六味地黄丸对钛颗粒诱导骨溶解成骨影响的机制

doi:10.12307/2023.880

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (3): 392-397.doi: 10.12307/2023.880

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

六味地黄丸对钛颗粒诱导骨溶解成骨影响的机制

朱志祺1，苑思杰1，张梓琳1，纪仕杰1，蒙明松1，颜安明2，韩婧1

1南京中医药大学药学院，江苏省南京市 210032；2解放军32251部队门诊部，福建省厦门市 361007

收稿日期:2022-10-27 接受日期:2022-12-24 出版日期:2024-01-28 发布日期:2023-07-10
通讯作者: 韩婧，药物化学博士，讲师，南京中医药大学药学院，江苏省南京市 210032
作者简介:朱志祺，女，1999年生，江苏省泰州市人，汉族，南京中医药大学药学院在读硕士，主要从事中药有效成分治疗骨科相关疾病作用及机制的研究。

Mechanism underlying the effect of Liuwei Dihuang Pill on osteolysis and osteogenesis induced by titanium particles

Zhu Zhiqi1, Yuan Sijie1, Zhang Zilin1, Ji Shijie1, Meng Mingsong1, Yan Anming2, Han Jing1

1School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210032, Jiangsu Province, China; 2PLA 32251 Unit Outpatient Department, Xiamen 361007, Fujian Province, China

Received:2022-10-27 Accepted:2022-12-24 Online:2024-01-28 Published:2023-07-10
Contact: Han Jing, PhD, Lecturer, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210032, Jiangsu Province, China
About author:Zhu Zhiqi, Master candidate, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210032, Jiangsu Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨溶解：全关节置换术是临床上用来治疗骨关节炎、类风湿性关节炎等骨科相关疾病的常用临床手段，而在假体长期的使用过程中会摩擦产生微粒，可与关节假体周围细胞相互作用，引起成骨活动减弱和破骨活动增强，从而导致骨溶解，骨溶解也被称为关节置换的“隐形杀手”。
六味地黄丸：始载于宋代钱乙《小儿药证直诀》，是滋阴补肾的经典名方，且有文献报道其具有抗炎、调节骨参数、骨密度的药效特征，并被证实具有治疗骨质疏松的作用。

背景：目前已有大量研究发现六味地黄丸可用来治疗骨质疏松，而鲜有关于六味地黄丸对磨损微粒诱导的成骨细胞分化与矿化方面的相关研究。

目的：探讨不同浓度六味地黄丸含药血清对钛颗粒诱导的小鼠MC3T3-E1成骨细胞体外骨溶解模型的积极作用。
方法：大鼠口服六味地黄丸后提取含药血清，筛选六味地黄丸含药血清和钛颗粒对MC3T3-E1细胞活力影响的最佳浓度。将MC3T3-E1细胞为3组：空白组给予成骨分化培养；模型组给予钛颗粒(5 μg/mL)+成骨分化培养；加含药血清组给予钛颗粒(5 μg/mL)+六味地黄丸含药血清(分为10%，15%，20%剂量)共培养+成骨诱导。通过CCK-8法检测成骨细胞活力，碱性磷酸酶染色检测细胞碱性磷酸酶活性，通过硝酸银(Von Kossa)和茜素红染色检测细胞矿化情况，qRT-PCR检测成骨分化相关基因Runx-2、Osterix、Ocn、Axin、ALP和Opn的表达，Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、p-GSK-3β、GSK-3β、Runx2和Osterix蛋白表达。

结果与结论：①六味地黄丸含药血清培养可以逆转钛颗粒诱导的MC3T3E-1细胞碱性磷酸酶活性的降低，增加MC3T3E-1细胞茜素红染色及钙化结节，增加MC3T3E-1细胞成骨相关基因的表达，同时提高Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达。②结果说明，六味地黄丸含药血清体外可以逆转钛颗粒对成骨细胞分化矿化的抑制作用，上调成骨相关基因的表达，其机制与调控Wnt/β-catenin信号通路相关，提示六味地黄丸有望成为防治人工关节无菌性松动的有效药物。

https://orcid.org/0000-0002-3290-2709(朱志祺)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 六味地黄丸含药血清, 成骨细胞, 骨溶解, Wnt/β-catenin, 钛颗粒

Abstract: BACKGROUND: At present, a large number of studies have found that Liuwei Dihuang Pill can be used to treat osteoporosis, but there are few related studies on the differentiation and mineralization of osteoblasts induced by wear particles using Liuwei Dihuang Pill.
OBJECTIVE: To investigate the positive effect of different concentrations of Liuwei Dihuang Pill-containing serum on titanium particle-induced mouse MC3T3-E1 osteoblast in vitro osteolysis model.
METHODS: Drug-containing serum was extracted after oral administration of Liuwei Dihuang Pill. The best concentration of Liuwei Dihuang Pill-containing serum and titanium particles on the viability of MC3T3-E1 cells was screened. MC3T3-E1 cells were divided into three groups. The blank group was given osteoblastic differentiation culture. The model group was given titanium particles (5 μg/mL) ossification culture. The drug-containing serum group was given titanium particles (5 μg/mL) + Liuwei Dihuang Pill-containing serum (10%, 15% and 20% doses). Osteoblast viability was detected by CCK-8 assay. Cell alkaline phosphatase activity was detected by alkaline phosphatase staining. Cell mineralization was detected by silver nitrate (Von Kossa) and alizarin red staining. Expression levels of bone differentiation-related genes Runx-2, Osterix, Ocn, Axin, Alp, and Opn were detected by qRT-PCR. Wnt/β-catenin signaling pathways β-catenin, p-GSK-3β, GSK-3β, Runx2 and Osterix protein expression levels were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Liuwei Dihuang Pill-containing serum culture reversed the decrease in alkaline phosphatase activity of MC3T3E-1 cells induced by titanium particles, increased the alizarin red staining and calcification of MC3T3E-1 cells, increased the expression of osteogenesis-related genes in MC3T3E-1 cells, and increased the expression of proteins related to the Wnt/β-catenin signaling pathway. (2) These findings indicate that Liuwei Dihuang Pill-containing serum can reverse the inhibitory effect of titanium particles on the differentiation and mineralization of osteoblasts, upregulate the expression of osteogenesis-related genes, and its mechanism is related to the regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway, suggesting that Liuwei Dihuang Pill is expected to become an effective drug for preventing aseptic loosening of artificial joints.

Key words: Liuwei Dihuang Pill-containing serum, osteoblast, osteolysis, Wnt/β-catenin, titanium particle

中图分类号:

朱志祺, 苑思杰, 张梓琳, 纪仕杰, 蒙明松, 颜安明, 韩婧. 六味地黄丸对钛颗粒诱导骨溶解成骨影响的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 392-397.

Zhu Zhiqi, Yuan Sijie, Zhang Zilin, Ji Shijie, Meng Mingsong, Yan Anming, Han Jing. Mechanism underlying the effect of Liuwei Dihuang Pill on osteolysis and osteogenesis induced by titanium particles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(3): 392-397.

图/表（结果） 6

2.1 六味地黄丸和钛颗粒对MC3T3-E1细胞活力的影响 CCK-8法检测不同体积分数(5%，10%，15%，20%，25%)的六味地黄丸含药血清处理的MC3T3-E1细胞活力。结果如图1：六味地黄丸可以浓度依赖的促进MC3T3-E1细胞在24 h和48 h的存活率，当六味地黄丸含药血清体积分数为20%和25%时其促进MC3T3-E1细胞增殖活力作用最强且相近，故选用10%，15%，20% 六味地黄丸含药血清作为实验给药剂量。CCK-8法检测不同质量浓度钛颗粒(1，5，10，25，50 μg/mL)对MC3T3-E1细胞活力影响，结果如图1：随着钛颗粒质量浓度逐步增大，细胞活力逐渐降低，当钛颗粒质量浓度大于10 μg/mL时表现出显著的细胞毒性作用，故选钛颗粒5 μg/mL进行后续实验。

2.2 六味地黄丸促进钛颗粒干预下成骨细胞的分化成熟碱性磷酸酶是成骨细胞成熟标志酶，反映成骨细胞的分化能力，也是骨形成所必需的酶[9]。成骨细胞经分化培养基培养7 d，碱性磷酸酶染色结果显示：与空白组相比，模型组碱性磷酸酶阳性细胞数显著降低；与模型组相比，六味地黄丸可以浓度依赖的增加碱性磷酸酶阳性细胞数，且在六味地黄丸含药血清体积分数为20%时，促进成骨细胞分化效果最显著，见图2A，B。提示六味地黄丸可以显著促进成骨细胞分化成熟。

2.3 六味地黄丸可促进钛颗粒干预下成骨细胞的矿化成骨细胞分化成熟后，表面会形成特有的钙盐沉积。Von Kossa染色法是细胞矿化染色的经典方法[10]。细胞经分化培养基培养14 d后，Von Kossa染色结果显示：与空白组相比，模型组钙盐沉积显著降低；与模型组相比，六味地黄丸可以浓度依赖的增加MC3T3-E1细胞，呈点状及片状钙盐沉积，且在六味地黄丸含药血清体积分数为20%时，点状及片状钙盐沉积数量最多，促成骨矿化效果最显著，见图3A，B。
茜素红S是一种蒽醌染料，广泛用于评估细胞培养中的钙沉积[11]。细胞经分化培养基培养28 d后，茜素红染色显示：与空白组相比，模型组红褐色的钙结节显著降低；与模型组相比，六味地黄丸可见浓度依赖的刺激红褐色的钙结节的产生，且在六味地黄丸含药血清体积分数为20%时，红褐色的钙结节数量最多，促成骨矿化效果最显著，见图3C，D。结果提示六味地黄丸可显著促进MC3T3-E1细胞的矿化。

2.4 六味地黄丸可促进钛颗粒干预下成骨相关基因的表达六味地黄丸与分化培养基共培养72 h后，qRT-PCR检测成骨特异性基因结果显示：与空白组相比，模型组Runx-2、Osterix、Ocn、Axin、Alp、Opn表达显著下降；与钛颗粒组相比，六味地黄丸可以浓度依赖的增加上述6个基因的表达，且在六味地黄丸含药血清体积分数为20%时，成骨特异性基因表达量达到最高，见图4。结果提示六味地黄丸可以显著增加钛颗粒干预的成骨特异性基因的表达。

2.5 六味地黄丸可通过激活Wnt/β-catenin信号通路缓解假体周围骨溶解见图5A-E。

六味地黄丸与分化培养基共培养5 d后，Western Bot检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达情况。结果显示：与空白组相比，模型组β-catenin、p-GSK-3β、Runx-2、Osterix蛋白表达显著下降；与钛颗粒组相比，六味地黄丸可以浓度依赖的增加β-catenin、p-GSK-3β、Runx-2、Osterix蛋白表达，而GSK-3β在各组中没有显著变化。结果显示六味地黄丸可以逆转钛颗粒导致的MC3T3-E1细胞Wnt/β-catenin信号通路的下降，提示六味地黄丸可能是通过Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化矿化的。

参考文献

[1] WU Y, HE F, ZHANG C, et al. Melatonin alleviates titanium nanoparticles induced osteolysis via activation of butyrate/GPR109A signaling pathway. J Nanobiotechnology. 2021;19(1):170.
[2] CAO J, MA X, LIU L, et al. Cortistatin attenuates titanium particle-induced osteolysis through regulation of TNFR1-ROS-caspase-3 signaling in osteoblasts. Ann N Y Acad Sci. 2022;1513(1):140-152.
[3] 王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 等. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响 [J]. 中国组织工程研究,2021,25(24): 3894-3901.
[4] 蔡毅,赵继荣,朱换平,等.基于“肾主骨生髓”理论探讨脊髓损伤继发骨质疏松的病机及临床治疗[J].中国骨质疏松杂志,2021, 27(1):131-134+152.
[5] 徐栋. 六味地黄丸改善骨质疏松性疼痛及骨代谢状态的临床研究[J].泰山医学院学报,2021,42(4):301-304.
[6] 李莉. 六味地黄丸对H_2O_2致MC3T3-E1细胞氧化损伤的保护机制研究[D].福州:福建中医药大学,2021.
[7] WANG L, WANG Q, WANG W, er al. Harmine Alleviates Titanium Particle-Induced Inflammatory Bone Destruction by Immunomodulatory Effect on the Macrophage Polarization and Subsequent Osteogenic Differentiation. Front Immunol. 2021;12: 657687.
[8] ABUNA RPF, ALMEIDA LO, SOUZA ATP, et al. Osteoporosis and osteoblasts cocultured with adipocytes inhibit osteoblast differentiation by downregulating histone acetylation. J Cell Physiol. 2021;236(5): 3906-3917.
[9] SOUZA ATP, FREITAS GP, LOPES HB, et al. Effect of cell therapy with allogeneic osteoblasts on bone repair of rat calvaria defects. Cytotherapy. 2018;20(10):1267-1277.
[10] SCHNEIDER MR. Von Kossa and his staining technique.Histochem Cell Biol. 2021;156(6):523-526.
[11] YIN N, ZHU L, DING L, et al. MiR-135-5p promotes osteoblast differentiation by targeting HIF1AN in MC3T3-E1 cells. Cell Mol Biol Lett. 2019;24:51.
[12] GALLO J, GOODMAN SB, KONTTINEN YT, et al. Osteolysis around total knee arthroplasty: a review of pathogenetic mechanisms. Acta Biomater. 2013;9(9):8046-8058.
[13] GENG DC, XU YZ, YANG HL, et al. Inhibition of titanium particle-induced inflammatory osteolysis through inactivation of cannabinoid receptor 2 by AM630. J Biomed Mater Res A. 2010;95(1):321-326.
[14] YANG H, XU Y, ZHU M, et al. Inhibition of titanium-particle-induced inflammatory osteolysis after local administration of dopamine and suppression of osteoclastogenesis via D2-like receptor signaling pathway. Biomaterials. 2016;80:1-10.
[15] GALLO J, GOODMAN SB, KONTTINEN YT, et al. Particle disease: biologic mechanisms of periprosthetic osteolysis in total hip arthroplasty. Innate Immun. 2013;19(2):213-224.
[16] ZHENG K, BAI J, LI N, et al. Protective effects of sirtuin 3 on titanium particle-induced osteogenic inhibition by regulating the NLRP3 inflammasome via the GSK-3β/β-catenin signalling pathway. Bioact Mater. 2021;6(10):3343-3357.
[17] WANG S, DENG Z, MA Y,et al. The Role of Autophagy and Mitophagy in Bone Metabolic Disorders. Int J Biol Sci. 2020;16(14):2675-2691.
[18] 宋军营, 丁蕊, 李俊霖,等. 六味地黄丸通过PI3K/Akt/FoxO3a通路调控自噬对SAMP8小鼠记忆功能的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2022,28(17):1-8.
[19] 周萍, 魏群. 六味地黄丸治疗老年男性骨质疏松30例[J]. 陕西中医, 2014,35(9):1191-1192.
[20] 陶乐维, 陆灏. 六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响[J]. 上海中医药杂志,2018,52(9): 65-68.
[21] ZHU Y, WANG Y, JIA Y, et al. Catalpol promotes the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells via the Wnt/β-catenin pathway. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):37.
[22] ZHAO R, TAO L, QIU S, et al. Melatonin rescues glucocorticoid-induced inhibition of osteoblast differentiation in MC3T3-E1 cells via the PI3K/AKT and BMP/Smad signalling pathways. Life Sci. 2020;257:118044.
[23] 黄旋平, 周诺, 杨媛媛,等. 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导 [J]. 口腔医学研究,2012,28(8):745-748.
[24] 黄涛, 程志坚, 贾志强,等. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J].中国组织工程研究,2022,26(1):70-75.
[25] PANG Y, LIU L, MU H, et al. Nobiletin promotes osteogenic differentiation of human osteoblastic cell line (MG-63) through activating the BMP-2/RUNX-2 signaling pathway. Saudi J Biol Sci. 2021; 28(9):4916-4920.
[26] YIN W, LIU S, DONG M, et al. A New NLRP3 Inflammasome Inhibitor, Dioscin, Promotes Osteogenesis. Small. 2020;16(1):e1905977.
[27] LIU Q, LI M, WANG S, et al. Recent Advances of Osterix Transcription Factor in Osteoblast Differentiation and Bone Formation. Front Cell Dev Biol. 2020;8:601224.
[28] LIU S, VIRDI AS, SENA K, et al. Sclerostin antibody prevents particle-induced implant loosening by stimulating bone formation and inhibiting bone resorption in a rat model. Arthritis Rheum. 2012;64(12): 4012-4020.
[29] WANG L, BAI J, WANG Q, et al. Inhibition of protein phosphatase 2A attenuates titanium-particle induced suppression of bone formation. Int J Biol Macromol. 2020;142:142-151.
[30] GU Y, WANG Z, SHI J, et al. Titanium particle-induced osteogenic inhibition and bone destruction are mediated by the GSK-3β/β-catenin signal pathway. Cell Death Dis. 2017;8(6):e2878.
[31] ZHAO Z, WANG C, XU Y, et al. Effects of the Local Bone Renin-Angiotensin System on Titanium-Particle-Induced Periprosthetic Osteolysis. Front Pharmacol. 2021;12:684375.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，细胞学实验观察。组间的比较采用了单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年6月在南京中医药大学仙林校区完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药物六味地黄丸(仲景宛西制药，批号：210403)；钛(Ti)颗粒：钛合金(TiAl6V4)来源于人工关节假体材料，合金微粒的制备由南京工业大学材料科学与工程学院的张振忠教授完成。采用直流电弧等离子法(DC)制备钛颗粒，经过高压灭菌锅中灭菌15 min(121 ℃，103.425 kPa)，溶于无菌PBS中，4 ℃保存。
1.3.2 实验动物 40只SPF级雄性SD大鼠，体质量约200 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001。大鼠在温度(22±2) ℃、湿度40%-60%、12 h明暗循环的环境下饲养，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后开始实验。动物饲养于南京中医药大学动物实验中心，动物使用经南京中医药大学动物实验伦理委员会审议通过，动物实验伦理号为SYXK(S)2018-0049。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.3 实验细胞小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 subcLone14)细胞株，购自中国科学院细胞库。
1.3.4 实验试剂 α-MEM 培养基(Gibco)；胎牛血清(翌圣)；0.25%胰蛋白酶(新赛美)；L-抗坏血酸、地塞米松、BCIP/NBT碱性磷酸脂酶显色试剂盒、成骨细胞矿化结节染色试剂盒(均为碧云天产品)；β甘油磷酸钠(Sigma)；Von Kossa染色试剂(雷根)；异氟烷(瑞沃德，批号：21091901)；Anti-GADPH抗体(货号：AF7021)、Anti-β-catenin(货号：AF6266)、Anti-GSK-3β
(货号：AF5016)、Anti-Ser9-GSK-3β(货号：AF2016)、Anti-Runx-2(货号：AF5186)、Anti-Osterix(货号：DF7731)(均为Affinity产品)。
1.3.5 仪器酶标仪(Tecan)；光学倒置生物显微镜(Nikon)；CO2细胞孵育箱(Thermo)；台式离心机(赫西)；荧光定量PCR仪(Roche)。
1.4 实验方法
1.4.1 六味地黄丸含药血清的制备将六味地黄丸磨成粉末后，取8 g六味地黄丸粉末溶解于10 mL蒸馏水中，制备成质量浓度为0.8 kg/L的六味地黄丸水溶液备用。SD大鼠适应性饲养1周后，分为给药组(30只)和对照组(10只)。将六味地黄丸制成0.8 kg/L的水溶液，给药组以5 mL/kg的剂量灌胃给药，对照组给予等体积双蒸水，2次/d，连续给药7 d[6]。第7天首次灌胃2 h后，使用麻醉机给予大鼠异氟烷吸入麻醉，流量设为500-700 mL/min，麻醉2.0-3.0 min。腹主动脉取血，全血于室温静置 2 h后，3 000 r/min离心10 min，后收取血清，56 ℃水浴灭活30 min后用无菌滤器(0.22 μm)过滤除菌，制备出六味地黄丸含药血清。取六味地黄丸含药血清，加入5个培养基中分别制备体积分数为5%，10%，15%，20%，25%的六味地黄丸含药血清，于-80 ℃冰箱保存备用。
1.4.2 细胞培养及分化 MC3T3-E1细胞使用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养，细胞置于37 ℃且含体积分数5% CO2的培养箱中培养。成骨分化培养基(体积分数10%胎牛血清，50 μg/mL抗坏血酸、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L的β-甘油磷酸钠)用于诱导细胞分化[7]，培养基每隔1 d更换1次。
1.4.3 细胞活力检测
(1)六味地黄丸对MC3T3-E1细胞活力的影响：将MC3T3-E1细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板(每孔培养基 180 μL)，置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁后，设置6组：除对照组外，其余组分别加入不同体积分数的六味地黄丸含药血清(5%，10%，15%，20%，25%)，每组设置5个复孔，干预24，48 h后，加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，采用全波长酶标仪于450 nm读取吸光度(A)值。
(2)钛颗粒对MC3T3-E1细胞活力的影响：将MC3T3-E1细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，设置6组：除对照组外，其余组别加入钛颗粒(1，5，10，25，50 μg/mL)，每组设5个复孔，培养24，48 h后，每孔细胞加入10 μL的CCK-8，孵育2 h，采用全波长酶标仪于450 nm读取A值。
1.4.4 成骨细胞染色 MC3T3-E1细胞以1×105个/孔密度接种于24孔板，细胞分为空白组、模型组和加含药血清组(10%，15%，20%)。空白组给予成骨分化培养基；模型组给予钛颗粒(5 μg/mL)+成骨分化培养基；加含药血清组给予钛颗粒(5 μg/mL)+六味地黄丸含药血清(分为10%，15%，20%剂量组)+成骨分化培养基。细胞隔天换液，培养7 d进行碱性磷酸酶染色；培养21 d进行Von Kossa染色；培养28 d进行茜素红染色。
(1)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色：细胞弃培养基后，4% PFA固定10 min，0.1% Triton-X-100通透6 min，PBST孵育10 min，每孔加300 μL的碱性磷酸酶染液于 37 ℃恒温箱孵育40 min，弃去染液，拍照，统计碱性磷酸酶阳性细胞量。
(2)Von Kossa染色：细胞弃培养基后，4% PFA固定10 min，蒸馏水洗3遍后每孔加 500 μL 钙盐染液，避光孵育1 h，在紫外灯下照射12 h，蒸馏水洗3遍，晾干后拍照统计钙盐沉积量。
(3)茜素红染色：细胞弃培养基后，PBS洗涤1遍，4% PFA固定20 min，PBS洗3遍，蒸馏水洗2遍，每孔加300 μL茜素红染液于室温下染色30 min，蒸馏水清洗染液后于倒置显微镜下观察拍照。

1.4.5 RNA提取及qRT-PCR MC3T3-E1细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板，细胞分为空白组、模型组和加含药血清组(10%，15%，20%)。空白组给予成骨分化培养基；模型组给予钛颗粒(5 μg/mL)+成骨分化培养基；加含药血清组给予钛颗粒(5 μg/mL)+六味地黄丸含药血清(分为10%，15%，20%剂量组)+成骨分化培养基。细胞培养3 d后Trizol提取RNA，反转录为cDNA，以Gapdh为内参，按照标准的qRT-PCR方法检测成骨相关基因Runx-2、Osterix、Ocn、Axin、Alp、Opn的表达[4]，采用2-ΔΔCt法进行数据分析，引物序列如表1所示。

1.4.6 Western bolt检测六味地黄丸对Wnt/β-catenin通路蛋白的影响按1.4.5方法种板、分组、给药，细胞培养5 d后。按照标准的方法提取细胞蛋白[8]，蛋白经BCA法定量，100 ℃水浴变性后，加入电泳仪，蛋白分离后转至PVDF膜，脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入相应的一抗(β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、Runx-2、Osterix，稀释倍数1∶500)于4 ℃孵育12 h，PBST洗去多余一抗，孵育相应二抗(1∶5 000)1 h，PBST洗去多余二抗，膜经ECL显影系统曝光拍照，Image lab分析条带灰度值。
1.5 主要观察指标 ①六味地黄丸和钛颗粒对MC3T3-E1细胞活力的影响；②六味地黄丸对钛颗粒干预下成骨细胞分化成熟的影响；③六味地黄丸对钛颗粒干预下成骨细胞矿化的影响；④六味地黄丸对钛颗粒干预的成骨相关基因表达的影响；⑤六味地黄丸是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路缓解假体周围骨溶解。
1.6 统计学分析使用GraghPad Prism 8.0软件进行统计分析，数据均采用均数±标准误表示，组间的比较采用了单因素方差分析。图像采用了ImageJ、Image Lab进行处理和分析。当P < 0.05 时认为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经南京中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

关节置换后假体周围无菌性松动是假体失效的主要原因[12]，假体周围无菌性松动主要包括了机械性因素和生物学因素，其中生物学因素占据了主导地位。生物学因素认为置入的假体与骨磨损产生的磨损颗粒刺激假体周围细胞分泌细胞因子和趋化因子，引起慢性炎症反应[13]。假体周围慢性炎症反应抑制了成骨细胞的分化与骨形成，同时促进了破骨细胞的形成与骨吸收，致使假体周围的骨吸收超过了骨形成，打破了假体周围骨动态平衡，导致了假体周围骨溶解[14]。多项研究表明，磨损微粒具有下调与骨形成有关的因子和受体，减弱碱性磷酸酶的功能，可促进成骨细胞凋亡抑制假体周围骨形成[15]。目前人工关节置换后假体磨损后产生钛颗粒等金属微粒、陶瓷颗粒、骨水泥颗粒、高分子聚乙烯颗粒等，其中钛颗粒具有性质稳定易于黏附的性质，在此次研究中使用了钛颗粒作为实验刺激剂[16]。此次研究也显示钛颗粒可以浓度依赖的抑制成骨细胞增殖，特别是钛颗粒质量浓度高于10 μg/mL时，MC3T3-E1细胞活力显著降低。鉴于成骨细胞在体内骨形成中起到的重要作用[17]，从促进成骨细胞增殖及骨形成角度出发开发药物，对于预防和改善磨损微粒诱导的骨溶解将具有重要意义。
六味地黄丸始载于宋代医家钱乙所著的《小儿药证直诀》，具有滋阴填精、补益肝肾功效[18]。中医理论认为骨髓赖肾精以充养，肾精足则筋骨强健，故将其广泛用中医“骨痿”“骨痹”等症[6]。现代医学研究显示：六味地黄丸可以抑制软骨细胞凋亡，增加骨钙素含量，促进骨骼钙磷沉积，发挥抗骨质疏松作用[19]。陶乐维等[20]发现：六味地黄丸含药血清可以通过提高Foxo1、Runx-2基因表达促进MC3T3-E1细胞的增殖。ZHU等[21]发现六味地黄丸活性成分梓醇可以促进骨髓间充质干细胞增殖，增加其碱性磷酸酶活性，加速钙沉积和成骨向分化。成骨细胞能合成和释放碱性磷酸酶(Alp)，继而水解有机磷酸促进羟基磷灰石的形成，为成骨细胞分化早期指标[22]；矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志，硝酸银和茜素红染色可以标识成骨细胞矿化能力[23-24]。Runx2是新生成骨细胞早期标志基因[25]；骨钙素(Ocn)介导成骨分化晚期钙结节的形成，是成骨细胞分化成熟的指标[26]；骨桥蛋白(Opn)介导了骨细胞与骨基质的桥连[27]；Osterix也是成骨细胞晚期分化标志物[28]。此次实验中，与钛颗粒共培养后成骨细胞碱性磷酸酶、Von Kossa、茜素红染色阳性面积较对照明显降低，与此同时成骨相关基因(Alp、Runx-2、Ocn、Opn、Osterix等)表达也明显降低，表明磨损微粒抑制了成骨细胞成骨分化矿化。而六味地黄丸可以逆转钛颗粒对成骨细胞碱性磷酸酶、Von Kossa、茜素红染色的抑制作用，同时逆转钛颗粒对成骨细胞成骨相关基因的抑制作用，提示了六味地黄丸可以诱导成骨细胞向分化状态转换，这对骨组织修复和骨形成具有重要意义。
Wnt/β-catenin信号通路与成骨细胞分化、矿化及基因表达密切相关，β-catenin是骨形成的关键调节因子，降解β-catenin可以降低骨密度，导致骨质疏松的发生[29]。GSK-3β是β-catenin的上游基因，可通过Ser9磷酸化位点失活，调控细胞质β-catenin积聚，使β-catenin核移位增加，激活Wnt/β-catenin[30]，促进骨形成。WANG等[29]发现，蛋白质磷酸酶2A抑制可以通过促进成骨细胞分化和骨形成来缓解颗粒诱导的骨破坏，并阐明了蛋白质磷酸酶2A抑制主要通过激活Wnt/β-catenin信号通路对体外成骨分化发挥保护作用。ZHAO等[31]发现，局部骨肾素-血管紧张素通过调节RANKL/RANK和Wnt/β-catenin通路，增加骨吸收和减少骨形成，缓解钛颗粒诱导的骨溶解。此次实验显示钛颗粒可以显著抑制Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、p-GSK-3β、GSK-3β、Runx-2、Osterix的表达情况，给予六味地黄丸后可以浓度依赖的促进这些蛋白的增加，提示六味地黄丸促进骨形成、治疗钛颗粒诱导的骨形成减少与Wnt/β-catenin信号通路激活密切有关。
综上所述，此次研究表明六味地黄丸可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制钛颗粒诱导的骨形成减少，调节成骨细胞的分化和矿化，以及成骨特异性基因的表达水平，从而增加骨密度，治疗调控假体周围骨溶解的发生与发展。同时体外实验发现20%的六味地黄丸含药血清对钛颗粒诱导的成骨功能障碍具有最大的保护效果。但文章还存在一定的局限性，六味地黄丸对于动物骨溶解模型的体内药效作用还有待完善，以及六味地黄丸中具体用来调节骨平衡的单体成分还有待进一步的深入探究。此次研究为口服六味地黄丸作为临床上用来治疗骨溶解的潜在药物提供初步的理论依据，可为未来研究延缓和抑制假体周围骨溶解的治疗提供可能的途径和方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

六味地黄丸对钛颗粒诱导骨溶解成骨影响的机制

Mechanism underlying the effect of Liuwei Dihuang Pill on osteolysis and osteogenesis induced by titanium particles

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[1]	尹林伟, 黄夏荣, 屈萌艰, 杨璐, 王金玲, 贾飞阳, 廖阳, 周君. 跑台运动对老年大鼠骨质疏松及wnt/β-catenin信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 231-236.
[2]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[3]	赵璐, 赵逸菲, 高达, 刘艳芳, 付婷婷, 徐江雁. Zeste基因抑制子基因12在糖尿病肾脏病模型大鼠肾组织中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1179-1186.
[4]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[5]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[6]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[7]	乔鲁卉, 马子雨, 郭浩宇, 侯玉东. 葛根素与淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 872-877.
[8]	秦祎雄, 袁子健, 谢山周, 祝英文, 陈明慧, 韩标, 郭勇. 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5665-5669.
[9]	游妍, 陈嘉文, 林滨滨, 吴靖漪, 刘鹏, 吴补领, 孙天语. 糖胺聚糖在骨组织工程中的作用机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5538-5545.
[10]	马瑞鑫, 刘槃, 张琼, 曾高峰, 宗少晖. 山楂叶总黄酮调控星形胶质细胞治疗脊髓损伤的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5327-5333.
[11]	王慧达, 孙小桐, 毕蓝, 王子轩, 张荣和. 黄芪多糖在正畸骨改建中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5214-5218.
[12]	韩杰, 林智宇, 徐志为, 章晓云, 尚昱志, 刘昊. miRNA通过骨代谢机制干预股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5238-5248.
[13]	廖紫芮, 陈建权. Wnt蛋白生成抑制剂2干预破骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 4990-4995.
[14]	沈梦然, 任岩松, 周宇, 岳德波, 马金辉, 王佰亮. 白细胞介素33介导的骨免疫[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4723-4728.
[15]	韦宗波, 苏允裕, 章晓云, 黄为, 许航, 刘荣发. 长链非编码RNA调控膝骨关节炎中软骨下骨稳态的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4736-4744.