透射电镜观察：将空白白蛋白微球及载辛伐他汀的白蛋白微球滴到铜网后，透射电镜下观察，发现两组微球均为光滑的球形，分散性好，无明显聚集现象，微球的粒径也较为均匀，80%的微球粒径在0.2-0.8 μm之间，见图2。

扫描电镜观察：两组微球均呈光滑的球形，分散性好，微球的粒径较为均匀，80%的微球粒径在0.2-0.8 μm之间，见图3。



2.2   空白与载药水凝胶的微观形貌   见图4。

高倍镜下，空白水凝胶组显示为多孔条状结构，各孔之间连通性较好，呈现出相互联通的三维结构，有利用细胞的黏附和生长；载药水凝胶组表面有均匀分布的球形白蛋白微球，这些微球与图3所示微球的形貌相近，部分白蛋白微球被水凝胶覆盖，部分白蛋白微球被水凝胶包裹，水凝胶表面支架结构适合细胞黏附和生长。
2.3   载药微球的载药率、包封率    
2.3.1   辛伐他汀全波长检测结果   如图5所示，采用全波长酶标仪检测辛伐他汀标准品，结果显示辛伐他汀的检测波长为230 nm。



2.3.2   辛伐他汀线性回归方程结果   见图6所示，辛伐他汀的线性回归方程为：A=0.001 8×C+3.372，R=0.980 4，表明辛伐他汀在2-12 mg/L范围内线性良好。



2.3.3   载药微球的载药率、包封率   载药微球的包封率为68.9%-87.5%，载药率为0.95%-1.21%。
2.4   载药微球与载药水凝胶的体外药物释放   基于建立的标准方程，计算各时间点辛伐他汀累积释放量，见图7所示，载药微球中辛伐他汀的释放曲线是温和的持续释放过程，而载药水凝胶的释放曲线为前期释放速度快后期缓慢的持续释放过程。载药微球在前期释放较快，前3 d药物释放达到21.19%，而载药水凝胶在前期释放更快，前3 d药物释放达到了30.56%，体现了辛伐他汀短时间内爆发式的释放；后期两者均放缓释放速度，表明微球及水凝胶的缓释使药物的半衰期有所延长，早期的爆发式释放能够在短时间内使药物达到有效的作用浓度，后期释放速度变慢，能够使药物维持的作用浓度，并延长作用时间，显示了载药微球及载药水凝胶能较好地实现辛伐他汀持续缓慢的释放。



2.5   载药水凝胶的细胞相容性   

碱性磷酸酶表达：培养1 d时，两组细胞碱性磷酸酶表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养4，7 d时，实验组细胞碱性磷酸酶表达高于对照组(P < 0.01)，见图8，说明载药水凝胶能够促进成骨细胞碱性磷酸酶的表达，促进细胞的矿化。

细胞增殖：培养1 d时，两组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养4，7 d时，实验组细胞增殖吸光度值高于对照组(P < 0.01)，见图9，说明载药水凝胶促进了成骨细胞的增殖。

由细胞碱性磷酸酶活性检测与增殖检测结果可知，载药水凝胶具有良好的细胞相容性。

牙周炎是口腔常见病之一，并且发病率逐年增加，是由菌斑、牙石等众多因素引起的牙周组织的慢性炎症，早期的自觉症状不明显，但后期随着炎症的发展，牙周软硬组织吸收，从而导致牙龈出现炎症、牙齿松动等。传统的治疗方法无法促进牙周软硬组织的恢复，作者设想制作一个缓释药物材料，在牙周组织周围缓慢释放药物辅助治疗牙周炎，达到促进牙周软硬组织恢复、抑制牙周炎症的目的。

研究发现他汀类药物具有抑制破骨、抑制炎症、促进成骨等作用。牙龈链球菌是牙周炎重要的致病菌，将辛伐他汀应用到牙周中时能够抑制牙龈链球菌的生物活性，促进牙周膜干细胞的再生，从而抑制牙周炎症、促进牙周组织的再生[1-2]。辛伐他汀通过降低白细胞介素6和白细胞介素8的表达、抑制肿瘤坏死因子α的表达、促进白细胞介素10的表达，抑制牙周炎症[3-5]。多项研究发现辛伐他汀提高了骨形态发生蛋白2、α5整合素的表达，从而促进成骨[6]。同时，辛伐他汀阻断了核因子配体受体激活因子的作用，降低了破骨细胞的生物活性[7-10]。

为了局部应用辛伐他汀并使之持续缓慢地释放，需要将药物装载到聚合物载体中。以往的研究发现，白蛋白微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球等具有良好的包封率和载药率、良好的生物相容性，并能够使药物持续缓慢地释放[11-13]。水凝胶可以装载载药微球，能够发挥水凝胶良好的光学性能、独特的三维结构、优越的力学性能，并且具有良好的控释作用和生物相容性，能够在短时间内使药物释放到作用浓度，随后缓慢释放维持药物的作用浓度，同时水凝胶具有良好的流动性，能够更好地贴合组织形态，达到良好的效果[14-17]。

实验设计通过去溶剂法制备装载辛伐他汀的壳聚糖稳定的牛血清白蛋白微球，并将其装载到水凝胶中，达到辛伐他汀的双重缓释作用，实现辛伐他汀在牙周炎的局部应用。水凝胶的立体结构有利于成骨细胞的附着及增殖，辛伐他汀的局部持续缓释能够促进成骨细胞的成骨及增殖，并且能够抑制牙周炎症，从而达到辅助治疗牙周炎的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   观察及体外细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2021年4-10月在滨州医学院临床医学实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   主要药品与试剂   辛伐他汀(MW=418.56)、牛血清白蛋白(上海麦克林生化科技有限公司)；壳聚糖(美国Sigma公司)；明胶(国药化学试剂有限公司)；甘油(国药试剂)；胎牛血清、α-MEM培养基、青霉素/链霉素、胰蛋白酶(大连美伦生物技术有限公司)；CCK-8检测试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。
1.3.2   主要仪器与设备   pH仪及天平(瑞士METTLERTOLEDD公司)；磁力搅拌器(金坛区西城新瑞仪器厂)；超净工作台(美国Thermo Electron公司)；微量注射泵(康康医疗)；酶标仪(SpectraMax M2，Molecular Devices，美国)。扫描电镜(HT7700，日立，日本)；激光共聚焦显微镜(莱卡，德国)。
1.3.3   主要细胞   MC3T3-E1细胞购自济南卓凌经贸有限公司。
1.4   实验方法    
1.4.1   载药微球的制备   ①采用磁力搅拌器搅拌10 mL去离子水和100 mg牛血清白蛋白30 min，测量溶液pH值，以氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH值到8左右；向其中加入1 mg辛伐他汀，持续搅拌8 h；使用微量注射泵以30 mL/h的速度向其中泵入40 mL无水乙醇，继续搅拌8 h，得到溶液称之为A液。②将3 mL冰醋酸和47 mL去离子水搅拌配成稀醋酸，取50 mL稀醋酸与50 mg壳聚糖搅拌30 min，得到的溶液称之为B液。③使用微量注射泵以30 mL/h的速度将40 mL B液泵入A液中，并搅拌至少8 h。④将最后搅拌得到的混合溶液倒入离心管中，12 000 r/min离心15 min，倒出上清液(将每次得到的上清液收集起来)，加入无水乙醇和去离子水各10 mL洗涤，使用超声波清洗器震荡20 min，重复3次，得到最终的沉淀。将沉淀冻干即可得到壳聚糖稳定的装载辛伐他汀的牛血清白蛋白微球冻干粉，见图1。同理制备不含辛伐他汀的牛血清白蛋白微球。 

1.4.2   载药微球的载药率与包封率检测   精密称取辛伐他汀1 mg，用5 mL PU水和5 mL无水乙醇溶解，配置100 mg/L的辛伐他汀标准储备液，采用全波长酶标仪检测各波长下的数值，得出辛伐他汀的检测波长230 nm(为辛伐他汀的最大吸收波长)。用100 mg/L的辛伐他汀标准储备液，配置质量浓度为2，4，6，8，10，12 mg/L的标准溶液，采用酶标仪测定各标准溶液在230 nm处的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，以辛伐他汀浓度为横坐标，计算出线性回归方程。

将载药微球PU水和无水乙醇混合溶液离心后的上清液全部收集起来，采用全波长酶标仪测(波长230 nm)上清液的吸光度值。计算溶液上清液药物的含量，基于微球所包封辛伐他汀的量(S1)和微球所添加总的辛伐他汀量(S2)计算微球的包封率，基于冻干获得的载辛伐他汀微球的量(S)和包封的辛伐他汀量(S1)计算载药量。

包封率(%)=S1/S2×100%                                                           

载药量(%)=S1/S×100%       
1.4.3   载药水凝胶的制备   取0.4 g明胶、2 mL甘油、4 mL去离子水，混合并用磁力搅拌器于37 ℃搅拌1 h成均匀水凝胶。保持 37 ℃恒温，将水凝胶分别抽吸灌装于1.0 mL注射器中，成为可注射性水凝胶，凉至室温后密封。经60Co照射1.5 min以消毒灭菌，保存在4 ℃中。倒置试管，若所装载的溶液在30 s之内不流动，则认定该溶液为凝胶状态。

在无菌条件下，在水凝胶材料中加入装载辛伐他汀的牛血清白蛋白微球，制作载药水凝胶。
1.4.4   微球与水凝胶的微观形貌

透射电镜观察：收集离心纯化的空白微球及载药微球沉淀，分别加入1 mL去离子水和1 mL无水乙醇，用超声清洗器充分混匀5 min，取2 µL未稀释的液体滴到碳铜网(230目)上，晾干，透射电镜下观察。

扫描电镜观察：在冻干的空白白蛋白微球及载辛伐他汀的白蛋白微球表面喷金，采用扫描电镜观察微球形态及粒径。将载药水凝胶与未载药水凝胶放到液氮中冷冻，在-80 ℃中冷冻干燥得到冻干的水凝胶，脆断后在水凝胶断端均匀喷金，扫描电镜下观察。
1.4.5   载药微球与载药水凝胶的体外药物释放   将冻干后的载药微球与载药水凝胶分别放入 5 mL离心管中，加入2 mL无菌PBS溶液，置于37 ℃恒温摇床上，以150 r/min持续振摇。1，2，3，4，5，6，7 d时，12 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液，并向管中加入等量的无菌PBS溶液，使用全波长酶标仪检测上清液在230 nm处的吸光度值。建立校准曲线，根据校准曲线计算每个时间间隔释放的辛伐他汀量。      
1.4.6   载药水凝胶的细胞相容性

水凝胶浸提液的制备：将载药水凝胶浸泡于完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基)中，置于37 ℃细胞培养箱中培养48 h，水凝胶与培养基的比例为0.2 g/1 mL。浸提液用紫外线照射4 h消毒。

碱性磷酸酶活性检测：将MC3T3-E1细胞进行培养和传代。取对数生长期的MC3T3-E1细胞，胰蛋白酶消化后，按照3×104/cm2的密度接种到24孔板，实验组每孔加入含体积分数25%水凝胶浸提液、成骨诱导液(β-甘油磷酸钠 10 mmol/L、维生素C 50 mg/L、地塞米松1×10-8 mol/L)的完全培养基1 mL，对照组每孔加入含成骨诱导液的完全培养基1 mL，每组3个副孔。培养1，4，7 d后，PBS冲洗2次，每孔加入200 µL细胞裂解液，充分裂解；4 ℃下12 000 r/min离心3 min；取上清液120 µL，接种到96孔板，根据碱性磷酸酶试剂盒的要求操作，采用酶标仪测定405 nm波长处的吸光度值。

细胞增殖检测：取对数生长期的MC3T3-E1细胞，按照1×104/cm2的密度接种96孔板中，实验组每孔加入含体积分数25%水凝胶浸提液的完全培养基100 μL，对照组每孔加入完全培养基100 μL，放入培养箱中培养。培养1，4，7 d后，每孔加入80 µL的CCK-8溶液，放于培养箱中培养2 h，再吸到96孔板中，通过酶标仪在405 nm处检测吸光度值。
1.5   主要观察指标   载药微球与载药水凝胶的体外药物释放，以及载药水凝胶的细胞相容性。
1.6   统计学分析   所有实验均重复3次，数据以x±s形式展示。采用SPSS 21.00 统计软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，且P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经滨州医学院生物统计学专家审核。

辛伐他汀作为他汀类药物之一，临床中主要用于降低胆固醇水平，近年研究发现他汀类药物尤其是辛伐他汀能够抑制炎症、降低破骨细胞的生物活性并促进成骨细胞的成骨分化，从而为治疗牙周炎提供了可能性。众多研究表明，辛伐他汀通过降低白细胞介素8和白细胞介素6的表达、促进白细胞介素10的表达，从而抑制炎症的发生和发展。牙龈链球菌是牙周炎重要的致病菌，将辛伐他汀应用到口腔生物膜时可抑制牙龈链球菌的活性；将辛伐他汀应用到牙周炎患者时，患者龈沟液中单核细胞金属蛋白酶1的表达受到了抑制，从而抑制了牙周炎的进展。高剂量的辛伐他汀反而会抑制基因的表达，使患者出现不良的肌肉反应[18]。辛伐他汀的浓度在1×10-6 mol/L时效果最佳[19]。研究表明局部注射是辛伐他汀良好的给药方式，而口服他汀类药物可能导致不良反应[20]。同时应注意辛伐他汀的神经毒性等不良反应。此次实验选择了他汀类药物中的辛伐他汀作为研究药物，辛伐他汀抑菌和促进成骨的机制尚未完全探明，需要更多的实验来探究。

与传统应用材料的相比，白蛋白微球等具有良好的性能并经过了广泛的研究和应用。研究发现经过壳聚糖稳定的牛血清白蛋白微球具有良好的形态和结构，具有持续缓释药物的作用，并且具有良好的生物性能[21-22]。研究发现微球制备过程中的众多因素，如聚合物的种类、分子质量等都能够对微球的性质产生作用，如载药量、大小及形态等。水凝胶具有良好的缓释作用和良好的生物相容性，并经过了广泛的研究及应用[23]。根据水凝胶的扫描电镜图片可以看出，其具有良好的三维结构和孔隙，适合细胞的黏附和增殖[24]。目前有很多学者利用水凝胶的良好性能并将其应用到细胞及动物实验[25]。将药物装载到水凝胶中，使药物缓慢持续地释放，并且在短时间内的突释后能较快地达到药物的作用浓度，并维持药物的作用浓度，同时延长了作用时间[26-27]。将微球装载到水凝胶中，使药物达到双重缓释的作用，并且结合了微球的性能和水凝胶的三维立体结构，更好地发挥作用[28]。将辛伐他汀加载到白蛋白微球及水凝胶中，辛伐他汀的释放类似于药物的零级释放动力学，可以保证药物在短时间内到达并维持作用浓度，延长药物的作用时间。需要更多的实验确定微球及水凝胶制备过程中的影响因素，来统一控制微球及水凝胶的性能。此次实验将辛伐他汀装载到白蛋白微球中，并将载药微球放入水凝胶中，观察其载药、释药及其对成骨细胞增殖和分化的影响。

此次课题制备了装载辛伐他汀的牛血清白蛋白微球，并将其装载在水凝胶中，成功制备出辛伐他汀双重缓释材料。实验结果表明，装载辛伐他汀的白蛋白微球颗粒均匀，呈圆球形，分散性较好，装载到水凝胶中时保持基本的形态不变，并通过扫描电镜观察水凝胶，发现水凝胶具有良好的立体结构，各孔之间连通性较好，呈现出相互联通的三维结构，有利于成骨细胞的黏附和增殖。CCK-8实验结果显示，载药微球水凝胶具有良好的细胞相容性，释放的辛伐他汀能够更好地促进成骨细胞的增殖。碱性磷酸酶活性实验检测结果显示，载药微球水凝胶对碱性磷酸酶活性的促进作用明显，说明能够更好地促进成骨细胞分化。此次实验完成了辛伐他汀微球水凝胶的制备及细胞实验，初步验证了此载药微球促进成骨细胞增殖和成骨分化的效果，为后续如何更好地控制载药微球水凝胶的性能，并将其应用到动物中甚至动物牙周炎模型中提供经验。后续将继续探究辛伐他汀局部给药系统的制备及优缺点，并研究其治疗牙周炎的可能性和治疗效果，为后续的实验、研究及临床应用提供理论基础。
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文题释义：
辛伐他汀：属于他汀类药物，临床中主要应用于降低患者胆固醇水平。近年的研究发现辛伐他汀能够促进骨的再生，抑制牙龈链球菌的生物活性，从而达到抑制牙周炎、促进牙周骨组织形成的目的。
水凝胶：具有良好的三维结构，能够为细胞生长提供空间；具有控释作用，能够缓释药物；具有流动性能，够更加贴合缺损部位的形态；具有可注射性，能够方便操作和储存；具有良好的力学性能、稳定性和抗扩张性。

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实验阐述了辛伐他汀促进牙周骨再生、抑制炎症、治疗牙周炎的机制，为了更好的发挥辛伐他汀的作用，将辛伐他汀装载到白蛋白微球及水凝胶中，使辛伐他汀在短时间内突释后到达并维持作用浓度，并且水凝胶的三维立体结构更有助于牙周细胞的增殖。本研究将辛伐他汀装载到白蛋白微球及水凝胶中，后采用透射电镜及扫描电镜观察载药材料的结构及形态，采用实验测试载药材料的包封率、载药率及体外释放情况，采用碱性磷酸酶检测载药材料对MC3T3-E1细胞的活性，采用CCK-8检测载药材料对MC3T3-E1细胞的增殖情况。

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