 牙髓干细胞神经向分化及神经标记物的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 91-98.
[5]	张璟岚, 张滨婧, 陈艺菲, 张辰玥, 胡芝爱, 胡海琨. 磁场对间充质干细胞成骨的生物学效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 145-151.
[6]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[7]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.
[8]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[9]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[12]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.
[13]	熊挺淋, 应梦慧, 张丽莎, 张晓刚, 杨燕. 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1063-1067.
[14]	杨斯迪, 王倩, 许诺, 王榕焓, 靳传奇, 陆颖, 董明. 上调骨形态发生蛋白2促进成骨细胞增殖分化的硅酸钙类材料Biodentine[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 516-520.
[15]	沈佳华, 付勇. 基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 604-609.