扫描电镜下可见，纯钛表面相对光滑，仅可见抛光留下的细小纹理；经过多巴胺修饰后，钛表面出现沉积物及颗粒状突起，说明多巴胺牢固聚合于纯钛表面；阿司匹林纳米微球固定后，可见纳米微球固定于钛表面，阿司匹林纳米微球呈圆球形，粒径分布均匀。纯钛组接触角为(81±2)°，聚多巴胺涂层组接触角为(35±4)°，阿司匹林微球涂层组接触角为(41±3)°，多巴胺涂层组与阿司匹林微球涂层组的亲水性均明显大于纯钛组(P < 0.05)，阿司匹林微球涂层组亲水性略低于多巴胺组(P < 0.05)。
2.2   钛表面阿司匹林微球涂层释药曲线   阿司匹林微球涂层的体外释放曲线结果如图2 所示，涂层在经历前3 d的初期药物突释后，随着释药时间的增长，阿司匹林的释放开始明显减缓；在随后的15 d中仍有阿司匹林从涂层中缓慢释放，累计释放率约为80%。



2.3   各组钛片表面细胞黏附形态观察   见图3。

细胞接种于钛片表面72 h后，在激光共聚焦显微镜下观察细胞的黏附状态，细胞核被DAPI染为明亮的蓝色，肌动蛋白丝位于细胞质内被鬼笔环肽染为红色。纯钛组细胞伸展不充分，细胞突起较少；聚多巴胺涂层组细胞开始伸展；阿司匹林微球涂层组细胞铺展更充分，可见不规则的突起向各方向伸展，显示出较多的丝状伪足及触角。
2.4   各组钛片表面细胞增殖能力   见图4。

通过图4可以看出，3组钛片表面的细胞从第1-7天均表现出持续的增殖趋势，各组的吸光度值均增大。培养1 d后，各组钛片表面细胞的增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养5，7 d后，阿司匹林微球涂层组的细胞增殖能力强于纯钛组和聚多巴胺涂层组(P < 0.05)，说明该涂层具有较好的生物相容性，更能促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖。
2.5   各组钛片表面细胞的成骨分化能力   
2.5.1   碱性磷酸酶染色   见图5。阿司匹林微球涂层组表面被染成蓝紫色的细胞数量最多，聚多巴胺涂层组表面次之，纯钛组表面最少，可见阿司匹林微球涂层修饰的钛表面更能促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化。



2.5.2   免疫荧光染色   见图6。

碱性磷酸酶是一种成骨特异性基质蛋白，是成骨细胞生成的早期标记。纯钛组表面细胞表达碱性磷酸酶相对较弱，阿司匹林微球涂层组表面细胞碱性磷酸酶染色最为致密，显示最高的荧光强度，可见阿司匹林微球涂层组大量成骨细胞被特异性染色。
2.6   改性处理钛片的细胞相容性   由CCK-8实验、细胞骨架染色及成骨分化能力检测实验可知，阿司匹林微球涂层钛片具有良好的细胞相容性。

目前种植义齿修复在牙列缺损或牙列缺失的治疗中被广泛应用。钛及钛合金因具有优异的机械性能和良好的生物学性能成为目前应用最广的一种植入材料[1]，但是钛金属具有生物惰性，骨诱导能力较弱，植入早期主要依靠与其周围骨组织形成的机械锁合提供固位力，易导致种植体松动、脱落[2-3]。种植体与其周围骨组织形成良好的骨结合是实现种植义齿修复基本的生物学保障[4-5]，因此寻求合适的改性方法以提高钛表面的骨结合能力是目前研究的关键问题。此次实验尝试通过构建涂层对钛种植体进行表面改性，以增强其成骨活性。

表面涂层改性技术主要有等离子喷涂、酸蚀喷砂、电化学处理等，但这些方法存在操作过程繁琐、反应条件复杂及可能改变材料原有性能等缺点[6]。近年来，以聚多巴胺为中间层介导的表面涂层技术弥补了以上不足[7]。在弱碱性环境中，多巴胺可以在几乎所有材料表面形成具有黏附特性的聚多巴胺涂层，同时其表面一系列官能团为材料表面的二次修饰提供了活性平台[8-9]。

为了增强钛种植体与周围骨组织的结合能力，在多巴胺涂层表面搭载活性物质制备复合涂层是此次实验的创新思路。阿司匹林是一种经典的非类固醇类药物，被广泛用于缓解发热、炎症和疼痛[10]。近年来越来越多的研究发现，阿司匹林在调节骨重塑和骨骼再生过程中发挥了重要作用[11-13]，然而，将阿司匹林直接负载于种植体表面存在药物释放不受控制且浓度无法维持等问题，因此，需要寻找合适的载体以实现药物的持续递送。微球药物递送系统是一种安全高效的药物递送系统[14]，其中，壳聚糖微球因具有价格低廉、载药量高及生物降解性等优点而被广泛应用[15-16]。

综上所述，此次实验设想在钛种植体表面构建聚多巴胺涂层，并进一步将包载阿司匹林的壳聚糖微球结合于涂层表面，以期实现化学涂层和生物化学物质结合的双重改性。研究假设钛种植体表面的复合涂层可以增强大鼠骨髓间充质干细胞的黏附活性，促进种植体与周围骨组织的相互作用。因此，此次实验对材料的表面形貌进行了表征，并将细胞接种于材料上培养，通过细胞骨架染色和免疫荧光染色检测细胞在材料表面增殖、黏附及成骨分化的能力，以分析改性后钛表面对细胞成骨活性的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   随机分组设计体外细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   材料制备于2020年10-12月在天津医科大学口腔医学院中心实验室完成，材料表征于2021年1-3月在天津医科大学基础医学研究中心完成，细胞实验于2021年4-7月在天津医科大学口腔医学院中心实验室完成。
1.3   材料   TA2级纯钛(宝鸡医用钛有限公司，陕西)；壳聚糖、三聚磷酸钠、冰醋酸(生工生物公司，上海)；阿司匹林(Sigma，美国)；大鼠骨髓间充质干细胞(中国科学院细胞库)；多巴胺、DMEM培养基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗、茜素红染液、碱性磷酸酶染色试剂盒、DAPI染液(Solarbio，北京)；CCK-8试剂盒、鬼笔环肽(碧云天生物有限公司，上海)；紫外-可见光光度计(Eppendorf Biophotometer Plus，德国)；接触角测定仪 (崇达智能科技有限公司，厦门)；扫描电镜(蔡司 Gemini 300，德国)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；激光共聚焦显微镜(蔡司LSM900，德国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验分组   将48个钛片随机分为3组，每组16个，以纯钛组作为对照组，实验组为聚多巴胺涂层组和阿司匹林微球涂层组。
1.4.2   纯钛的预处理   将纯钛片(14 mm×14 mm×1 mm)依次用400，600，800，1 000，1 200目碳化硅砂纸逐级打磨，反复交叉打磨至钛片表面呈现镜面状，然后依次用丙酮、乙醇、去离子水分别超声清洗10 min，待钛片干燥后备用。试件记为纯钛组。
1.4.3   聚多巴胺改性纯钛样品的制备   将盐酸多巴胺溶解在10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，配制成 pH=8.5、质量浓度为2 g/L的多巴胺溶液。将清洗好的纯钛浸泡在多巴胺溶液中，置于37 ℃恒温摇床，避光反应24 h后取出。用去离子水反复冲洗去除未附着的聚多巴胺，试件记为聚多巴胺涂层组。
1.4.4   包载阿司匹林壳聚糖纳米微球涂层的制备   制备1%的乙酸溶液，称取0.2 g壳聚糖粉末，溶于1%乙酸溶液中，制得浓度为0.2%的壳聚糖-冰醋酸溶液。将适量阿司匹林溶于无水乙醇中，再加入到0.2%的壳聚糖-冰醋酸溶液中。称取2 g三聚磷酸钠粉末溶于100 mL去离子水中充分搅拌，配制浓度为2%、pH值为7.0-8.0的三聚磷酸钠溶液。以1-3滴/s的速率，在磁力搅拌的条件下向加入了阿司匹林-乙醇溶液的壳聚糖-冰醋酸溶液中缓慢持续滴加三聚磷酸钠溶液，当溶液由澄清变为乳光色后停止滴加，并持续搅拌10 min。在4 ℃下1 500 r/min离心30 min，去除上清液并将剩余的沉淀吹打均匀，冻干后制得包载阿司匹林的壳聚糖纳米微球。将聚多巴胺涂层钛片浸泡在4 g/L微球悬液(溶剂为去离子水)中反应6 h，冻干后得到载阿司匹林的壳聚糖微球与聚多巴胺复合涂层钛片。试件记为阿司匹林微球涂层组。
1.4.5   材料的表征   在3组样品(每组3个)表面喷洒一层薄的金钯膜数秒后，进行扫描电镜观察。重新选择样品(每组3个)并充分干燥后，在距离样品表面约5 cm处滴加去离子水约10 μL，通过接触角测定仪进行样品表面水接触角测量。
1.4.6   纯钛表面阿司匹林纳米微球涂层缓释曲线的测定   称取一定量的包载阿司匹林壳聚糖纳米微球，浸入1 mL PBS中振荡，于第1，3，5，7，10，14天后分别收集所有的缓释液，通过紫外分光光度计测定280 nm波长下的吸光度(A)值，随后补充新鲜的1 mL PBS。根据绘制的标准曲线计算缓释液中阿司匹林的浓度，以缓释时间为横坐标、阿司匹林释放量为纵坐标，绘制包载阿司匹林壳聚糖纳米微球的体外缓释曲线。
1.4.7   大鼠骨髓间充质干细胞的培养   取SD大鼠骨髓间充质干细胞，在加入含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养。待细胞生长至铺满培养瓶或皿底部80%-90%时传代，取第3代大鼠骨髓间充质干细胞接种。
1.4.8   钛片接种骨髓间充质干细胞   

细胞骨架观察：将3组钛片分别置于24孔培养板中，每组3个样品，以2×104/孔的密度将大鼠骨髓间充质干细胞悬浮液接种到24孔板中。接种72 h 后，弃孔板中培养基，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS再次清洗3次，避光条件下向每孔加入适量鬼笔环肽染液染色1 h，PBS清洗3次。加入DAPI染液复染细胞核，PBS再清洗3次，激光共聚焦显微镜下观察细胞形态。

CCK-8测定细胞增殖：通过紫外线照射及体积分数75%乙醇对3组钛片进行消毒灭菌处理，使用无菌镊子将其转入至24孔板中。以2×104/孔的密度将大鼠骨髓间充质干细胞悬浮液接种到24孔板中。培养 1，3，5，7 d 后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，避光孵育2 h，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度值。

细胞成骨分化能力：将大鼠骨髓间充质干细胞悬浮液以2×104/孔的密度与3组钛片在24孔板中共培养。培养7 d后将原有培养基更换为成骨诱导培养基(含100 mmol/L地塞米松、10 mmol/L甘油磷酸钠和50 µmol/L的L-抗坏血酸)。①碱性磷酸酶染色：培养14 d后进行碱性磷酸酶染色，PBS洗涤细胞3次，多聚甲醛固定30 min。再次PBS洗涤，去掉多余染液，倒置荧光显微镜下观察并拍照。②免疫荧光染色：培养14 d后，用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，用0.1%TritonX-100渗透5 min。PBS洗3次后，用3%牛血清白蛋白溶液在37 ℃下封闭1 h，以阻断非特异性结合。然后将细胞与兔抗鼠碱性磷酸酶一抗(1∶400稀释)在4 ℃下孵育过夜。PBS洗3次后，与羊抗兔二抗(1∶200稀释)孵育1 h。以DAPI将细胞核染色10 min，激光共聚焦显微镜下观察细胞内的染色信号。 
1.5   主要观察指标   各组钛片的表面形貌、亲水性；包载阿司匹林壳聚糖微球的缓释曲线；各组钛片表面的细胞增殖、黏附能力及成骨相关基因的表达。
1.6   统计学分析   采用SPSS 22.0统计分析软件对所得数据进行统计学分析，定量结果均以x±s来表示。组间采用单因素方差分析，P < 0.05时认为结果差异有显著性意义。该文统计学方法已经天津医科大学生物统计学专家审核。

钛是目前临床上广泛应用的植入体材料，但其生物惰性限制了与周围骨组织形成快速稳定的结合[17]。目前对钛表面物理或化学改性的方法包括喷砂、酸蚀、等离子喷涂、电化学沉积等，可通过改变表面性能间接影响细胞行为，但对提高成骨活性的作用有限[18-20]。诱导骨形成更为有效的方法是结合生物化学处理，以改善种植体的表面活性[21]。此次实验针对钛种植体表面涂层的设计提出创新性的实验构想：制备聚多巴胺涂层以获得功能化的表面，而载有阿司匹林的壳聚糖微球可以借助聚多巴胺反应位点对纯钛表面进行二次修饰，从而对周围骨组织发挥缓慢持续的促成骨作用。此次实验的目的是通过制备出聚多巴胺和载药微球修饰的复合生物活性涂层对钛表面进行改性，增强钛与周围骨组织的结合，以期优化钛植入物在口腔种植领域的应用。

扫描电镜下可见纯钛表面明显打磨痕迹，而聚多巴胺聚合后可见块状沉积物，阿司匹林微球涂层组有大小均匀、成簇聚合的纳米粒成功结合在聚多巴胺涂层表面。聚多巴胺具有黏附特性，且表面丰富的苯醌基团能够与亲核基团如氨基(-NH2)或者巯基(-SH)发生迈克尔加成反应或者席夫碱反应[22-23]。壳聚糖微球表面的氨基可以与聚多巴胺表面的醌基发生化学反应，从而实现微球与聚多巴胺涂层的牢固结合[24]。因此，载阿司匹林的壳聚糖微球通过物理吸附和化学交联两种形式结合于多巴胺涂层表面，可有效防止载药微球从涂层表面脱落。壳聚糖载药微球的体外释放研究表明，在经历初始3 d的突释后，阿司匹林释放速率放缓并均匀稳定地持续释放14 d。这个结果表明，将壳聚糖纳米粒子制成载药微球并交联至聚多巴胺改性钛表面构建的复合涂层，不仅可以实现阿司匹林的缓慢持续释放，还可以提高药物的局部利用率。而吸附在微球表面或表面附近的药物迅速溶解并释放可能是造成药物突释的主要原因[25]。随着时间延长，壳聚糖微球缓慢降解，阿司匹林也随之释放出来并对周围的细胞发挥促成骨作用。

为了研究材料的体外生物学活性，此次实验分别在纯钛、聚多巴胺涂层钛及阿司匹林微球涂层钛表面培养大鼠骨髓间充质干细胞，在激光共聚焦显微镜下观察细胞黏附数量和铺展形态，并通过CCK-8法测定细胞的增殖活性。结果可见3组样品表面细胞均铺展生长，但细胞伸展程度不同，纯钛表面黏附细胞数量较少且伸展较差；聚多巴胺涂层组细胞形态更为伸展呈梭形，伸出少量丝状伪足与周围细胞连接；阿司匹林微球涂层组细胞层层堆叠，伸出大量丝状伪足且细胞呈扁平多角形，说明阿司匹林微球涂层更有利于细胞生长，呈现出较好的生物相容性。以往的研究表明，材料表面细胞的黏附和伸展受材料表面特性的影响，如粗糙度、亲水性及表面自由能等[26]。与之相对应，3 组材料表面形貌和接触角大小显示了材料表面粗糙度和亲水性的差异，聚多巴胺自聚合于纯钛表面后形成一个粗糙不平的面并可见接触角明显下降，而阿司匹林微球固定于表面后接触角略有增加，结果也证实了随着材料表面涂层粗糙度和亲水性的增加，细胞附着和铺展状态也随之增强。在整个培养过程中，3组材料均无明显细胞毒性，阿司匹林微球涂层组细胞增殖良好。较高的细胞黏附率也保证了大鼠骨髓间充质干细胞的存活和增殖[27]。

碱性磷酸酶活性的高低是评价骨髓间充质干细胞早期成骨分化水平的一个重要指标[28]，此次实验从细胞水平和蛋白水平测定了碱性磷酸酶的表达。根据壳聚糖载药微球体外释放实验结果，14 d内壳聚糖载药微球的累计释放曲线呈现持续增长趋势，累计释放量达总载药量的80%，因此此次实验选择测定14 d时的碱性磷酸酶表达，以观察3组材料的促成骨效果。结果可见，14 d时纯钛组表面碱性磷酸酶阳性的蓝紫色细胞数量最少，阿司匹林微球涂层组表面最多。免疫荧光染色结果显示，碱性磷酸酶蛋白的免疫荧光强度在阿司匹林微球涂层组表面最高，纯钛组表面表达最少，与碱性磷酸酶染色结果一致，说明阿司匹林微球涂层组对细胞早期成骨分化的作用最显著。促进骨髓间充质干细胞分化为成熟成骨细胞是一个非常复杂的多因素调控过程，其中经典的Wnt信号通路是一条与骨形成密切相关的通路，可以调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，并且能够间接影响破骨细胞的功能[29-31]。YAMAZA等[32]发现阿司匹林能够增强碱性磷酸酶的表达并促进磷酸化β连环蛋白降解，导致Wnt信号通路的活动增加。随后的研究中也发现加载阿司匹林的新型复合支架可以上调碱性磷酸酶等成骨相关细胞因子的表达，刺激骨髓间充质干细胞的成骨向分化[33]。此次实验仅对阿司匹林微球涂层改性钛的成骨活性进行了体外评估，对体内骨整合的影响及阿司匹林抗炎效果尚需进一步研究。

综上所述，此次实验成功在纯钛表面构建了载阿司匹林微球和聚多巴胺的复合涂层，并将大鼠骨髓间充质干细胞接种于材料上培养，检测细胞增殖水平来测定材料的细胞毒性，并进一步研究材料对细胞黏附和成骨分化的影响来评估材料的生物活性。实验结果显示，与纯钛表面相比，聚多巴胺涂层钛、阿司匹林微球涂层钛均可促进体外大鼠骨髓间充质干细胞的黏附和成骨分化。载阿司匹林微球与聚多巴胺涂层的结合可有效增强钛表面活性，在口腔种植领域中有良好的应用前景。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
微球：是将药物分散包埋在高分子聚合物中而形成的微小球状实体，其形成过程主要与不同药物在高分子聚合物中的大量溶解有关。载药微球可以缓慢释放药物，从而减少给药次数、增强药物的稳定性，发挥长期持续的治疗效果。
聚多巴胺：是由多巴胺在有氧潮湿的弱碱性环境下发生氧化自聚合反应形成的，具有很强的黏附性能，几乎可以黏附在所有材料表面。同时，聚多巴胺还含有丰富的活性基团，能够与其他生物分子发生二次反应形成涂层，从而使材料表面进一步功能化。

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钛是目前临床上广泛应用的植入体材料，但其生物惰性限制了与周围骨组织形成快速稳定的结合。表面涂层改性是改善种植体表面活性的有效方法。此次实验针对钛种植体表面涂层的设计提出创新性的实验构想：制备多巴胺涂层以获得功能化的表面，将载有阿司匹林的壳聚糖微球对纯钛表面进行二次修饰，从而对周围骨组织发挥缓慢持续的促成骨作用，以期为钛植入材料的表面改性提供新的思路。

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