敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡

doi:10.12307/2024.323

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (4): 499-504.doi: 10.12307/2024.323

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡

申飞燕1，姚吉祥2，苏珊珊2，赵忠民2，唐巍东3

1长春中医药大学中西医结合学院，吉林省长春市 130000；2泰州市人民医院疼痛科，江苏省泰州市 225300；3江苏省钟山康复医院，江苏省南京市 210014

收稿日期:2023-03-11 接受日期:2023-05-19 出版日期:2024-02-08 发布日期:2023-07-13
通讯作者: 赵忠民，博士，副主任医师，泰州市人民医院疼痛科，江苏省泰州市 225300
作者简介:申飞燕，女，1995年生，河南省汝阳县人，汉族，2023年长春中医药大学毕业，硕士，主要从事中西医结合临床骨科疾病研究。
基金资助:
江苏省干部保健科研课题(BJ18038)，项目负责人：唐巍东

Knockdown of circRNA WD repeat containing protein 1 inhibits proliferation and induces apoptosis of chondrocytes in knee osteoarthritis

Shen Feiyan1, Yao Jixiang2, Su Shanshan2, Zhao Zhongmin2, Tang Weidong3

1College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130000, Jilin Province, China; 2Department of Pain, Taizhou People’s Hospital, Taizhou 225300, Jiangsu Province, China; 3Jiangsu Zhongshan Rehabilitation Hospital, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China

Received:2023-03-11 Accepted:2023-05-19 Online:2024-02-08 Published:2023-07-13
Contact: Zhao Zhongmin, MD, Associate chief physician, Department of Pain, Taizhou People’s Hospital, Taizhou 225300, Jiangsu Province, China
About author:Shen Feiyang, Master, College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130000, Jilin Province, China
Supported by:
Jiangsu Cadre Health Research Project, No. BJ18038 (to TWD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

环状RNA (circRNA)：是一类特殊的非编码RNA分子，也是近年非编码RNA领域研究的热点和重点；其在真核生物内广泛表达，circRNA环状共价闭合结构，没有5′帽子结构和3′polyA尾巴，是反向间接形成，不受RNA外切酶影响，稳定性良好，且大多数circRNA位于细胞质。
miRNA：是一种内源性非编码RNA分子，由22-25个核苷酸组成的小分子RNA，circRNA可与miRNA竞争结合，并充当miRNA海绵，进而解除miRNA下游靶基因mRNA表达抑制作用，针对以上作用机制称为竞争性内源RNA机制。近年研究已证实，circRNA/miRNA/mRNA轴在多种疾病、恶性肿瘤中发挥着重要调控作用。

背景：环状RNA(circular RNA，circRNA)在多种疾病或肿瘤中发挥着重要作用，近年研究结果发现，膝骨关节炎中circRNA失常表达，并可通过调控微小RNA(miRNA)/mRNA参与疾病进展。

目的：探究circ-BRWD1/miR-488-3p/DNMT3A对膝骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响。
方法：实时荧光定量PCR检测膝骨关节炎软骨细胞miR-488-3p、circ-BRWD1、DNMT3A表达。将细胞分为si-NC组、si-circ-BRWD1组、si-circ-BRWD1+anti-miR-NC组、si-circ-BRWD1+anti-miR-488-3p组、vector组、circ-BRWD1组、miR-NC组、miR-488-3p组、miR-488-3p+vector组、miR-488-3p+DNMT3A组、anti-miR-NC组、anti-miR-488-3p组；实时荧光定量PCR检测circ-BRWD1、miR-488-3p、DNMT3A表达，MTT、流式细胞术检测增殖和凋亡，Western blot检测DNMT3A、增殖、凋亡相关蛋白表达；双荧光素酶报告实验检测circ-BRWD1与miR-488-3p、miR-488-3p与DNMT3A的靶向关系。
结果与结论：①与正常软骨细胞相比，circ-BRWD1、DNMT3A在膝骨关节炎软骨细胞中高表达，miR-488-3p低表达；②敲低circ-BRWD1或过表达miR-488-3p可抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡；③circ-BRWD1靶向负调控miR-488-3p，抑制miR-488-3p可逆转敲低

circ-BRWD1对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响；④miR-488-3p靶向负调控DNMT3A，上调DNMT3A可逆转过表达miR-488-3p对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响；⑤circ-BRWD1可通过调控miR-488-3p进而调控DNMT3A的表达；⑥结果表明，敲低circ-BRWD1可抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡，其作用机制可能与调控miR-488-3p/DNMT3A轴有关。

https://orcid.org/0009-0006-9400-859X(申飞燕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: circ-BRWD1, miR-488-3p, DNMT3A, 膝骨关节炎, 软骨细胞, 增殖, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Circular RNAs (circRNAs) play important roles in a variety of diseases or tumors, and recent findings have revealed that circRNAs are abnormally expressed in knee osteoarthritis and are involved in disease progression through microRNA/mRNA regulation.
OBJECTIVE: To investigate the effect of circRNA WD repeat containing protein 1 (circ-BRWD1)/miR-488-3p/DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) on the proliferation and apoptosis of chondrocytes in knee osteoarthritis.
METHODS: Real-time fluorescence quantitative PCR was performed to detect the expression of circ-BRWD1, miR-488-3p, DNMT3A in knee osteoarthritis chondrocytes. Cells were divided into si-NC group, si-circ-BRWD1 group, vector group, circ-BRWD1 group, si-circ-BRWD1+anti-miR-NC group, si-circ-BRWD1+anti-miR-488-3p group, miR-NC group, miR-488-3p group, anti-miR-NC group, anti-miR-488-3p group, miR-488-3p+vector group, miR 488-3p+DNMT3A group. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect circ-BRWD1, miR-488-3p, DNMT3A expression, MTT and flow cytometry assay were used to detect cell proliferation and apoptosis. Western blot assay was used to detect DNMT3A and proliferation/apoptosis-related protein expression. Dual luciferase reporter assay was used to Dual luciferase reporter assay to detect the targeting relationship of circ-BRWD1 with miR-488-3p and miR-488-3p with DNMT3A.
RESULTS AND CONCLUSION: circ-BRWD1 and DNMT3A were highly expressed and miR-488-3p was lowly expressed in knee osteoarthritis chondrocytes compared with normal chondrocytes. Knockdown of circ-BRWD1 or overexpression of miR-488-3p inhibited proliferation and induced apoptosis in knee osteoarthritis chondrocytes. circ-BRWD1 targeted negative regulation of miR-488-3p and inhibition of miR-488-3p reversed the effect of circ-BRWD1 knockdown on chondrocyte proliferation and apoptosis in knee osteoarthritis. miR-488-3p targeted negative regulation of DNMT3A and upregulation of DNMT3A reversed the effect of miR-488-3p overexpression on chondrocyte proliferation and apoptosis in knee osteoarthritis. circ-BRWD1 could regulate the expression of DNMT3A by regulating miR-488-3p. To conclude, knockdown of circ-BRWD1 inhibits chondrocyte proliferation and induces apoptosis in knee osteoarthritis, and the mechanism of action may be related to the regulation of miR-488-3p/DNMT3A axis.

Key words: circ-BRWD1, miR-488-3p, DNMT3A, knee osteoarthritis, chondrocyte, proliferation, apoptosis

中图分类号:

申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.

Shen Feiyan, Yao Jixiang, Su Shanshan, Zhao Zhongmin, Tang Weidong. Knockdown of circRNA WD repeat containing protein 1 inhibits proliferation and induces apoptosis of chondrocytes in knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(4): 499-504.

图/表（结果） 6

2.1 circ-BRWD1、miR-488-3p、DNMT3A在膝骨关节炎软骨细胞中表达与正常软骨细胞相比，膝骨关节炎软骨细胞中circ-BRWD1表达水平、DNMT3A mRNA和蛋白表达水平显著增加(P < 0.05)，miR-488-3p表达水平显著降低(P < 0.05)。见图1。

2.2 circ-BRWD1靶向调控miR-488-3p 在线数据预测显示circ-BRWD1与miR-488-3p间存在互补结合位点，见图2A；与miR-NC组相比，miR-488-3p组WT circ-BRWD1荧光素酶活性显著降低(P < 0.05)，MUT circ-BRWD1荧光素酶无明显差异，见图2B；与vector组相比，circ-BRWD1组中circ-BRWD1表达水平显著增加(P < 0.05)，miR-488-3p表达水平显著降低(P < 0.05)，见图2C，D。

2.3 抑制miR-488-3p可逆转敲低circ-BRWD1对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响与si-NC组相比，si-circ-BRWD1组miR-488-3p表达水平、凋亡率、Bax蛋白表达显著增加(P < 0.05)，细胞增殖活性、增殖细胞核抗原及Bcl-2蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与si-circ-BRWD1+anti-miR-NC组相比，si-circ-BRWD1+anti-miR-488-3p组miR-488-3p表达水平、凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(P < 0.05)，细胞增殖活性、增殖细胞核抗原及Bcl-2蛋白表达显著增加(P < 0.05)。见图3。

2.4 miR-488-3p靶向调控DNMT3A 在线数据预测显示DNMT3A与miR-488-3p间存在互补结合位点，见图4A；与miR-NC组相比，miR-488-3p组WT DNMT3A荧光素酶活性显著降低(P < 0.05)，MUT DNMT3A荧光素酶无明显差异，见图4B；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-488-3p组中miR-488-3p表达水平显著降低(P < 0.05)，DNMT3A mRNA和蛋白表达水平显著增加(P < 0.05)，见图4C，D。

2.5 上调DNMT3A可逆转过表达miR-488-3p对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响与miR-NC组相比，miR-488-3p组凋亡率、Bax蛋白表达显著增加(P < 0.05)，细胞增殖活性、DNMT3A mRNA和蛋白表达、增殖细胞核抗原及Bcl-2蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与miR-488-3p+vector组相比，miR-488-3p+DNMT3A组凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(P < 0.05)，细胞增殖活性、DNMT3A mRNA和蛋白表达、增殖细胞核抗原及Bcl-2蛋白表达显著增加(P < 0.05)。见图5。

2.6 circ-BRWD1可通过调控miR-488-3p进而调控DNMT3A的表达与si-NC组相比，si-circ-BRWD1组DNMT3A mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与si-circ-BRWD1+anti-miR-NC组相比，si-circ-BRWD1+anti-miR-488-3p组DNMT3A mRNA和蛋白表达显著增加(P < 0.05)。见图6。

参考文献

[1] PRIMORAC D, MOLNAR V, ROD E, et al. Knee osteoarthritis: a review of pathogenesis and state-of-the-art non-operative therapeutic considerations. Genes (Basel). 2020;11(8):854.
[2] LIU C, GAO J, SU G, et al. MicroRNA-1202 plays a vital role in osteoarthritis via KCNQ1OT1 has-miR-1202-ETS1 regulatory pathway. J Orthop Surg Res. 2020;15(1):130.
[3] 张涛,马书杰,叶斌,等.基于网络药理学和分子对接研究牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的作用机制[J].中成药,2022,44(7):2369-2374.
[4] WU X, BIAN B, LIN Z, et al. Identification of exosomal mRNA, lncRNA and circRNA signatures in an osteoarthritis synovial fluid-exosomal study. Exp Cell Res. 2022;410(1):112881.
[5] GUO Z, WANG H, ZHAO F, et al. Exosomal circ-BRWD1 contributes to osteoarthritis development through the modulation of miR-1277/TRAF6 axis. Arthritis Res Ther. 2021;23(1):159.
[6] LI Y, LI S, LUO Y, et al. LncRNA PVT1 regulates chondrocyte apoptosis in osteoarthritis by acting as a sponge for miR-488-3p. DNA Cell Biol. 2017; 36(7):571-580.
[7] WU J, TAO Y, SHANG A, et al. Effect of the interaction between MiR-200b-3p and DNMT3A on cartilage cells of osteoarthritis patients. J Cell Mol Med. 2017;21(10):2308-2316.
[8] 李远栋,杨琨,王平,等.中药基于Wnt/β-catenin信号通路治疗膝骨性关节炎的研究进展[J].中草药,2021,52(21):6717-6723.
[9] JANG S, LEE K, JU JH. Recent updates of diagnosis, pathophysiology, and treatment on osteoarthritis of the knee. Int J Mol Sci. 2021;22(5):2619.
[10] HE L, HE T, XING J, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes protect cartilage damage and relieve knee osteoarthritis pain in a rat model of osteoarthritis. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):276.
[11] HUANG W, WU Y, QIAO M, et al. CircRNA-miRNA networks in regulating bone disease. J Cell Physiol. 2022;237(2):1225-1244.
[12] ZHOU X, LI J, ZHOU Y, et al. Down-regulated ciRS-7/up-regulated miR-7 axis aggravated cartilage degradation and autophagy defection by PI3K/AKT/mTOR activation mediated by IL-17A in osteoarthritis. Aging (Albany NY). 2020;12(20):20163-20183.
[13] WU Y, HONG Z, XU W, et al. Circular RNA circPDE4D protects against osteoarthritis by binding to miR-103a-3p and regulating FGF18. Mol Ther. 2021;29(1):308-323.
[14] HUANG Z, MA W, XIAO J, et al. CircRNA_0092516 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis in osteoarthritis through the miR-337-3p/PTEN axis. J Biochem. 2021;169(4):467-475.
[15] LI H, LIU Z, GUO X, et al. Circ_0128846/miR-140-3p/JAK2 network in osteoarthritis development. Immunol Invest. 2022;51(6):1529-1547.
[16] ZHANG L, SUI C, ZHANG Y, et al. Knockdown of hsa_circ_0134111 alleviates the symptom of osteoarthritis via sponging microRNA-224-5p. Cell Cycle. 2021;20(11):1052-1066.
[17] PAN W, WANG H, RUAN J, et al. lncRNA myocardial infarction-associated transcript (MIAT) knockdown alleviates LPS-induced chondrocytes inflammatory injury via regulating miR-488-3p/sex determining region Y-related HMG-box 11 (SOX11) axis. Open Life Sci. 2021;16(1):511-522.
[18] HUANG PY, WU JG, GU J, et al. Bioinformatics analysis of miRNA and mRNA expression profiles to reveal the key miRNAs and genes in osteoarthritis.J Orthop Surg Res. 2021;16(1):63.
[19] ZHOU X, ZHANG Y, HOU M, et al. Melatonin prevents cartilage degradation in early-stage osteoarthritis through activation of miR-146a/NRF2/HO-1 axis. J Bone Miner Res. 2022;37(5):1056-1072.
[20] ZHANG H, CHEN C, SONG J. microRNA-4701-5p protects against interleukin-1β induced human chondrocyte CHON-001 cells injury via modulating HMGA1. J Orthop Surg Res. 2022;17(1):246.
[21] LU H, YANG Y, OU S, et al. miRNA-382-5p carried by extracellular vesicles in osteoarthritis reduces cell viability and proliferation, and promotes cell apoptosis by targeting PTEN. DNA Cell Biol. 2022;41(12):1012-1025.
[22] HORMAECHEA-AGULLA D, MATATALL KA, LE DT, et al. Chronic infection drives Dnmt3a-loss-of-function clonal hematopoiesis via IFNγ signaling. Cell Stem Cell. 2021;28(8):1428-1442.e6.
[23] DURA M, TEISSANDIER A, ARMAND M, et al. DNMT3A-dependent DNA methylation is required for spermatogonial stem cells to commit to spermatogenesis. Nat Genet. 2022;54(4):469-480.
[24] MIAO J, ZHAO C, TANG K, et al. TDG suppresses the migration and invasion of human colon cancer cells via the DNMT3A/TIMP2 axis. Int J Biol Sci. 2022;18(6):2527-2539.
[25] GU W, SHI Z, SONG G, et al. MicroRNA-199-3p up-regulation enhances chondrocyte proliferation and inhibits apoptosis in knee osteoarthritis via DNMT3A repression. Inflamm Res. 2021;70(2):171-182.

引言

材料方法

1.1 设计随机体外细胞实验，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年1月在泰州市人民医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 组织标本选择泰州市人民医院2020年9月至2022年9 月收治的20 例半月板损伤(正常对照)和20 例膝骨关节炎患者，其中半月板损伤患者男14 例，女6 例，平均年龄(58.72±8.15) 岁；膝骨关节炎患者男13 例，女7 例，平均年龄(60.32±10.11) 岁。将所有患者膝关节样本组织置于液氮中保存，于-80 ℃冰箱冻存。
纳入标准：年龄均为20-78 岁；膝骨关节炎经病理诊断确诊。
排除标准：既往存在关节外科及其他关节炎疾病；恶性肿瘤；其他代谢性疾病。
此次研究经泰州市人民医院医学伦理委员会批准(医院伦理批件号：TRY202209096，审批时间：2022-09-11)，所有受试者均知情同意并自愿参与此次研究。
1.3.2 主要试剂胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM/F12培养液、Ⅱ型胶原酶、高糖DMEM培养液购于北京百奥创新科技有限公司；MTT及凋亡试剂盒购于上海碧云天公司；Lipofectamine 3000试剂盒、双荧光素酶试剂盒、BCA试剂盒、ECL试剂购于北京索莱宝公司；细胞序列及引物由上海吉玛公司设计合成；Trizol试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于日本TaKaKa公司；Bcl-2抗体、DNMT3A抗体、增殖细胞核抗原抗体、Bax抗体、GAPDH抗体及二抗购于Abcam公司。
1.4 方法

1.4.1 细胞分离、培养将半月板损伤、膝骨关节炎患者软骨组织用PBS冲洗干净，去除中心软骨，使用无菌剪剪成1 mm3组织块，在组织块中加入含0.25%胰蛋白酶、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液(含1%青-链霉素)消化30 min，加入含0.2%Ⅱ型胶原酶、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液(含1%青-链霉素)培养16 h，3 000 r/min离心5 min弃上清液，PBS洗涤3 遍，经200 目过筛，即原代软骨细胞。将细胞培养在含有体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的高糖DMEM/F12培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养，细胞融合度达到90%进行消化传代培养。实验设置3 个复孔，进行3 次重复。

1.4.2 细胞转染和分组收集生长良好的膝骨关节炎软骨细胞接种6 孔板中，每孔细胞数1×105 个，按照Lipofectamine 3000试剂盒操作进行转染，将抑制物对照si-NC、circ-BRWD1抑制物si-circ-BRWD1、过表达对照miR-NC、miR-488-3p模拟物miR-488-3p转染至细胞中，记为si-NC组、si-circ-BRWD1组、miR-NC组、miR-488-3p组；将si-circ-BRWD1与miR-NC抑制物对照anti-miR-NC、si-circ-BRWD1与miR-488-3p抑制物anti-miR-488-3p、miR-488-3p与空载体vector、miR-488-3p与DNMT3A过表达DNMT3A共转染细胞中，记为si-circ-BRWD1+anti-miR-NC组、si-circ-BRWD1+anti-miR-488-3p组、miR-488-3p+vector组、miR-488-3p+DNMT3A组。细胞转染12 h后更换细胞液，继续培养48 h收集细胞进行实验。

1.4.3 实时荧光定量PCR 收集半月板损伤、膝骨关节炎患者软骨细胞及1.4.2中各组软骨细胞，使用Trizol试剂提取细胞中总RNA；利用反转录试剂盒进行cDNA合成，最后参照荧光定量试剂盒进行扩增，采用2-ΔΔCt方法计算circ-BRWD1、miR-488-3p、DNMT3A mRNA表达水平，分别以GAPDH、U6作为内参，具体引物序列见表1。

1.4.4 MTT实验收集1.4.2各组细胞，以2×103 个/孔接种96 孔板中，培养至48 h后每孔中加20 μL MTT试剂，培养4 h后弃上清，每孔加150 μL二甲基亚砜，结晶溶解后置于酶标仪490 nm处检测吸光度值，并计算细胞增殖活性。
1.4.5 流式细胞术实验收集1.4.2各组细胞并用预冷PBS冲洗3 遍，使用1×Binding buffer重悬细胞，加膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素、碘化丙啶各5 μL，遮光反应10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.4.6 Western blot法将RIPA裂解液加入1.4.2各组细胞中，用于提取细胞用蛋白，用BCA试剂盒进行定量检查，加入蛋白缓冲液煮沸变性5 min，以35 μg/孔加蛋白样品，经SDS-PAGE
电泳处理，转移至PVDF膜，封闭培养2 h，加兔抗DNMT3A (1∶800)、增殖细胞核抗原(1∶800)、Bcl-2 (1∶800)、Bax (1∶800)及内参GAPDH (1∶1 500)，4 ℃过夜孵育24 h，加二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，滴加ECL显色、显影。采用Image J 软件检测各条带灰度值。
1.4.7 双荧光素酶报告实验经starbase预测显示circ-BRWD1与miR-488-3p、miR-488-3p与DNMT3A之间存在结合位点，并构建含有miR-488-3p结合序列的circ-BRWD1、DNMT3A，将结合位点、突变位点序列克隆至pGL3质粒上获得circ-BRWD1、DNMT3A野生型载体(WT circ-BRWD1、WT DNMT3A)、突变型载体(MUT circ-BRWD1、MUT DNMT3A)，分别与miR-NC或miR-488-3p共转染至膝骨关节炎软骨细胞，培养48 h经双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性。
将vector、circ-BRWD1、anti-miR-NC、anti-miR-488-3p转染至膝骨关节炎软骨细胞中，采用实时荧光定量PCR检测circ-BRWD1、miR-488-3p、DNMT3A mRNA表达水平，Western blot法检测DNMT3A mRNA蛋白表达。
1.5 主要观察指标膝骨关节炎软骨细胞中circ-BRWD1、miR-488-3p、DNMT3A表达水平；MTT、流式细胞术、Western blot法检测各组细胞增殖及凋亡情况；双荧光素酶报告实验验证circ-BRWD1与miR-488-3p、miR-488-3p与DNMT3A靶向关系。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 8.0分析数据和绘图，以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

膝骨关节炎是临床常见的一种慢性关节疾病，临床主要表现为关节肿胀、疼痛、僵硬、畸形或活动障碍等，严重影响患者日常活动能力、生活质量，若治疗不及时，还可能引起患者下肢功能障碍，不利患者身体健康[8]。膝骨关节炎软骨细胞对维持关节软骨完整性具有重要作用，研究发现患者软骨细胞异常增殖分化，可导致基质酶或细胞外基质丢失，可明显降低细胞活性[9-10]。
circRNA广泛存在真核生物细胞中，其可调控表观遗传和转录后基因表达，是近年分子生物学领域和医学领域的研究热点和难点，其可充当miRNA竞争性内源RNA进而参与软骨细胞增殖、凋亡及炎症反应等多种功能[11-13]。circRNA在骨关节炎中差异表达，如HUANG等[14]研究显示，circ_0092516在骨关节炎患者组织和白细胞介素1β诱导的骨关节炎软骨细胞中表达升高，体外细胞实验显示，干扰circ_0092516可有效抑制白细胞介素1β诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡并促进增殖，且circ_0092516可靶向调控miR-337-3p促进白细胞介素1β诱导的骨关节炎软骨细胞增殖和抑制凋亡，进而减轻骨关节炎的进展。LI等[15]报道称，circ_0128846在骨关节炎患者中表达上调，而在骨关节炎患者中miR-140-3表达下调，沉默circ_0128846可促进软骨细胞增殖活力，并抑制细胞凋亡和炎症反应；而抑制miR-140-3p可逆转上述沉默circ_0128846对骨关节软骨细胞增殖和凋亡的影响，提示circ_0128846可能通过调节miR-140-3p缓解骨关节炎的进展。研究显示，敲低circ_0134111可抑制细胞外基质降解和细胞凋亡，可通过靶向抑制miR-224-5p参与疾病进展[16]。先前研究结果显示，circ-BRWD1在关节炎中高表达，可能是骨关节炎的潜在作用标记物[5]。此次研究通过观察膝骨关节炎软骨细胞发现，circ-BRWD1高表达，敲低circ-BRWD1可降低细胞增殖活性、增殖细胞核抗原及Bcl-2蛋白表达，并增加凋亡率、Bax蛋白表达，提示敲低circ-BRWD1可抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡，这与HUANG等[14]的研究结果相似，进一步证实circ-BRWD1可作为膝骨关节炎的潜在作用靶点。但关于circ-BRWD1对膝骨关节炎具体分子作用的机制还不清楚。此次研究通过在线预测软件发现，circ-BRWD1与miR-488-3p存在互补核苷酸序列，双荧光素酶报告实验显示，过表达miR-488-3p可降低WT circ-BRWD1荧光素酶活性，但对MUT circ-BRWD1荧光素酶活性无差异，证实circ-BRWD1可靶向调控miR-488-3p。实时荧光定量PCR证实发现，过表达circ-BRWD1可降低miR-488-3p表达水平，增加circ-BRWD1表达水平，表示circ-BRWD1靶向负调控miR-488-3p。而miR-488-3p骨关节细胞模型低表达，过表达miR-488-3p可减轻脂多糖诱导的软骨细胞损伤，表明miR-488-3p可能参与骨关节炎发展[17]。此次研究显示，在膝骨关节炎软骨细胞miR-488-3p低表达，过表达miR-488-3p可降低膝骨关节炎软骨细胞增殖活性及增加其加凋亡率，下调增殖细胞核抗原及Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，提示过表达miR-488-3p抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖和诱导凋亡，回复实验显示，抑制miR-488-3p可逆转敲低circ-BRWD1对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的作用，表明circ-BRWD1通过靶向负调控miR-488-3p参与膝骨关节炎的发展。
越来越多的证据显示，miRNA在多种疾病中发挥着重要的作用，并可通过靶向调控下游多个靶基因mRNA表达，进而参与多种疾病发生和发展[18-19]。有报道称，miRNA/mRNA可影响关节炎软骨细胞增殖、凋亡及外基质降解等过程[20]，如miR-382-5p可能通过靶向PTEN抑制骨关节炎软骨细胞增殖活性和促进凋亡[21]。此次研究通过在线数据库预测显示，DNMT3A与miR-488-3p相互结合，且过表达miR-488-3p可降低WT DNMT3A荧光素酶活性，但对MUT DNMT3A荧光素酶活性无明显差异，提示miR-488-3p可靶向调控DNMT3A。此外，还发现抑制miR-488-3p可增加DNMT3A mRNA和蛋白表达，降低miR-488-3p表达，表明miR-488-3p可靶向负调控DNMT3A。DNMT3A是DNA甲基转移酶家族成员，主要由912 个氨基酸残基、26 个外显子和25 个内含子组成，是人染色体上染色体2p23区域，在哺乳动物生长发育过程中可介导参与表观遗传修饰过程[22]。DNMT3A可与体内多种因子相互作用，如组蛋白甲基转移酶等，DNMT3A基因突变或失常表达可影响DNA转录、新形成的甲基化，目前研究显示，DNMT3A在多种癌症、疾病中高表达，可参与细胞增殖分化、凋亡、炎症反应、迁移及侵袭等多种生物学过程，进而影响疾病和肿瘤的发生发展[23-24]。GU等[25]研究显示，在膝骨关节大鼠软骨组织中DNMT3A高表达，miR-199-3p可通过靶向调控DNMT3A促进膝骨关节软骨细胞增殖和抑制凋亡。此次研究显示，DNMT3A mRNA和蛋白表达在膝骨关节炎软骨细胞高表达，且上调DNMT3A可逆转过表达miR-488-3p对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响，提示miR-488-3p可靶向负调控DNMT3A进而参与膝骨关节炎发展。进一步发现，敲低circ-BRWD1表达可降低细胞中DNMT3A表达，抑制miR-488-3p 可增加敲低circ-BRWD1对细胞DNMT3A的表达，提示circ-BRWD1可通过调控miR-488-3p进而调控DNMT3A的表达。
综上所述，在膝骨关节炎软骨细胞中circ-BRWD1高表达，敲低circ-BRWD1可抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡，其作用机制可能与调控miR-488-3p/DNMT3A轴有关，这为膝骨关节炎研究提供了新的思路。此次研究重点倚重体外细胞功能实验，下一步探究体内动物实验，以对此次实验结果进行验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡

Knockdown of circRNA WD repeat containing protein 1 inhibits proliferation and induces apoptosis of chondrocytes in knee osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.
[2]	乔虎军, 王国祥. 白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 516-521.
[3]	吴天, 赵越, 胡蓉. 携双抗体纳米微泡对卵巢癌细胞增殖活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 341-346.
[4]	李立斯, 张成栋, 李小龙, 叶姿妤, 蒲超, 杨在君, 匙峰, 肖东琴. 双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 373-379.
[5]	冉磊, 韩海慧, 徐博, 王建业, 沈军, 肖涟波, 施杞. 补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析：动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 208-215.
[6]	左俊, 马少林. β-谷甾醇对增生性瘢痕成纤维细胞作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 216-223.
[7]	王倩, 卢子昂, 李利和, 吕超亮, 王盟, 张存鑫. 青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 224-230.
[8]	陈思敏, 胡颖俊, 闫文睿, 冀乐, 邵梦丽, 孙泽, 郑红星, 祁珊珊. 链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的构建及评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 237-241.
[9]	杨婷, 丁智斌, 江楠, 韩红霞, 侯苗苗, 马存根, 宋丽娟, 李新毅. 星形胶质细胞调节缺血性脑卒中的胶质瘢痕形成[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 131-138.
[10]	马岁录, 何志军, 刘涛, 李岩, 何元旭, 何波, 王威威, 魏晓涛. 中药单体调控“细胞自噬”防治皮瓣坏死[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 153-158.
[11]	郑嵘炅, 邓泽润, 韩丹, 孙丽华. 骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 44-49.
[12]	孙菁, 廖健, 孙江龄, 程萍, 冯红超. 重组人生长激素促进人牙髓干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 56-61.
[13]	艾芳芳, 肖红燕, 汪芳, 朱永朝, 马丽君. 枸杞多糖联合奥沙利铂可逆转结肠癌干细胞的耐药[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 74-79.
[14]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-6.
[15]	孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.