茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞增殖分化的影响

doi:10.12307/2023.685

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5665-5669.doi: 10.12307/2023.685

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茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞增殖分化的影响

秦祎雄，袁子健，谢山周，祝英文，陈明慧，韩标，郭勇

桂林医学院智能医学与生物技术学院，广西高校生物化学与分子生物学重点实验室，广西壮族自治区桂林市 541199

收稿日期:2022-08-09 接受日期:2022-10-18 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-05
通讯作者: 郭勇，博士，教授，桂林医学院智能医学与生物技术学院，广西高校生物化学与分子生物学重点实验室，广西壮族自治区桂林市 541199
作者简介:秦祎雄，男，1996年生，湖北省黄冈市人，汉族，桂林医学院在读硕士，主要从事骨生物力学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(32071309)，项目负责人：郭勇；广西壮族自治区自然科学基金项目(2018GXNSFAA281357)，项目负责人：郭勇；国家级大学生创新创业项目(202010601027)，项目负责人：陈明慧

Effect of tea polyphenols on proliferation and differentiation of osteoblasts stimulated by lipopolysaccharide

Qin Yixiong, Yuan Zijian, Xie Shanzhou, Zhu Yingwen, Chen Minghui, Han Biao, Guo Yong

Guangxi Higher Education Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, College of Intelligent Medicine and Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin 541199, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-08-09 Accepted:2022-10-18 Online:2023-12-18 Published:2023-06-05
Contact: Guo Yong, PhD, Professor, Guangxi Higher Education Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, College of Intelligent Medicine and Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin 541199, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Qin Yixiong, Master candidate, Guangxi Higher Education Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, College of Intelligent Medicine and Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin 541199, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 32071309 (to GY); Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2018GXNSFAA281357 (to GY); National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Project, No. 202010601027 (to CMH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

茶多酚：是一种提纯自天然植物茶叶的多酚类化合物，具有较强的抗炎、抗氧化、清除氧自由基的能力。体外研究表明，茶多酚对成骨细胞增殖有明显的促进作用。
脂多糖：革兰阴性细菌外膜的主要组成成分，能诱导多种炎症因子的产生，可以影响成骨细胞增殖分化。

背景：研究表明，茶多酚在牙周炎等疾病的研究中能发挥抗炎、抗氧化作用。
目的：探讨茶多酚在脂多糖刺激下对小鼠成骨细胞增殖分化及氧化应激的影响。
方法：体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1，分4组处理：对照组常规培养；脂多糖组加入10 μg/mL脂多糖，茶多酚组加入1 μg/mL茶多酚，联合组加入10 μg/mL脂多糖+1 μg/mL茶多酚。采用MTT法检测细胞增殖情况，碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性，偶氮偶联法检测细胞碱性磷酸酶染色程度，钙检测试剂盒检测细胞钙沉积量，超氧化物试剂盒检测细胞超氧化物含量，丙二醛试剂盒检测细胞丙二醛含量。

结果与结论：①与对照组相比，脂多糖组成骨细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性、钙沉积量降低(P < 0.05)，碱性磷酸酶染色程度降低(P < 0.01)，超氧化物和丙二醛含量增加(P < 0.05)；茶多酚组成骨细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性、钙沉积量升高(P < 0.05)，碱性磷酸酶染色程度提高(P < 0.01)，超氧化物和丙二醛含量减少(P < 0.05)；②与脂多糖组相比，联合组成骨细胞增殖活性、钙沉积量升高(P < 0.05)，碱性磷酸酶染色程度提高(P < 0.001)，超氧化物和丙二醛含量减少(P < 0.05)；③结果表明，茶多酚可以促进成骨细胞的增殖分化，降低氧化应激因子的表达水平，逆转脂多糖对成骨细胞的不良影响。

https://orcid.org/0000-0002-5206-8016 (郭勇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 成骨细胞, 脂多糖, 茶多酚, 增殖, 成骨分化, 氧化应激

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that tea polyphenols can play anti-inflammatory and antioxidant effects in the investigation of periodontitis and other diseases.
OBJECTIVE: To investigate the effects of tea polyphenols on the proliferation, differentiation and oxidative stress of mouse osteoblasts induced by lipopolysaccharide.
METHODS: The mouse osteoblasts MC3T3-E1 were cultured in vitro, and the MC3T3-E1 cells were randomly divided into four groups, namely the control group (conventional culture), the lipopolysaccharide group (10 μg/mL lipopolysaccharide), the tea polyphenols group (1 μg/mL tea polyphenols), and the combination group (10 μg/mL lipopolysaccharide + 1 μg/mL tea polyphenols). The MTT assay was used to detect the cell proliferation. The alkaline phosphatase activity was detected by alkaline phosphatase kit. The alkaline phosphatase staining degree was detected by alkaline phosphatase azo coupling method. The calcium deposition amount of the cells was detected by calcium detection kit. The superoxide content of cells was detected by superoxide kit. The malondialdehyde content of cells was detected by malondialdehyde kit.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the proliferation activity, alkaline phosphatase activity and calcium deposition of osteoblasts were significantly decreased in the lipopolysaccharide group (P < 0.05); the staining degree of alkaline phosphatase was significantly decreased (P < 0.01); and the contents of superoxide and malondialdehyde were significantly increased (P < 0.05). The proliferation activity, alkaline phosphatase activity and calcium deposition of osteocytes in the tea polyphenols group were significantly increased (P < 0.05); the staining degree of alkaline phosphatase was significantly increased (P < 0.01); and the contents of superoxide and malondialdehyde were significantly decreased (P < 0.05). (2) Compared with the lipopolysaccharide group, the proliferation activity and calcium deposition of bone cells in the combination group were significantly increased (P < 0.05); the staining degree of alkaline phosphatase was significantly increased (P < 0.001); and the contents of superoxide and malondialdehyde were significantly decreased (P < 0.05). (3) The results showed that tea polyphenols can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts, reduce the expression levels of oxidative stress factors, and reverse the adverse effects of lipopolysaccharides on osteoblasts.

Key words: osteoblast, lipopolysaccharide, tea polyphenols, proliferation, osteogenic differentiation, oxidative stress

中图分类号:

秦祎雄, 袁子健, 谢山周, 祝英文, 陈明慧, 韩标, 郭勇. 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5665-5669.

Qin Yixiong, Yuan Zijian, Xie Shanzhou, Zhu Yingwen, Chen Minghui, Han Biao, Guo Yong. Effect of tea polyphenols on proliferation and differentiation of osteoblasts stimulated by lipopolysaccharide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5665-5669.

图/表（结果） 6

2.1 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞增殖的影响 MTT实验的吸光度值反映细胞增殖活性水平，活性越高吸光度值越大。培养1，3，4 d时，脂多糖组细胞增殖吸光度值低于对照组(P < 0.05)；培养1，2，3，4 d时，茶多酚组细胞增殖吸光度值高于对照组(P < 0.05)，联合组细胞增殖吸光度值高于脂多糖组(P < 0.01)，见图1，说明脂多糖明显抑制成骨细胞的增殖，茶多酚明显提高了成骨细胞的增殖活性，脂多糖对此成骨细胞增殖的抑制作用被茶多酚有效逆转。

2.2 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响碱性磷酸酶活性能反映成骨分化水平，碱性磷酸酶活性越高成骨分化水平越高。培养3 d时，茶多酚组细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)；培养6 d时，脂多糖组细胞碱性磷酸酶活性低于对照组(P < 0.05)，茶多酚组细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)，见图2，说明茶多酚能提高成骨细胞成骨分化水平，脂多糖明显抑制成骨细胞成骨分化
水平。

2.3 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞碱性磷酸酶染色的影响碱性磷酸酶染色程度能反映成骨分化水平，染色程度越深细胞成骨分化水平越高。与对照组相比，脂多糖组碱性磷酸酶染色程度(阳性程度)更低，碱性磷酸酶相对含量下降了60%(P < 0.01)；与对照组相比，茶多酚组碱性磷酸酶染色程度更高，碱性磷酸酶相对含量上升了38%(P < 0.01)；与脂多糖组相比，联合组明显提高了碱性磷酸酶染色程度，恢复到对照组水平(P < 0.001)，见图3，说明脂多糖明显抑制了成骨细胞的成骨分化水平，茶多酚明显提高了成骨细胞的成骨分化水平，茶多酚能有效逆转脂多糖对成骨细胞成骨分化的不良影响。

2.4 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞钙沉积量的影响钙沉积量反映了细胞成骨分化水平，钙沉积量越多成骨分化水平越高。与对照组相比，脂多糖组细胞钙沉积量降低了50%(P < 0.05)，茶多酚组细胞钙沉积量提高了12%(P < 0.05)；与脂多糖组相比，联合组细胞钙沉积量增加了37%(P < 0.01)，见图4，说明脂多糖明显抑制了成骨细胞的成骨分化水平，茶多酚明显提高了成骨细胞的成骨分化水平，茶多酚能有效逆转脂多糖对成骨细胞成骨分化的抑制作用。

2.5 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞超氧化物含量的影响超氧化物含量反映了细胞氧化应激水平，超氧化物含量越高细胞氧化应激水平越高。与对照组相比，脂多糖组细胞内超氧化物含量提升了30%(P < 0.05)，茶多酚组细胞内超氧化物含量降低了40%(P < 0.05)；与脂多糖组相比，联合组细胞内超氧化物含量降低了57%(P < 0.01)，见图5，说明脂多糖明显提高了细胞内氧化应激水平，茶多酚明显降低了细胞内氧化应激水平，茶多酚可以有效减少脂多糖诱导的氧化应激反应。

2.6 茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞丙二醛含量的影响丙二醛是过氧化反应产物，能反映细胞氧化应激水平，丙二醛含量越多细胞的过氧化反应就越多，氧化应激水平也就越高。与对照组相比，脂多糖组细胞内丙二醛含量增加了35%(P < 0.05)，茶多酚组细胞内丙二醛含量下降了20%(P < 0.05)；与脂多糖组相比，联合组细胞内丙二醛含量下降了32%(P < 0.01)，见图6，说明脂多糖明显提高了细胞的氧化应激水平，茶多酚明显降低了细胞的氧化应激水平，茶多酚能有效减少脂多糖诱导的氧化应激反应。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，组间差异比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2021年5月在桂林医学院智能医学与生物技术学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞小鼠颅骨前顶细胞MC3T3-E1购自上海通派生物科技有限公司。
1.3.2 主要试剂及仪器茶多酚(克鲁尼，中国)；脂多糖(索莱宝，中国)；MTT细胞增殖检测试剂盒(蓝季，中国)；碱性磷酸酶活性检测试剂盒、丙二醛测定试剂盒、钙检测定剂盒(南京建成生物工程所，中国)；DMEM培养基(赛默飞世尔，中国)；胎牛血清(Gemini，美国)；酶标仪(BIO-RAD，美国)；超氧化物测定试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养复苏小鼠颅骨前顶细胞MC3T3-E1，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，每2 d换液一次，显微镜下观察细胞的生长情况，选择生长状态良好的细胞，待细胞长满后进行实验。
1.4.2 实验分组处理取MC3T3-E1细胞，分组4组处理：对照组加入含体积分数10%胎牛血清、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM 培养液(检测细胞增殖实验中，培养液未加维生素C和β-甘油磷酸钠)；脂多糖组加入含10 μg/mL脂多糖、体积分数10%胎牛血清、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养液；茶多酚组加入1 μg/mL茶多酚、体积分数10%胎牛血清、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养液，联合组加入含10 μg/mL脂多糖、1 μg/mL茶多酚、体积分数10%胎牛血清、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养液。
1.4.3 MTT法检测细胞增殖状态将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，经胰酶消化后离心、重悬，以5×103/孔的密度接种至96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2养箱中培养24 h。随后按实验分组要求加入对应试剂，培养1，2，3，4 d后，采用MTT试剂盒检测细胞增殖活性，用酶标仪在490 nm处检测每孔的吸光度值，并记录实验数据。
1.4.4 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测将MC3T3-E1细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后，弃去原有培养基，PBS清洗2次，按实验分组要求加入对应试剂继续培养。培养3，6 d后，取上清液，1 000 r/min离心10 min，采用碱性磷酸酶试剂盒进行碱性磷酸酶活性检测。
1.4.5 成骨细胞碱性磷酸酶染色将细MC3T3-E1胞以1×105/孔的密度接种于6孔板，培养24 h后，弃去原有培养基，PBS清洗2次，按实验分组要求加入药物和培养液对应试剂继续培养。培养6 d后，使用碱性磷酸酯酶染色试剂盒进行细胞化学染色。
1.4.6 成骨细胞钙沉积检测将MC3T3-E1细胞以2×104/孔的密度接种于24孔板，培养24 h后，弃去原有培养基，PBS清洗2次，按实验分组要求加入对应试剂培养10 d，弃去培养液，D-hanks液体(无钙镁离子)清洗2次，每个培养孔加入0.8 mL的HCl溶液(0.1 mol/L)，室温下孵育24 h，期间反复吹打，然后收集裂解液，4 000 r/min离心30 min，取上清，采用钙检测试剂盒检测上清中的钙含量。
1.4.7 成骨细胞超氧化物检测将MC3T3-E1细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板，培养24 h后按实验分组要求用对应试剂处理48 h，弃去细胞培养液，采用超氧化物检测试剂盒检测细胞内的超氧化物含量。
1.4.8 成骨细胞丙二醛浓度检测将MC3T3-E1细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板，培养24 h后按实验分组要求加入对应试剂，继续培养48 h，弃去原有培养基，PBS清洗2次，冰上充分裂解5 min，14 500 r/min离心5 min，取上清，采用BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度测定，采用丙二醛试剂盒检测蛋白样品的丙二醛浓度。
1.5 主要观察指标各组成骨细胞的增殖活性、碱性磷酸酶活性、碱性磷酸酶染色、钙沉积量、超氧化物及丙二醛含量检测结果。
1.6 统计学分析采用Graph Pad Prism 7软件进行数据处理与绘图分析。数据以 x±s表示。组间差异比较采用单因素方差分析，以P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经桂林医学院生物统计学专家审核。

讨论

骨髓炎、骨关节炎等炎症性骨疾病的病因是由细菌感染引起的骨生成减少和骨吸收增多的骨破坏[16]，其治疗方法比较局限，通常使用抗生素进行治疗，容易产生耐药性[17-18]。成骨细胞是骨形成的重要功能细胞，通常情况下，成骨细胞诱导的骨形成速率与破骨细胞的骨吸收速率维持平衡，通过细胞相互作用保持成骨细胞和破骨细胞的细胞数量和功能正常[19-20]。但是，持续的炎症刺激和氧化应激反应会打破这种平衡[21]。脂多糖是革兰阴性细菌主要的致病成分，可诱发一系列的炎症反应，并通过诱导成骨细胞凋亡、抑制成骨细胞增殖和分化来促进破骨细胞的生成[22-23]。有研究发现，脂多糖可以在体外抑制成骨因子诱导的MC3T3-E1细胞分化水平，降低成骨细胞碱性磷酸酶水平，减少钙沉积量[24]。刘子歌等[6]研究发现，脂多糖会降低成骨细胞标志物基因的表达水平，从分子水平上证实了脂多糖对成骨细胞分化的抑制作用。WANG等[25]的研究发现，脂多糖诱导的骨丢失小鼠成骨细胞数量和骨形成减少，从动物水平上证实了脂多糖对成骨分化的抑制作用，其机制可能是脂多糖引起的氧化应激诱导成骨细胞焦亡，导致成骨功能障碍[26]。
氧化应激在骨质疏松症和骨形成受损的发病机制中起重要作用，已有研究发现活性氧与骨质疏松等疾病密切相关[27]。活性氧是细胞呼吸代谢过程中产生的一类含有超氧离子化学物的总称，化学性质活泼，能刺激巨噬细胞集落刺激因子和核因子KB受体活化因子配体的表达，增加核因子KB受体活化因子配体/骨保护素比值，导致骨吸收增加和骨量减少[22]。ZHAO等[28]的研究发现，炎症引起的氧化应激增强了活性氧的产生/积累，激活了ERK信号转导通路，破坏成骨细胞的细胞活力和成骨作用，最终导致细胞损伤和功能障碍。自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，所以丙二醛含量能反映脂质过氧化程度，间接反映细胞受氧自由基攻击程度[29]。
有研究发现，脂多糖介导的炎症环境是通过BMP/MAPK和Smad信号之间的串扰抑制基质金属蛋白酶9诱导的成骨分化，脂多糖可以通过刺激促炎细胞因子的产生来抑制成骨细胞分化并诱导骨丢失[30]。CHEN等[31]的研究发现，在脂多糖诱导的炎症环境中激活核因子κB信号可以抑制人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化。GUO等[32]的研究发现，脂多糖可以通过JNK通路诱导成骨细胞凋亡并抑制成骨细胞分化，或者通过MAPK和Wnt/β-Catenin通路抑制成骨分化[33-34]。
茶多酚近年来日益受到学者关注，它是一种从茶叶中分离提纯的新型抗氧化剂，对多种细菌均有较强的抑制作用，还具有较强的抗炎和抑制炎症反应的作用[35]。茶多酚可抵消由骨质疏松症引起的成骨细胞生成和破骨细胞生成失衡的有害影响[14，36]。有研究表明，茶多酚对MAPK、核因子κB、Wnt/β-连环蛋白和骨形态发生蛋白 2/SMAD信号通路都有一定作用，从而导致对骨重建的影响[35]。此外，茶多酚还可作为人造骨材料的表面修饰分子，在骨组织工程领域被广泛应用[14]。
此次实验创新性地使用茶多酚这种天然产物，探究其是否能逆转脂多糖诱导对成骨细胞的不良影响。实验结果发现，10 μg/mL的脂多糖具有抑制成骨细胞增殖以及碱性磷酸酶活性的作用，而给予茶多酚处理后，脂多糖+茶多酚组细胞的增殖活性明显高于脂多糖组，提示1 μg/mL茶多酚逆转了脂多糖对成骨细胞增殖的抑制作用，并在一定程度上促进了成骨细胞的增殖活性碱性磷酸酶活性，这与谢睿锋等[37]研究结果类似，发现了10 μmol/L与20 μmol/L的茶多酚对体外培养的成骨细胞有明显促增殖作用。脂多糖组细胞的碱性磷酸酶染色程度和钙沉积量明显下降，即脂多糖显著抑制了MC3T3-E1细胞的成骨分化，与OCHI等[38]研究结果类似。当使用茶多酚处理后，脂多糖+茶多酚组成骨细胞的碱性磷酸酶染色程度、钙沉积量明显上升，表明1 μg/mL茶多酚能逆转脂多糖对细胞成骨分化造成的抑制作用，但与对照组相比，茶多酚并未在逆转这种抑制作用的基础上促进细胞的成骨分化。与对照组相比，脂多糖组细胞中的超氧化物与丙二醛含量显著提高，成骨细胞清除氧自由基能力下降，受氧自由基攻击的严重程度加深；但当给予茶多酚处理后，脂多糖+茶多酚组细胞的超氧化物、丙二醛浓度显著低于脂多糖组，提示1 μg/mL茶多酚能有效减少脂多糖诱导的氧化应激反应。
综上所述，此次实验结果表明，茶多酚能逆转脂多糖对MC3T3-E1细胞增殖分化造成的抑制作用，促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，还能减少脂多糖诱导的氧化应激反应，推测作用机制可能与核因子κB、BMP/MAPK和Wnt/β-Catenin等信号通路有关，相关机制有待进一步深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

茶多酚对脂多糖刺激下成骨细胞增殖分化的影响

Effect of tea polyphenols on proliferation and differentiation of osteoblasts stimulated by lipopolysaccharide

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